Misurare In Vivo i cambiamenti in neurotrasmettitori extracellulare durante naturalmente Premiando i comportamenti in criceti siriani femminili

Summary

Questa carta dettaglia l'uso di registrazioni di fisso-potenziale amperometrico utilizzando elettrodi in fibra di carbonio e tecnologia dei biosensori enzimatici per misurare il rilascio di dopamina e glutammato con elevata risoluzione temporale durante il naturale comportamento gratificante nella criceto femmina.

Abstract

La capacità di misurare il rilascio di neurotrasmettitore su una scala di tempi rapidi consente modelli della neurotrasmissione per essere collegati a specifici comportamenti o manipolazioni; un potente strumento nel delucidamento sottostanti meccanismi e circuiti. Mentre la tecnica della microdialisi è stata utilizzata per decenni per misurare quasi qualsiasi analita di interesse nel cervello, questa tecnica è limitata nella risoluzione temporale. In alternativa, voltammetria ciclica scansione veloce è sia temporalmente preciso ed estremamente sensibile; Tuttavia, poiché questo metodo tecnicamente difficile si basa sull'electroactivity dell'analita di interesse, è eliminata la possibilità di rilevare sostanze nonelectroactive (ad es., il glutammato, un neurotrasmettitore). Questo documento descrive in dettaglio l'utilizzo di un sistema di chiavi che unisce potenziale fisso amperometria e biosensori enzimatici per misurare sia elettroattivi e nonelectroactive neurotrasmettitori con precisione temporale. L'abbinamento di questi due potenti tecniche consente la misurazione di tonico e fasico neurotrasmissione con relativa facilità e permette di registrare dei neurotrasmettitori multipli contemporaneamente. Lo scopo di questo manoscritto è per illustrare il processo di misurazione della dopamina e glutammato neurotrasmissione in vivo mediante un comportamento naturalmente gratificante (cioè, comportamento sessuale) in criceti femminile, con l'obiettivo finale di visualizzare il fattibilità tecnica di questo test per l'esame di altri comportamenti e paradigmi sperimentali.

Introduction

La capacità di misurare il rilascio di neurotrasmettitori in animali svegli comportamento permette ai ricercatori di collegare comportamenti specifici con i modelli spaziali e temporali di neurotrasmissione-un potente strumento per indagare i meccanismi e circuiteria sottostante sia naturale e comportamenti operanti in tempo reale. Storicamente, il microdialysis è stato impiegato per misurare sostanze sia elettricamente reattivi e non reattivi nell'ambiente extracellulare del cervello¹. Questa tecnica utilizza un flusso continuo di una soluzione acquosa di composizione ionica simile al liquido extracellulare, attraverso una sonda di microdialysis composta da un piccolo albero con una punta di una membrana semipermeabile fibra cava². Dopo l'inserimento della sonda, neurotrasmettitori o altri analiti di interesse possono attraversare la membrana semipermeabile con la diffusione passiva prima di essere raccolti a intervalli per la successiva analisi mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), un chimica analitica tecnica comunemente utilizzata per separare, identificare e quantificare i componenti in una miscela eterogenea³.

Anche se il microdialysis è una tecnica sensibile che può essere utilizzata per misurare praticamente qualsiasi analita di interesse, la risoluzione temporale è bassa, con frequenze di campionamento massima dell'ordine di minuti a decine di minuti^1,2. L'invenzione della scansione rapida voltammetria ciclica (FSCV), una tecnica che si basa sul potenziale redox di specie elettroattivi, può delucidare vicino istantanee concentrazioni dell'analita di interesse nel liquido extracellulare. In breve (Vedi Robinson et al. ⁴ per una vasta revisione), un elettrodo è applicato per alzare e abbassare la tensione in una moda onda triangolare su una scala di tempo veloce⁴. Quando la tensione è nell'intervallo corretto, il composto di interesse ripetutamente è ossidato e ridotto. Questa ossidazione e riduzione si traduce in un movimento di elettroni che crea una piccola corrente alternata. Scansione tariffe avvengono sulla scala di frazioni di secondo con ossidazione e riduzione dei composti che si verificano in microsecondi. Sottraendo lo sfondo corrente creato dalla sonda dalla corrente risultante, uno può generare una tensione vs attuale trama unica per ogni composto. Poiché la scala temporale delle oscillazioni della tensione è conosciuta, questi dati possono essere utilizzati per calcolare un complotto della corrente in funzione del tempo. Così, le concentrazioni relative del composto possono essere determinate, purché il numero di elettroni trasferiti in ogni ossidazione e reazione di riduzione è nota⁴.

Questa specificità chimica ed elevata risoluzione temporale fare FSCV una potente tecnica per la rilevazione cambiando concentrazioni chimiche in vivo. Tuttavia, nonostante questi molteplici vantaggi, questa tecnica richiede ampie competenze tecniche e attrezzature costose e installazione. Ulteriormente, i neurotrasmettitori nonelectroactive (ad es., glutammato) non possono essere misurati utilizzando questa tecnica. Fortunatamente, i progressi tecnologici nel campo della elettrochimica⁵, come pure la commercializzazione di queste invenzioni, ha introdotto un approccio relativamente semplice per misurare non-elettroattivi neurotrasmettitori in animali comportamento svegli senza compromettere temporale precisione-una tecnica nota come tecnologia dei biosensori enzimatici. Questa tecnica utilizza la conversione enzimatica del neurotrasmettitore nonelectroactive di interesse nei due substrati, uno dei quali è il perossido di idrogeno elettroattivi viene rilevato come un'ossidazione amperometrici corrente generata da un potenziale applicato⁵ . Biosensore commercialmente disponibili sonde (vedere Figura 1) selettivamente misurano analiti di interesse competitivo riducendo il contributo di interferenti endogeni. Nel caso di glutammato, il contributo di comune interferent acido ascorbico (AA) competitivo viene ridotto alla corrente misurata di co-localizzazione di ossidasi AA sulla superficie enzimatica attiva del sensore, conversione AA in non-elettroattivi dihydroascorbate e acqua. Inoltre, uno strato di polimero Nafion caricato negativa presente sotto lo strato di enzima esclude composti anionici endogeni.

Questa stessa impostazione sperimentale di biosensore in grado di misurare elettroattivi neurotrasmettitori come in FSCV, ma invece impiega un potenziale fisso registrazione⁶. In contrasto con la tensione oscillante applicata in FSCV, in una registrazione di potenziale fissa la tensione è mantenuta a redox potenziale per l'analita di interesse. Anche se è meno chimicamente selettivo rispetto FSCV come neurotrasmettitori multipli possono avere la stessa potenziale, redox nelle aree del cervello che schiacciante inclinare verso un neurotrasmettitore, la natura di turno-chiave di questo approccio supera la mancanza di sostanza chimica specificità.

La possibilità di misurare sia elettroattivi e nonelectroactive rilascio di neurotrasmettitori in tempo quasi reale e collegarlo a specifici eventi comportamentali offre l'opportunità di esaminare convergenti del rilascio di neurotrasmettitore. Questo manoscritto descrive in dettaglio l'utilizzo di questo sistema per interrogare la neurotrasmissione del glutammato e della dopamina in risposta alla naturale ricompensa in criceti comportamento svegli. Lo scopo di questa carta è di dettagliare il processo di misurazione questo rilascio di neurotrasmettitore durante il comportamento sessuale nei criceti femminili, con l'obiettivo di dimostrare la fattibilità per l'esame di altri comportamenti e paradigmi sperimentali.

I criceti sono un modello ideale per l'uso in elettrochimiche registrazioni
Storicamente, i modelli del ratto e topi sono stati impiegati nello studio del comportamento sessuale. Queste specie di roditori impegnano in una sequenza dinamica di copula, che coinvolge numerosi comportamenti femminili sollecitazione che includono hopping, guizzanti e orecchio dimenando per attirare il maschio inseguire e infine montare la femmina⁷. Il montaggio da parte del maschio (con o senza penetrazione vaginale) dura solo pochi secondi, durante il quale la donna si impegna nella sua postura di comportamento sessuale (chiamato lordosi) anche solo per pochi secondi prima di riprendere i comportamenti attivi sollecitazione. Questo modello di comportamento, composto da alti livelli di attività intervallati da brevi periodi di immobilità, è problematico per la misurazione di neurotrasmissione nel comportarsi animali. In primo luogo, possono esserci artefatti di movimento nelle registrazioni amperometrico che non sono correlate all'attività neurale. In secondo luogo, la locomozione è associata con il rilascio di neurotrasmettitori particolare in determinate regioni del cervello. Ad esempio, rilascio della dopamina è stato accoppiato ad attività locomotrice nel corpo striato dorsale e ventrale^8,9, trovando quello ha costituito la base per le misurazioni di microdialisi della dopamina seguendo psicostimolante amministrazione¹⁰. Perché i comportamenti di donna-tipica sollecitazione a most roditori comportano alti livelli di attività locomotrice e sono rappresentati dalla mole di un test di comportamento sessuale di 10 minuti, questo rende difficile attribuire i cambiamenti nella neurotrasmissione ai componenti esplicite di comportamento sessuale che collettivamente durano solo minuti.

Per analizzare il profilo del neurochemical del comportamento sessuale femminile, questo laboratorio ha cercato una specie in cui c'è minima attività locomotrice che accompagna il comportamento sessuale. La sequenza copulatoria in criceti siriani (Mesocricetus auratus) è ideale per le registrazioni del neurochemical a causa della mancanza di comportamenti di sollecitazione tipicamente osservati in ratti e topi¹¹. Di conseguenza, criceti femminile entrerà e mantenere la postura di lordosi per verso l'alto 9 minuti fuori 10 minuti test sessione¹². Con la mancanza di movimenti estranei locomotore dalla femmina, in vivo si ottengono registrazioni elettrochimiche che possono essere associate a componenti di interazioni sessuali con l'uomo.

Bouts copulatoria in criceti
Dopo l'introduzione di un animale maschio stimolo nella camera di prova, l'uomo inizialmente si impegnerà nell'inchiesta anogenital (AI) della femmina prima di montare il suo (Figura 2A). In ordine per il maschio montare, la donna deve assumere un atteggiamento di sessuale ricettivo conosciuto come lordosi, in cui lei inarca la schiena e devia la coda in modo che il maschio di montaggio possa accedere del pene vagina per lei. Il maschio monterà la femmina, stringendo il suoi quarti posteriori con entrambe le zampe (Figura 2B) e iniziare spingendo nel tentativo di guadagnare intromission penile (Figura 2C). Il maschio montare la femmina (senza inserimento) così come cooptare un numero di volte prima di raggiungere alla fine eiaculazione precoce. Questa sequenza di Monti e intromissions che conduce alla eiaculazione è definita un "incontro copulatoria". I maschi avranno diversi attacchi copulatore all'interno di una singola sessione.

Protocol

tutte le procedure qui descritte sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) di The University of Minnesota e sono in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio ¹³ .

1. animali e inserimento di una canula chirurgia

1. Obtain siriano criceti da un fornitore di animali comune a circa 55 giorni di età.
   Nota: Anche se l'età degli animali può variare a causa di vincoli di vari paradigmi sperimentali, per comportamento sessuale è importante ottenere animali sessualmente maturi che sono tutti a circa la stessa età.
2. Gli animali di casa in modo controllato temperatura (22 ° C) e l'ambiente di illuminazione (14 h luce seguita da 10 h scuro con luci spente alle 13:00 h), con cibo e acqua disponibile ad libitum tranne durante i periodi di sperimentazione.
   Nota: Poiché criceti stagionalmente riproducono anche, questo 14:10 ciclo luce/buio imita le loro condizioni di allevamento naturale.
3. a seguito di un'acclimatazione di 1 settimana al laboratorio, eseguire asettica bilaterale ovariectomies e inserimenti di una canula stereotassiche intracraniche in anestesia generale (ad es., pentobarbital) e amministrare appropriato istituzionalmente-approvato trattamento analgesico ed antibiotico postoperatorio come precedentemente descritto ^{14 , 15}.
   Nota: Per lo studio del comportamento sessuale, ovariectomies sono necessarie per rimuovere la principale fonte endogena di ormoni sessuali, in modo che gli animali possono essere indotte uniformemente a ricettività sessuale con ormone esogeno in conformità con la timeline sperimentale.
   1. Per l'impianto di sonda sia dopaminergici e glutamatergici, stereotassicamente implantare guida cannule (0,7 mm di diametro; Figura 3) nell'area di interesse (ad esempio, questo laboratorio mirate giusto nucleo accumbens (NAc)) come descritto in dettaglio graduale altrove ¹⁵.
      Nota: Anche se i dati presentati sono da singolo sensore di registrazioni di una sonda di glutammato o dopamina per animale, questo sistema permette la registrazione simultanea di fino a 4 sensori in un unico animale; così, 1-4 cannule potrebbero essere impiantate a seconda dei risultati e disegno sperimentale desiderato.
      1. Determinare le coordinate dell'impianto della regione di interesse utilizzando un Atlante stereotassica (ad es., Il cervello di criceto dorato da Morin & legno), tenendo presente che il sensore si estende 1 mm sotto la cannula nel tessuto cerebrale.
   2. Dopo una cannula stereotassicamente è abbassata nella posizione desiderata del dorso-ventrale, fissarlo al cranio usando un tappo costruito da dentale acrilico, fissato con viti in acciaio inox dell'osso e una testa di plastica montare ( Figura 3 ; Vedi ¹⁵ per maggiori dettagli).
   3. Per la prova in fibra di carbonio, inserire un elettrodo di riferimento (350 μm di diametro, lunghezza totale 7,5 mm) nell'emisfero controlaterale.
      Nota: Un percorso specifico o distanza dalla cannula non è necessaria; elettrodi di riferimento possono essere posizionati ovunque nell'emisfero controlaterale che è conveniente.

2. Biosensori e fibra di carbonio test

1. dopo 1 settimana di recupero da un intervento chirurgico, amministrare il regime di adescamento dell'ormone per indurre la recettività sessuale.
   1. Iniettare 10 µ g di benzoato di estradiolo in 0,1 mL di olio di semi di cotone per via sottocutanea (s.c.), circa 48 ore e 24 ore prima il comportamento sessuale, test, per indurre la recettività sessuale verso il maschio ¹¹.
   2. Iniettare 500 µ g di progesterone in 0,1 mL di olio di semi di cotone, s.c., 4 h prima dell'introduzione del maschio per indurre la recettività sessuale ¹¹.
2. Testare tutti gli animali all'inizio della fase scura del loro ciclo quotidiano, come i comportamenti sociali dei roditori sono soggette a modifiche sotto luce bianca e luce rossa test condizioni ^{16 , 17 , 18}.
3. per il biosensore enzimatico glutammato test, calibrare i sensori in vitro ( Figura 4) prima dell'uso, come descritto in precedenza ^{15 , 19}.
   1. fare la calibrazione soluzioni freschi il giorno del test in vetro da 20 mL provette da centrifuga. Per la soluzione di analita, sciogliere 7,4 mg di acido L-glutammico in 10 mL di ultra-puro H ₂ O capovolgendo delicatamente la provetta. Rendono la soluzione interferent sciogliendo 176,1 mg AA in 10 mL di ultra-puro H ₂ O.
   2. Set up per la calibrazione inserendo un agitatore magnetico sulla base di uno stand di anello di base del laboratorio. Porre un becher rivestito di 20 mL in cima l'agitatore magnetico e bloccare in posizione utilizzando una pinza Polo 2 media.
      1. Aggiungi scalpore magnetico bar e 20 mL di 100 millimetri di fosfato tampone salino (PBS) nel becher rivestito. Collegare il becher rivestito a bagno d'acqua circolante a riscaldare la soluzione tampone a 37 ° C.
         Nota: Le calibrazioni di biosensori enzimatici devono essere eseguite a temperatura corporea, poiché l'attività enzimatica è influenzata dalla temperatura.
   3. Posto titolare di calibrazione del sensore sulla parte superiore il becher rivestito e impostare un preamplificatore di calibrazione 4 canali in cima, fissaggio con un morsetto ad angolo retto. Collegare il preamplificatore a un dispositivo di condizionata e acquisizione di dati per i dati di calibrazione record.
   4. Testare la sensibilità di ogni biosensore enzimatico di glutammato (o altri analiti di interesse per altri biosensore commercialmente disponibili sonde per esempio, glucosio) prima della registrazione sperimentale mettendo la sonda nel supporto di calibrazione in cima a un Becher rivestito, sommergendo la cavità di telerilevamento e qualche porzione di cavo di riferimento di cloruro di argento (AgCl) nella soluzione tampone.
      1. Prima di collegare ogni sensore (fino a 4) sottoposto a una porta su un preamplificatore di calibrazione 4 canali, avviare una nuova registrazione sull'interfaccia del computer utilizzando il software di acquisizione gratuita scaricabile. Consentire i sensori raggiungere una linea di base stabile.
   5. Iniziare ad aggiungere le iniezioni di analita quando i sensori hanno raggiunto una linea di base stabile. Utilizzare il foro del supporto di calibrazione per introdurre un puntale per la soluzione tampone. Utilizzare lo strumento di annotazione chiave rapido del software di registrazione per annotare quando viene effettuata un'iniezione.
      1. 10 fare aggiunte di µM di glutammato di pipettaggio 40 μL della soluzione di analita in soluzione tampone. Attendere che il sensore stabilizzare tra aggiunte. Aggiungere 3 iniezioni di soluzione di analita prima di aggiungere una singola iniezione da interferent soluzione AA (volume di iniezione 50 μL per 250 μM cambiamento nella concentrazione).
         Nota: La taratura consente la conversione dei cambiamenti nel segnale amperometrico (visto durante la registrazione sperimentale enzimatica nel passaggio 2.12) ai cambiamenti nella concentrazione di glutammato, se lo si desidera. Vedere riferimento ¹⁵ per istruzione graduale. Le sonde dopaminergici utilizzate da questo laboratorio vengono calibrate durante il processo produttivo dal provider commerciali. Sonde di glutammato devono essere calibrati al momento dell'uso come loro sensibilità può diminuire nel tempo, come i componenti enzimatici degradano ¹⁹. Perché gli elettrodi in fibra di carbonio non subiscono la degradazione, la calibrazione eseguita dalla società prima della spedizione è sufficiente lungo come tqui è un aumento della probabilità di danneggiare la fibra di carbonio sottile (diametro 350 μm) attraverso gestione aggiuntiva.
4. Linea la camera di prova con biancheria da letto prelevato dall'animale ' gabbia a casa s.
   Nota: In questo modo aumenta la femmina ' familiarità di s con la prova dell'alloggiamento, così come espone il maschio sessualmente stimolante segnali olfattivi degli amori che sono stati distribuiti dalla femmina in risposta al trattamento di estradiolo.
5. Leggermente anestetizzare gli animali prima dell'inserimento della sonda da isoflurano o un altro anestetico volatile in una camera di induzione.
6. Rimuovere l'otturatore occlusiva dalla cannula guida e inserire in fibra di carbonio elettrodo o sonda enzimatica attraverso l'albero guida.
7. Dopo l'inserimento della sonda, metti l'animale nella camera di prova.
   Nota: Questo laboratorio utilizza un acquario di vetro 10-gal (24,5 x 48,9 x 29,4 cm), ma rotondi sezioni di uguale area possono essere impiegati anche.
8. Begin registra il segnale amperometrico video e tempo-bloccata in un programma di software disponibile in commercio, descritto dettagliatamente altrove ¹⁵.
9. Collegare il sensore al sistema di registrazione: il potenziostato tramite un cavo schermato elettricamente e un elettrico girevole. Stabilizzare il collegamento del sensore avvitando un attacco pin sul Monte del capo. Rafforzare la connessione utilizzando eventualmente del film lab.
   Nota: Un connettore personalizzato è necessario per fissare la fibra di carbonio elettrodo e l'elettrodo di riferimento per il potenziostato, mentre i sensori di glutammato enzimatica possono essere collegati direttamente al potenziostato.
10. Consentire al sensore di equilibrare nel cervello prima sperimentazione.
    Nota: Volte di equilibrazione differiscono a seconda del sensore di registrazione (ad es., sensori enzimatici richiedono equilibrazione di 2-4 h, mentre gli elettrodi di carbonio richiedono solo circa 30 min). Se entrambi i tipi di sensori vengono impiantati, equilibrare per il lungo tempo di sensore enzimatico.
11. Dopo l'equilibratura di sensore, è necessario introdurre un maschio di stimolo nella camera di prova.
12. Dopo il primo montaggio con inserimento del pene (chiamato intromission) dal maschio dello stimolo, continuare a registrare per altri 10-30 min, a seconda degli obiettivi sperimentali.
13. Successive ai test comportamentali, scollegare la femmina ' sensore s.
14. Rimuovere entrambi criceti dalla camera di prova. Rimuovere la biancheria da letto e pulizia della camera con etanolo al 70%.
    Nota: A causa del breve equilibrazione necessaria per le registrazioni in fibra di carbonio, passaggi 2.3-2.14 possono essere ripetuti per testare più animali nello stesso giorno. Al contrario, poiché i sensori enzimatici richiedono circa 4 h di equilibrazione, testare un solo animale al giorno per limitare la possibile variazione inter-soggetto a causa delle differenze negli animali ' circadiana di tempo alla prova.

3. Sacrificio e perfusione

1. profondamente dopo la conclusione del periodo di prova, anestetizzare il soggetto femminile con un agente euthanizing (ad es., questo laboratorio utilizza un'iniezione intraperitoneale di 0,2 mL di soluzione di fenitoina e pentobarbital) .
2. Via irrorare l'animale con PBS, pH 7,6, rimuovere tutto il sangue circolante, seguito da una fissazione di 20 min utilizzando 4% paraformaldeide-PBS da 25 mM.
3. Rimuovere il cervello e postfix in ~ 30 mL della soluzione di paraformaldeide al 4% in una provetta conica da 50 mL durante la notte. Soluzione di saccarosio-PBS
   1. store il cervello in un 10% fino al momento di sezione serial.
      Nota: Cervello può essere conservata fino a 2 settimane, con cambi settimanali soluzione di saccarosio per evitare la potenziale crescita dei contaminanti.
4. Sezione di serie del cervello in 40 µm fette attraverso la regione impiantata sia con un congelamento microtomo o criostato come precedentemente descritto ¹⁹.
5. Montare in serie fette su vetrini rivestite con adesivo disponibile in commercio (o vedere ²⁰ per fare). Lasciare per asciugare almeno una notte.
6. Colorare i vetrini con tintura di cresile viola, chiaro, e coprioggetto come precedentemente descritto ²⁰.
7. Le diapositive utilizzando la microscopia del campo luminoso per confermare il posizionamento anatomico del sensore di immagine.

4. Codifica del comportamento

1. vista e annotare i video utilizzando il software commercialmente scaricabile gratuitamente (Vedi Tabella materiali) al rallentatore ai comportamenti del proprio codice tempo-bloccata al segnale amperometrico.
   Nota: Utilizzare il codice MATLAB in analisi (Vedi sotto)) , annotare l'inizio e la fine di ogni femmina ' s e uomo ' comportamenti s.
   1. Annota startLordosis nel telaio quando la femmina inizia un dorsoflexion di lei indietro e difetti la coda verso l'alto. Annotare endLordosis quando la femmina termina questa postura, che spesso si verifica quando la femmina si adegua in un'altra posizione nella camera di prova.
   2. Annotare startAI quando la femmina è nella postura di lordosi e l'uomo si muove il muso verso la femmina ' regione anogenital s, dove può verificarsi annusare, leccare o nuzzling della sua regione perineale. Annotare endAI quando l'uomo rimuove il muso dalla vicinanza alla femmina ' regione anogenital s.
   3. Annotare startMount quando il maschio si avvicina e mette suoi zampe anteriori la femmina in una posizione di montaggio, indipendentemente dall'orientamento del tentativo di montaggio (ad es., lato, groppa).
   4. Annotare startIntromission quando spingendo il successo guadagna l'accesso del pene maschio montato al femminile ' vagina di s.
      Nota: Un'intromissione è comportamentale distinguibile dalla Spinta montato che si verifica prima del intromission, come l'uomo visibilmente tira i suoi arti superiori verso il suo corpo, infila il suo bacino in avanti e riccioli la coda verso l'alto, che indica la penetrazione (vedere < forte classe = "xfig" > figura 4 C).
      1. Quando applicabile, annotare eiaculazione.
         Nota: Al termine di un incontro degli amori e in combinazione con un riuscito intromission, il maschio si eiaculazione. Anche se uno è in grado di visualizzare l'effettiva emissione, criceti maschii hanno una caratteristica calpestando il movimento con i loro piedi posteriori durante un'intromissione ²¹, quindi annotare l'eiaculazione al verificarsi del movimento piede.
   5. Annotare endIntromission ed endMount contemporaneamente nel telaio quando l'uomo ha rimosso le sue due zampe anteriori e quindi, non ha alcun contatto con la femmina. A causa della frequente incapacità di visualizzare il suo ritiro, simultaneo codice questi due comportamenti per consentire coerenza e affidabilità attraverso periodi di accoppiamento.
      Nota: Un incontro di accoppiamento o segue un'eiaculazione precoce successo o è quando la donna rompe la postura di lordosi seguito almeno un montare.

5. Analisi dei dati di esempio

Nota: l'uso di fibra di carbonio fisso-potenziale e registrazioni enzimatiche per la dopamina unND glutammato, rispettivamente, consente la possibilità di misurare sia tonico e fasici modelli di rilascio elettrochimica. Questo laboratorio utilizza un sistema di acquisizione gratuita, commerciale e software per registrare e convertire registrato segnali da analogico a digitale (bias 0.600 V, frequenza di campionamento = 1Hz).

1. Descrizione del protocollo di analisi di dati di esempio
   1. anche se altri programmi possono essere utilizzati, quantificare le modifiche fasiche (transitorie) in segnale elettrochimico registrato utilizzando MATLAB e tonico.
      1. Per i dati presentati, calcolare il segnale tonico utilizzando un filtro di medio commovente di 50 punti. Una rappresentazione normalizzata solo transitori del segnale è stata calcolata sottraendo il segnale tonico dai dati grezzi. Quando si identifica una frase picchi, ci sono varie opzioni algoritmici (ad es., etichettatura picchi come cambiamenti del segnale più di 1 SD sopra la media).
      2. Identificare le posizioni di questi picchi, cioè, massimi locali, dal segnale normalizzato utilizzando la funzione MATLAB peakfinder con l'ampiezza di picco minima impostata quadratico medio del segnale. La posizione dei picchi rilevati dal segnale normalizzato è stata utilizzata per estrarre l'ampiezza da ogni picco. La capacità di rilevare picchi permette l'identificazione di eventuali comportamenti tempo-bloccata può essere coincidente con, o guidare il relativo picco nel neurochemical sotto inchiesta.
   2. Segmento i dati elaborati in conformità con le annotazioni del comportamento (Vedi punto 3); uno studente ' s t-test è stato utilizzato per valutare le differenze nel livello del neurotrasmettitore tonico, l'avvenimento di transienti e l'ampiezza del transitori durante la lordosi incontro pre-accoppiamento contro lordosi durante periodi di accoppiamento. Per misurare le modifiche ai modelli di tonico di rilascio elettrochimica, i punti di dati che si verificano durante la posizione di lordosi direttamente prima di un incontro di accoppiamento (cioè, lordosi incontro pre-accoppiamento) sono stati confrontati con i punti di dati durante il periodo degli amori sessione utilizzando un t-test.
2. Preparazione di dati grezzi per protocollo di analisi di dati descritti
   Nota: come indicato, anche se altri programmi o analisi possono essere altrettanto valide opzioni, al fine di utilizzare il codice MATLAB sopra descritto, i dati grezzi devono essere preparati seguente modo:
   1. esportare i file di annotazione e tensione. Per fare questo, sotto il ' File ' scheda, selezionare il ' esportazione ' funzione e selezionare il ' annotazioni ' tab per salvare le annotazioni. Sotto il ' File ' scheda, selezionare il ' esportazione ' funzione e scegliere il " TSV ' tab per salvare le misurazioni di tensione come un file con estensione TSV.
   2. Aprire ogni file con un programma di foglio di calcolo e salvarlo come ' xls/xlsx ' per rendere i file compatibile con MATLAB.
      Nota: Per il ' annotazione ' file, esistono ulteriori annotazioni che devono manualmente aggiunto post-esportazione in un foglio di calcolo di dettare l'inizio e la fine di entrambi la lordosi incontro pre-accoppiamento (annotata come PreMBlordorsis ) e l'incontro degli amori affinché questi intervalli di tempo possono essere confrontati direttamente come accennato nel passaggio 5.1.2.
   3. Annotare l'inizio della lordosi incontro pre-accoppiamento (startPreMBlordosis) allo stesso tempo come un comportamento di lordosi comincia (startLordosis), che inoltre include un comportamento montare e anche all'inizio di un nuovo accoppiamento incontro se la femmina rimane nella postura lordosi.
   4. Annotare alla fine della lordosi incontro pre-accoppiamento (endPreMBlordosis), quando inizia il primo montaggio.
   5. Annotare l'inizio di un incontro degli amori (startMB) allo stesso tempo di endPreMBlordosis, come questo indica l'inizio di un incontro accoppiamento.
   6. Annotare alla fine di un incontro degli amori (endMB) presso l'estremità di un Monte che include un' eiaculazione precoce (Vedi punto 4.1.4.1), o seguendo la femmina ' cessazione di s della postura lordosi (endLordosis).

Representative Results

Utilizzando l'elettrochimica e comportamentali codifica metodologia descritta sopra, questo laboratorio ha cominciato a caratterizzare sia tonico e fasiche fluttuazioni in dopamina e glutammato durante le registrazioni in vivo del comportamento sessuale. A causa del modo temporalmente precisa di questa metodologia, noi possiamo caratterizzare più accuratamente neurotrasmissione durante il comportamento sessuale; così come attribuire specifici cambiamenti nei modelli di rilascio a modifiche corrispondenti tonico durante periodi degli amori e corrispondenti fluttuazioni transitorie durante il ricevimento della femmina dei singoli comportamenti copulatoria (ad es., intromission, eiaculazione) dal maschio montaggio.

In particolare, abbiamo usato questa metodologia di concentrarsi su misura i modelli di rilascio della dopamina e del glutammato nel NAc di animali separati. Il NAc è una regione critica coinvolti nella ricompensa elaborazione²² ed è stata descritta come una regione integrante negli aspetti ricompensa di comportamento sessuale²³.

Abbiamo osservato che durante il comportamento sessuale, le femmine dimostrano un aumento di tonico nei livelli dopaminergici nel nucleo di NAc durante l'accoppiamento attacchi (Figura 5). Mentre questi cambiamenti tonico sono indicato per tutti i periodi degli amori, la metodologia descritta sopra può misurare le variazioni di tonico fra ogni accoppiamento bout e quindi aumentare l'identificazione temporale dei cambiamenti globali ai livelli di tonico del rilascio di neurotrasmettitore in tutta l'intera sessione. Ulteriormente, questa metodologia descritta può individuare cambiamenti fasiche e mappa temporaneamente i comportamenti associati probabilmente queste fluttuazioni fasiche neurotrasmettitore. In particolare, questi risultati preliminari indicano che durante l'accoppiamento bouts, dopaminergici transitori nel NAc derivano durante l'inserimento vaginale (intromission) dal maschio (Figura 6). Inoltre, questa associazione con intromission è specifica, con le risposte di dopaminergici trascurabile per altri comportamenti copulatoria, come l'intelligenza artificiale.

Un modello simile è stato osservato in altri animali per quanto riguarda il rilascio di glutammato, con rapidi transienti che corrispondono ai singoli intromissions nel nucleo dorsale di NAc durante un incontro copulatoria (Figura 7). Questo modello è regione specifica, con nessun segnale distinguibile che si verificano in NAc shell o mediale caudato di altri animali.

Figura 1 : Tecnologia dei biosensori enzimatici.
Realizzazione standard di sonde disponibili in commercio biosensore enzimatico che rilevano neurotrasmettitori tramite elaborazione enzima-mediata (immagine a sinistra). Nel caso di sensori glutamatergici, glutammato ossidasi sono impiegato nel livello enzimatico (immagine a destra) per convertire il neurotrasmettitore nonelectroactive elettroattivi al perossido di idrogeno (H₂O₂) che viene rilevato da ossidazione presso il elettrodo di platino-iridio (Pt-Ir). Acido ascorbico (AA), un comune interferente che è ossidato sullo stesso potenziale, è escluso tramite un'aggiunta di ossidasi di AA a livello enzimatico che converte l'interferente in acqua nonelectroactive. Altri negativi elettroattivi interferenti presenti nel cervello sono esclusi tramite una membrana selettiva passiva. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Componenti di un criceto accoppiamento Bout.
In criceti, un incontro di accoppiamento è costituito da una sequenza di comportamenti copulatoria, durante il quale la femmina rimane nella postura immobile lordosi mentre il maschio anogenitally indaga (A), Monti (B)e raggiunge intromission (C). . Nota un'intromissione è comportamentale distinguibile dal montaggio come il maschio tira i suoi arti superiori verso il suo corpo, infila il suo bacino in avanti e la coda verso l'alto, che indica la penetrazione di riccioli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Costruzione di skull Cap.
Guida cannule, viti ossee e dentale acrilico sono utilizzati nella costruzione di un cranio tappo per consentire l'inserimento di fibra di carbonio o enzimatica sonda (Vedi¹⁵ particolari graduale). Questa figura raffigura un impianto singolo cannula sopra il NAc giusto per un sensore enzimatico (nessun elettrodo di riferimento impiantati) e supporto testa in plastica per la stabilità del sensore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Taratura di glutammato biosensore.
La sensibilità di ogni biosensore a glutammato è testata in vitro prima registrazione sperimentale da 10 µm aggiunte di glutammato (verde) a 37 ° C (poiché l'attività enzimatica è influenzata dalla temperatura). Ogni sensore è confermato di essere non-responsivi agli acido ascorbico (AA; rosso) o dopamina (DA; blu). Questa calibrazione permette la conversione delle variazioni nel segnale amperometrico visto durante registrazione sperimentale ai cambiamenti nella concentrazione di glutammato.  Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 : Tonico aumenta in dopamina durante un incontro di accoppiamento.
R. esempio stilizzata di premating bout lordosi segnale vs accoppiamento segnale di lordosi bout. Per misurare il rilascio di dopamina tonico, amperometrico risposte ai livelli di dopamina durante lordosi prima di un incontro di accoppiamento (MB) sono state confrontate a quelli durante un MB. Caselle grigie indicano lordosi prima un MB. BLcaselle di UE indicano lordosi durante un MB. B. quantificazione rappresentativa da un animale confrontando la tensione media tra nickbald lordosi e lordosi MB. Barre di errore indicano errore standard della media (SEM) e asterisco indica differenza significativa (p-valore < 0.05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6 : Rappresentante della dopamina traccia.
Fasica rilascio di dopamina è tempo-bloccata a intromissions dal maschio nel nucleo dorsale del NAc. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7 : Rappresentante glutammato traccia.
Transitori di glutammato corrispondono ai singoli intromissions dal maschio nel nucleo dorsale del NAc durante una prolungata esperienza sessuale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Anche se relativamente semplice, alcuni problemi possono sorgere quando si impiegano questa tecnica. In primo luogo, il posizionamento delle sonde stereotassica deve essere preciso: a differenza di microdialysis che campiona un raggio più ampio del milieu extracellulare che circonda la sonda, questa tecnica permette solo la misura di un neurotrasmettitore che entra in contatto diretto con la sonda. In secondo luogo, nel caso la registrazione di fibra di carbonio, a causa della piccola larghezza di fibra, può verificarsi la rottura e la sonda deve essere inserita con cura deliberata. Nel caso di biosensori glutamatergici, degradazione enzimatica può verificarsi se la sonda non viene utilizzata entro il lasso di tempo garantito di 3 settimane. Per fortuna, tutti questi problemi sono indirizzabili e possono essere eliminati con cura e attenzione al dettaglio.

Un avvertimento potenzialmente problematico si pone nella specificità delle registrazioni di fibra di carbonio fisso-potenziale. Perché il potenziale applicato per la dopamina coincide con altre monoamine, come la noradrenalina, se le registrazioni sono effettuate in aree che rilasciare entrambi neurotrasmettitori, che questa mancanza di specificità chimica può limitare l'interpretazione dei risultati. Nel NAc questo non pone un grave problema, con dopamina essendo il primario della catecolammina trasmettitore²⁴. Poiché circa il 98% delle cellule in NAc sono neuroni medi spinosi che rispondere a di neurotrasmissione dopaminergica²⁴, il segnale è sbilanciato verso il rilevamento della dopamina e facilita l'utilizzo di questo approccio più chiavi in mano.

Un altro vantaggio di questo biosensore enzimatico e fibra di carbonio fisso-potenziale sistema di registrazione è che possono essere eseguite registrazioni dual-sonda, in modo che sia elettroattivi e nonelectroactive neurotrasmettitori come la dopamina e glutammato possono essere misurati in contemporaneamente lo stesso animale. Sebbene i dati qui presentati provengono da registrazioni in animali separati, queste tecniche possono essere impiegate contemporaneamente tale che si può valutare la convergenza della neurotrasmissione in regioni multiple del cervello o nella stessa regione bilateralmente. Combinazione delle registrazioni all'interno dello stesso animale, o confronto delle registrazioni attraverso animali come illustrato di seguito, sono entrambi potenti strumenti a delucidare i meccanismi dietro le connessioni di rete e segnalazione.

In sintesi, questa carta dimostra le tecniche potenti di biosensori enzimatici e registrazione potenziale fisso per misurare più neurotrasmettitori elettroattivi e nonelectroactive che utilizzano un'unica configurazione sperimentale. Anche se i dati presentati qui provengono da registrazioni di singoli neurotrasmettitore attraverso più animali, questo sistema offre la possibilità di registrare fino a 4 sensori in un animale contemporaneamente¹⁵. I risultati dei campioni presentati collettivamente forniscono informazioni sulla neurotrasmissione rapida nel criceto femmina derivanti da modelli specifici di stimolazione copulatoria dal maschio. Inoltre, questi esperimenti dimostrano tempo-bloccata risposte di dopaminergici e glutamatergici transitori nel nucleo NAc della femmina di intromission dal maschio, suggerendo che questa versione può essere responsabile per la codifica distinte proprietà gratificanti dell' comportamento sessuale. Il nostro obiettivo è quello di continuare a utilizzare il modello di accoppiamento in criceti siriani femminili per sviluppare un quadro più completo della relazione di dopamina in vivo e rilascio di glutammato e la circuiteria sottostante ai singoli componenti di stimoli copulatoria dal maschio. Noi crediamo che la capacità di caratterizzare i modelli di questi neurotrasmettitori non è solo utile da una scienza di base prospettiva²³, ma anche nel delucidamento potenziali approcci terapeutici per forme patologiche di premiare il comportamento tali come droga dipendenza²⁵.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nembutal	Oak Pharmaceuticals Inc.	76478-501-50	Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5 mg/100 g body weight, injected intraperotineally.
Loxicom analgesic	Norbrook Laboratories	6451603670	NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam.
Enroflox antibiotic	Norbrook Laboratories	5552915411	Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin.
Beuthanasia-D	Merck Animal Health	00061047305	Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent.
Bone screws	Pinnacle Technologies, Inc.	8111-16	1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull.
Dental acrylic (Bosworth Duz-All)	Bosworth	166261C	Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull.
Hardware biosensor setup	Pinnacle Technologies, Inc.	8400-K2	Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system
Base video computer package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K1	The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables.
Video EQ700 EverFocus camera  package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K10	EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available.
Sirenia Acquisition software	Pinnacle Technologies, Inc.	Free--available to download from pinnaclet.com	Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review.
Tethered rat in vitro calibration kit	Pinnacle Technologies, Inc.	7000-K2-T-BAS	In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051).
Stir plate	Corning	6795-410D	Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors.
Water bath capable of closed loop circulation	PolyScience	8006A11B	PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature.
Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae	Pinnacle Technology, Inc.	7002-CFS	Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission.
Ag/AgCl reference electrode	Pinnacle Technology, Inc.	7065	Necessary for carbon fiber recordings.
Glutamate biosensors	Pinnacle Technology, Inc.	7001	Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission.
BASi guide cannulae	Pinnacle Technologies, Inc.	7030	Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe.
BASi cannula plastic headpiece for rats	Pinnacle Technologies, Inc.	7011	Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat.