Summary
Dette papiret viser bruk av fast potensial amperometric opptak med karbonfiber elektroder og enzymatiske biosensor teknologi for å måle utgivelsen av dopamin og glutamat med timelige høyoppløselig under naturlige givende atferd i den kvinnelig hamster.
Abstract
Muligheten til å måle nevrotransmitter utgivelse på en rask tidsskala kan mønstre av neurotransmission skal kobles til spesifikk atferd eller manipulasjoner; et kraftig verktøy i Klargjørende underliggende mekanismer og kretser. Mens teknikken av microdialysis har blitt brukt i flere tiår for å måle nesten alle analytt rundt i hjernen, er denne teknikken begrenset i midlertidig løsning. Alternativt, rask skanning syklisk voltammetry er både tidsmessig presis og ekstremt følsom; men fordi denne teknisk vanskelig metoden er avhengig av electroactivity av analytt rundt, er muligheten til å oppdage nonelectroactive stoffer (f.eks, signalstoffet glutamat) eliminert. Dette papiret viser bruk av en nøkkelferdig system som kombinerer fast potensial amperometry og enzymatiske biosensing å måle både electroactive og nonelectroactive nevrotransmittere med timelige presisjon. Sammenkoblingen av disse to kraftige teknikker kan for måling av både tonic og phasic neurotransmission med relativ letthet, og tillater registrering av flere nevrotransmittere samtidig. Målet med dette manuskriptet er å vise prosessen med måler dopamin og glutamat neurotransmission i vivo bruker en naturlig givende atferd (dvs., seksuell atferd) i kvinnelige hamsters, med det endelige mål å vise den teknisk gjennomførbarhet av denne analysen for å undersøke andre atferd og eksperimentelle paradigmer.
Introduction
Muligheten til å måle nevrotransmitter utgivelse i våken oppfører dyr kan forskere koble spesifikk atferd med romlige og tidsmessige mønstre for neurotransmission-en kraftig verktøy for å undersøke mekanismer og krets underliggende både naturlige og operant atferd i sanntid. Historisk har microdialysis vært ansatt å måle både elektrisk reaktive og nonreactive stoffer i ekstracellulære miljøet av hjernen1. Denne teknikken bruker en kontinuerlig strøm av en vandig løsning av lignende ioniske sammensetning ekstracellulære væsken, gjennom en microdialysis sonde består av en liten aksel med tips av en semipermeable hul fiber membran2. Etter innsetting av sonden, nevrotransmittere eller andre analytter rundt kan krysse semipermeable membran med passiv diffusjon før samles i intervaller på påfølgende analyse av høy ytelse flytende kromatografi (HPLC), en analytisk kjemi teknikk vanligvis benyttes separate, identifisere og kvantifisere komponenter i en heterogen blanding3.
Selv om microdialysis er en følsom teknikk som kan brukes til å måle nesten alle analytt rundt, er timelige oppløsningen lave, med maksimal samplingsfrekvenser på minutter titalls minutter1,2. Oppfinnelsen av rask skanning sykliske voltammetry (FSCV), en teknikk som bruker redoks potensialet av electroactive Art, kan belyse nær øyeblikkelig konsentrasjoner av analytt rundt i ekstracellulære væske. I korte trekk (se Robinson et al. 4 for en omfattende gjennomgang), en elektrode brukes til å heve og senke spenningen i en trekantet bølge mote på raske tid skala4. Når spenningen er i riktig område, er sammensatt av interesse gjentatte ganger oksidert og redusert. Dette oksidering og reduksjon resulterer i en bevegelse av elektroner som skaper en liten vekselstrøm. Skanne priser finner sted på sub-sekunders skala med oksidering og reduksjon av forbindelser forekommer i mikrosekunder. Ved å trekke bakgrunnen gjeldende opprettet av sonden fra resulterende gjeldende, kan man generere en spenning vs gjeldende tomten unike for hver sammensatte. Siden tidsskalaen i spenning svingninger er kjent, kan disse dataene brukes til å beregne en tomt på gjeldende som en funksjon av tid. Dermed bestemmes relative konsentrasjonen av sammensatte antall elektroner overført i hver oksidering og reduksjon reaksjon er kjent4.
Denne kjemiske spesifisitet og tidsmessige høyoppløselig gjør FSCV en kraftig teknikk for å oppdage endrer kjemiske konsentrasjoner i vivo. Men til tross for disse mangfoldige fordelene krever denne teknikken omfattende tekniske ekspertise og dyrt utstyr og oppsett. Videre ikke kan nonelectroactive nevrotransmittere (f.eks, glutamat) måles ved hjelp av denne teknikken. Heldigvis teknologiske fremskritt innen elektrokjemi5, i tillegg til kommersialisering av disse oppfinnelser, har introdusert en relativt enkel tilnærming til å måle ikke-electroactive nevrotransmittere i våken oppfører dyr uten akkord timelige presisjon-en teknikk kjent som enzymatisk biosensor teknologi. Denne teknikken bruker enzymatisk konvertering av nonelectroactive nevrotransmitter rundt i to underlag, hvorav ett er electroactive hydrogenperoksid som gjenkjennes som en amperometric oksidasjon gjeldende generert av en anvendt potensial5 . Tilsvarede biosensor sonder måle (se figur 1) selektivt analytter rundt konkurransedyktig reduserer bidrag av endogene interferents. I tilfelle av glutamat reduseres bidrag av den felles interferent askorbinsyre (AA) konkurransedyktig til målt gjeldende co lokalisere AA oksidase på aktive enzymatisk overflaten av sensoren, konvertere AA til ikke-electroactive dihydroascorbate og vann. I tillegg ekskluderer et negativt ladde Nafion polymer lag tilstede under enzym laget endogene anionic forbindelser.
Denne samme biosensor eksperimentelle oppsett kan måle electroactive signalstoffer som FSCV, men i stedet den benytter en fast potensial opptak6. I motsetning til oscillerende spenningen brukt i FSCV, i en fast potensial innspilling holdes spenningen på av redoks potensial for analytt rundt. Selv om det er mindre kjemisk selektiv enn FSCV som flere nevrotransmittere kan ha den samme redoks potensial, i hjernen områder som overveldende skew mot en nevrotransmitter, oppveier nøkkelferdige natur denne tilnærmingen mangel på kjemisk spesifisitet.
Muligheten til å måle både electroactive og nonelectroactive nevrotransmitter utgivelse i nær sanntid og koble den til spesifikke atferdsmessige hendelser gir en mulighet til å undersøke konvergerende nevrotransmitter-løslate. Dette manuskriptet detaljer bruken av dette systemet kontrollerer både dopamin og glutamat neurotransmission svar på naturlige belønning i våken oppfører hamstere. Målet med denne utredningen er å detalj prosessen med måler denne nevrotransmitter-løslate under seksuell atferd i kvinnelige hamsters, med mål å demonstrere sin mulighetsstudie for å undersøke andre atferd og eksperimentelle paradigmer.
Hamsters er en ideell modell for bruk i elektrokjemiske innspillinger
Historisk har rotte og mus modeller vært ansatt i studiet av seksuell atferd. Disse gnagerarter engasjere seg i en dynamisk copulatory rekkefølge, med mange kvinnelige oppfordring atferd som hopper, darting og øret wiggling å lokke mann jage og til slutt mount kvinnelige7. Montering av mannlige (med eller uten vaginal penetrasjon) varer bare noen få sekunder, hvor kvinnelige engasjerer i henne seksuell atferd holdning (kalt lordosis) også bare for et par sekunder før gjenoppta aktive oppfordring atferd. Dette mønsteret av atferd, består av høye nivåer av aktivitet ispedd korte perioder av ubevegelighet, er problematisk for å måle neurotransmission i oppføre dyr. Først, kan det være bevegelse gjenstander i amperometric opptak som er relatert til nevrale aktivitet. Andre er bevegelse knyttet til utgivelsen av bestemt nevrotransmittere i visse områder av hjernen. For eksempel har dopamin utgivelsen vært kombinert locomotor aktivitet i rygg- og ventrale striatum8,9, et funn som dannet grunnlaget for microdialysis målinger av dopamin etter psykostimulerende administrasjon10. Fordi den kvinnelige-typiske oppfordring atferd i most gnagere involverer høye nivåer av locomotor aktivitet, og representeres av mesteparten av en 10 minutters seksuell atferd, dette gjør det vanskelig å tilskrive endringer i neurotransmission til eksplisitt komponentene i seksuell oppførsel som kollektivt bare varer minutter.
Analysere nevrokjemiske profilen til kvinnelige seksuell atferd, oppsøkte denne lab Art der det er minimal locomotor aktivitet følger seksuell atferd. Den copulatory sekvensen i syrer hamsters (Mesocricetus auratus) er ideell for nevrokjemiske opptak skyldes mangel på oppfordring oppførsel vanligvis sett i rotter og mus11. Som en konsekvens, vil kvinnelige hamstere legge inn og vedlikeholde lordosis stilling i overkant minutter av en 10-minutters testing økt12. Med mangel på uvedkommende locomotor bevegelser av kvinner, i vivo fås elektrokjemiske innspillinger som kan knyttes til komponenter av seksuell interaksjon med mannlige.
Copulatory utbrudd i hamstere
Etter innføringen av mannlige stimulans dyr i testing kammeret, vil mannlige utgangspunktet engasjere seg i anogenital undersøkelser (AI) av kvinnelige før montering hennes (figur 2A). For at den mannlige montere, må kvinnelige anta en lyttende seksuell holdning kalles lordosis, der hun buer hun tilbake og deflects henne hale slik at montering mannlige får penile tilgang til hennes vagina. Mannlige vil montere den kvinnelige, slår henne bakfjerding med begge to paws (figur 2B), og begynne stakk i et forsøk på å få penile intromission (figur 2C). Mannlige vil montere kvinnelige (uten innsettingspunkt) samt intromit flere ganger før slutt å oppnå utløsning. Denne aktivitetssekvensen monterer og intromissions fører til utløsning kalles "copulatory bout". Menn vil ha flere copulatory anfall innenfor en enkeltøkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle prosedyrene som er beskrevet her ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av The University of Minnesota, og er i samsvar med The Guide og bruk av forsøksdyr 13 .
1. dyr og Cannulation kirurgi
- motta syriske hamsters fra en vanlig dyr leverandør på ca 55 dager gammel.
Merk: Selv om en alder av dyr vil variere på grunn av begrensninger av ulike eksperimentelle paradigmer, for seksuell atferd er det viktig å få seksuell modne dyr som er alt omtrent samme alder. - Huset dyr i en kontrollert temperatur (22 ° C) og belysning (14 h lys etterfulgt av 10t mørk med lys på 13:00 h) miljø, med mat og vann tilgjengelig annonsen libitum bortsett fra i perioder med eksperimentelle tester.
Merk: Siden hamstere sesongmessig reprodusere, denne 14:10 lys/mørke syklus etterligner deres naturlige avl forhold. - Etter en 1-week acclimation å laboratoriet, utføre aseptiske bilaterale ovariectomies og intrakranielt stereotaxic cannulations under generell anesthesia (f.eks, pentobarbital) og administrere riktig institusjonelt-godkjent postoperativ smertestillende og antibiotika behandling som tidligere beskrevet 14 , 15.
Merk: For studier av seksuell atferd, ovariectomies er nødvendig å fjerne store endogene kilden kjønnshormonene slik at dyr kan jevnt induserte å seksuell mottagelighet med eksogene hormon i samsvar med eksperimentelle tidslinjen.- For både dopaminergic og glutamatergic sonde implantasjon, stereotaxically implantatet guide cannulae (0,7 mm diameter; Figur 3) i området av interesse (f.eks dette laboratoriet rettet rett nucleus accumbens (NAc)) som beskrevet i gradvis detaljer andre steder 15.
Merk: Selv om dataene som presenteres er enkelt sensor opptak av en glutamat eller dopamin sonde per dyr, dette systemet lar for samtidig opptak av opptil 4 sensorer i en enkelt dyr; Dermed kan 1-4 cannulae bli implantert avhengig av ønsket eksperimentell design og resultater.- Finne implantat koordinatene til regionen rundt ved hjelp av en stereotaxic atlas (f.eks Golden Hamster Brain av Morin & tre), å holde i tankene at sensoren utvider 1 mm under kanyle inn hjernevev.
- Etter en kanyle senkes stereotaxically dorsal ventrale dit, fester den til skallen med en cap laget av dental akryl, sikret med rustfritt stål bein skruer og en plast hode-montere ( Figur 3 ; se 15 for mer informasjon).
- For karbonfiber testing, setter du inn en referanse elektrode (350 μm diameter, 7,5 mm lengde) i den kontralateral halvkulen.
NOTE En bestemt lokasjon eller avstanden fra kanyle er ikke påkrevd. Referanse elektrodene kan plasseres hvor som helst på den kontralateral halvkulen som er praktisk.
- For både dopaminergic og glutamatergic sonde implantasjon, stereotaxically implantatet guide cannulae (0,7 mm diameter; Figur 3) i området av interesse (f.eks dette laboratoriet rettet rett nucleus accumbens (NAc)) som beskrevet i gradvis detaljer andre steder 15.
2. Biosensor og karbonfiber Testing
- etter 1-uke frisk fra kirurgi, administrere hormon grunning diett for å indusere seksuell mottakelighet.
- Injisere 10 µg av østradiol benzoate i 0,1 mL cottonseed olje subcutaneously (SC), ca 48 timer og 24 timer før seksuell atferd testing, for å indusere seksuell mottagelighet mot mannlige 11.
- Injisere 500 µg av progesteron i 0,1 mL cottonseed olje, SC, 4 h før innføringen av den mannlige å indusere seksuell mottagelighet 11.
- Teste alle dyrene ved starten av den mørke fasen av deres daglige syklus, som atferd av gnagere kan bli endret under hvitt lys og rød lys testing forhold 16 , 17 , 18.
- for enzymatisk biosensor glutamat testing, kalibrere den sensorer i vitro ( Figur 4) før bruk som beskrevet tidligere 15 , 19.
- gjør kalibreringen løsninger friskt på dagen av testing i 20 mL glass sentrifuge rør. For det analytt oppløses 7,4 mg av L-Glutaminsyre i 10 mL av ultra ren H 2 O ved å forsiktig snu røret. Gjøre interferent løsningen ved oppløsning 176.1 mg AA i 10 mL av ultra ren H 2 O.
- Satt opp for kalibrering ved å plassere en magnetisk rørestang på bunnen av en grunnleggende lab ring stand. Plasser en 20-mL jacketed kanne på toppen av det magnetisk rørestang, og klemme på plass ved hjelp av en middels 2-spiss klemme.
- Add en magnetic røre bar og 20 mL 100 mM fosfat bufret saltvann (PBS) til jacketed begeret. Koble jacketed begeret til en sirkulerende vannbad varmer buffer løsning på 37 ° C.
Merk: Enzymatisk biosensor kalibreringer må utføre kroppstemperatur enzymatiske aktiviteten påvirkes av temperaturen.
- Add en magnetic røre bar og 20 mL 100 mM fosfat bufret saltvann (PBS) til jacketed begeret. Koble jacketed begeret til en sirkulerende vannbad varmer buffer løsning på 37 ° C.
- Plasser sensor kalibrering holderen på jacketed begeret, og sette en 4-kanals kalibrering forforsterker på toppen, sikring i stedet bruker en rettvinklet klemme. Koble forforsterker til en data condition og oppkjøp enhet til posten kalibrering data.
- Tester følsomheten til hver enzymatisk biosensor glutamat (eller andre analytter av interesse for andre tilsvarede biosensor sonder f.eks glukose) før eksperimentelle innspillingen ved å plassere sonde inn i kalibrering holderen på toppen av en Jacketed beaker, submerging sensing hulrom og en del av sølv klorid (AgCl) referanse ledningen i buffer løsning.
- Før du kobler hver sensor (opptil 4) testet til en port på en 4-kanals kalibrering forforsterker, starte et nytt opptak på datamaskinen grensesnittet benytter gratis nedlastbare Kjøp programvare. Tillate sensorer til en stabil baseline.
- Begynne å legge analytt injeksjoner når sensorer har nådd en stabil plan. Bruke hullet i kalibrering innehaveren for å innføre en pipette tips til buffer løsning. Bruk merknadsverktøyet rask viktig i innspillingen programvare for å kommentere når en injeksjon.
- Gjøre 10 µM tillegg av glutamat av pipettering 40 μL analytt løsningen i buffer løsning. Vent for sensoren å stabilisere mellom tillegg. Legge 3 injeksjoner analytt løsning før du legger til en enkelt injeksjon fra interferent AA løsning (50 μL injeksjon volum for 250 μM endring i konsentrasjon).
Merk: Kalibreringen kan for konvertering av endringene i amperometric signalet (sett under enzymatisk eksperimentelle innspillingen i trinn 2.12) til endringer i glutamat konsentrasjon, om ønskelig. Se referanse 15 for trinnvis instruksjon. Dopaminergic sonder brukes av dette laboratoriet er kalibrert under produksjonsprosessen av kommersielle leverandøren. Glutamat sonder må kalibreres ved bruk som deres følsomhet kan redusere over tid som enzymatisk komponentene fornedre 19. Fordi karbonfiber elektrodene ikke gjennomgår fornedrelse, er kalibrering utført av selskapet før forsendelsen tilstrekkelig sammen som tHer er en økt sannsynlighet for å skade den tynne karbonfiber (350 μm diameter) gjennom flere håndtering.
- Gjøre 10 µM tillegg av glutamat av pipettering 40 μL analytt løsningen i buffer løsning. Vent for sensoren å stabilisere mellom tillegg. Legge 3 injeksjoner analytt løsning før du legger til en enkelt injeksjon fra interferent AA løsning (50 μL injeksjon volum for 250 μM endring i konsentrasjon).
- Linje test chamber med sengetøy tatt fra dyr ' s hjem buret.
Merk: Dette øker kvinnelige ' s kjennskap testing kammer, samt viser mann seksuell stimulerende olfactory parring signaler som ble distribuert av kvinnelige svar østradiol behandling. - Lett bedøve dyrene før innsetting av sonden enten isoflurane eller en annen flyktige bedøvelse i en induksjon kammer.
- Fjerne av occlusive obdurator fra guide kanyle, og sett inn enten karbonfiber elektrode eller enzymatisk sonde gjennom guide akselen.
- Etter sonde innsetting, plassere dyret i den teste chamber.
Merk: Dette laboratoriet bruker en 10-gal glass akvariet (24,5 x 48.9 x 29,4 cm), men runde kammer av lik området kan også anvendes. - Begynner innspillingen video og tid-låst amperometric signalet i et kommersielt tilgjengelig program beskrives i detalj andre steder 15.
- Koble sensoren til opptak: potentiostat via en elektrisk skjermet kabel og en elektrisk dreies. Stabilisere sensor tilkoblingen Drei en pin vedlegg på hodet mount. Forsterke nettverkstilkoblingen lab filmen eventuelt.
Merk: En tilpasset connector er nødvendig å legge både karbonfiber elektrode og referanse elektrode til potentiostat, mens enzymatisk glutamat sensorene kan kobles direkte til potentiostat. - Tillate sensoren til equilibrate i hjernen før eksperimentelle testing.
Merk: Balanse utsjekkingstidene varierer avhengig av hvilken innspilling sensor (f.eks enzymatisk sensorer krever 2-4 h balanse, mens karbonfiber elektroder krever bare ca 30 min). Hvis begge typer sensorer er implantert, equilibrate for lengre enzymatisk sensor gang. - Etter sensor balanse, innføre en stimulans mann i testing kammeret.
- Etter første fjellet med penile innsetting (betegnes intromission) av stimulans mannlige, fortsette innspillingen for en ekstra 10-30 minutter, avhengig av eksperimentelle målene.
- Etter atferdsmessige testing, koble kvinnelige ' s sensor.
- Fjerne begge hamsters fra testing kammeret. Fjerne sengetøy og rengjøre kammeret med 70% etanol.
Merk: På grunn av den korte balanse kreves for karbonfiber innspillinger, trinn 2.3-2.14 kan gjentas for å teste flere dyr på samme dag. I kontrast, fordi enzymatisk sensorene krever ca 4 h av balanse, teste eneste dyr per dag å begrense mulige Inter underlagt variasjonen skyldes forskjeller i dyr ' circadian tid på testing.
3. Offer og perfusjon
- etter avslutningen av test perioden, dypt bedøve kvinnelige testpersonen med en euthanizing agent (f.eks dette laboratoriet bruker en intraperitoneal injeksjon av 0,2 mL fenytoin og pentobarbital løsning) .
- Transcardially perfuse dyret med 25 mM PBS, pH 7.6, fjerne alle sirkulerende blod, etterfulgt av en 20 min fiksering med 4% paraformaldehyde-PBS.
- Fjerne hjernen og postfix i ~ 30 mL av 4% paraformaldehyde løsningen i et 50-mL konisk rør over natten.
- Store hjernen i 10% sukrose-PBS løsning til du er klar til seriell delen.
Merk: Hjerner kan lagres opp til 2 uker, med ukentlige sucrose løsning endringene for å unngå potensiell vekst av miljøgifter.
- Store hjernen i 10% sukrose-PBS løsning til du er klar til seriell delen.
- Seriell delen hjernen i 40 µm skiver gjennom implantert regionen med enten en frysing mikrotom eller kryostaten som tidligere beskrevet 19.
- Montere skiver serielt på kommersielt tilgjengelig lim-belagt lysbilder (eller se 20 å gjøre). La det tørke, minst natten.
- Stain lysbildene med cresyl fiolett farge, klar, og dekkglassvæske som tidligere beskrevet 20.
- Image lysbildene med lyse feltet mikroskopi for å bekrefte anatomiske plasseringen av sensoren.
4. Atferdsmessige koding
- vise og kommentere video benytter ledig kommersielt nedlastbar programvare (se Tabell for materiale) i sakte film til nettopp koden atferd tid-låst på amperometric signalet.
Merk: Å bruke MATLAB kode i analysen (se nedenfor ), kommentere start og slutt av kvinnelige ' s og mannlige ' s atferd.- Annotate startLordosis i rammen når kvinnelige starter en dorsoflexion av ryggen og mangler hennes halen oppover. Kommentere endLordosis når kvinnelige avslutter denne holdning, som ofte oppstår når kvinnelige justerer til et annet sted i den teste chamber.
- Kommentere startAI når kvinnen er i lordosis holdning og mannlige flytter sin snute mot kvinnelige ' s anogenital-regionen, hvor sniffing, licking eller nuzzling hennes perineal regionen kan oppstå. Kommentere endAI når mannlige fjerner sin snute fra nærhet til kvinnelige ' s anogenital regionen.
- Kommentere startMount når mannlige tilnærminger og hans forepaws på kvinner i en montering holdning, uavhengig av retningen på mount forsøk (f.eks, side, bakdel).
- Kommentere startIntromission når vellykket stakk får montert mannlige penis tilgang til kvinnelige ' s vagina.
Merk: En intromission er behaviorally skilles fra den monterte stakk som oppstår før intromission, som mannlige synlig trekker sine øvre lemmer mot kroppen, kaster sine bekkenet frem og krøller halen oppover, indikerer penetrasjon (se < sterk class = "xfig" > figur 4 C).- Eventuelt kommentere utløsning.
Merk: På slutten av parring og i forbindelse med en vellykket intromission, mannen vil ejakulerer. Selv om en ikke klarer å visualisere faktiske utslipp, mannlige hamstere har en karakteristisk trår bevegelse med deres bakben fot under intromission 21, dermed kommentere utløsning på forekomsten av foten bevegelsen.
- Eventuelt kommentere utløsning.
- Kommentere endIntromission og endMount samtidig i rammen når hannen har fjernet forlabbene to og dermed ikke har kontakt med kvinnelige. På grunn av hyppige manglende evne til å visualisere sin tilbaketrekking, samtidig kode disse to atferd i Tillat for stabiliteten av parring utbrudd.
Merk: En parring bout enten følger en vellykket utløsning eller når kvinnelige bryter lordosis holdning etter minst én montere.
5. Eksempel dataanalyse
Merk: bruk av fast potensial karbonfiber og enzymatiske innspillinger for dopamin ennd glutamat, henholdsvis gir muligheten til å måle både tonic og phasic mønstre av elektrokjemiske utgivelsen. Dette laboratoriet bruker en gratis, kommersielle anskaffelse system og programvare for å spille inn og konvertere innspilt signaler fra analog til digital (skjevhet 0.600 V, samplingsfrekvens = 1 Hz).
- Beskrivelse av eksempel data analyse protokollen
- selv om andre programmer kan brukes, kvantifisere tonic og phasic (midlertidig) endringer i registrert elektrokjemiske signalet bruker MATLAB.
- Presentert dataene, beregne tonic signalet med en 50-punkts bevegelige filteret. En forbigående bare normalisert representasjon av signalet ble beregnet ved å trekke tonic signalet fra rådataene. Når identifisere phasic topper, har ulike algoritmisk alternativer (f.eks merking topper som endringer i mer enn 1-signalet SD over gjennomsnittet).
- Identifisere områder av disse toppene, dvs, lokale maxima, fra normalisert signalet bruker MATLAB funksjonen peakfinder med minimum peak amplituden satt til root-betyr-torget på signalet. Plasseringen av toppene oppdaget fra normalisert signalet ble brukt til å trekke ut amplituden fra hver topp. Evnen til å gjenkjenne toppene gir mulighet for identifisering av noen gang-låst atferd som kan være sammenfallende med, eller kjøre den relative toppen i nevrokjemiske under etterforskning.
- Segmentet behandlet i samsvar med atferdsdata merknadene (se trinn 3), en Student ' s t-test ble brukt til å evaluere forskjeller i tonic nevrotransmitter nivået og forekomsten av transienter amplituden til transienter under den pre parring bout lordosis versus lordosis under parring utbrudd. For å måle endringer tonic bruksmønstre elektrokjemiske utgivelsen, var datapunktene forekommer under Lordosis posisjon rett før parring bout (dvs., pre parring bout lordosis) forhold til datapunktene under parring bout ved hjelp av en t-test
- selv om andre programmer kan brukes, kvantifisere tonic og phasic (midlertidig) endringer i registrert elektrokjemiske signalet bruker MATLAB.
- Utarbeidelse av rådata for beskrevet data analyse protokollen
Merk: som nevnt, selv om andre programmer eller analyser kan være like levedyktige alternativer, for å bruke MATLAB kode beskrevet ovenfor, rådata må være forberedt i på følgende måte:- eksportere merknader og spenning filer. Å gjøre dette, under den ' filen ' kategorien velger den ' eksport '-funksjonen og velg den ' merknader ' kategorien lagre merknadene. Under den ' filen ' kategorien velger den ' eksport ' funksjonen og velg den " TSV ' kategorien lagre spenning målinger som filtypen TSV filtypen.
- Åpne hver fil med et regnearkprogram og lagre som ' xls/xlsx ' å gjøre filene kompatibelt med MATLAB.
Merk: Hvis den ' merknad ' arkiv, ekstra merknader som må manuelt lagt etter eksport i et regnearkprogram diktere start og slutt av både den pre parring bout lordosis (merket som PreMBlordorsis ) og paring kampen slik at disse tidspunkt kan sammenlignes direkte, som nevnt i trinn 5.1.2. - Kommentere starten av pre parring bout lordosis (startPreMBlordosis) på samme tid som en lordosis atferd (startLordosis) som også inkluderer en montere atferd, og også i begynnelsen av en ny parring bout hvis kvinnelige forblir i lordosis holdning.
- Kommentere slutten av pre parring bout lordosis (endPreMBlordosis) når den første montere begynner.
- Kommentere starten av mating (startMB) ved samme endPreMBlordosis, så dette betyr starten av parring.
- Kommentere slutten av mating (endMB) på enten slutten av en montere som inkluderer en utløsning (se trinn 4.1.4.1), eller etter kvinnelige ' s oppsigelse av lordosis holdning (endLordosis).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruker den elektrokjemiske og atferdsmessige koding metodikk beskrevet ovenfor, har dette laboratoriet begynt å karakterisere både tonic og phasic svingninger i både dopamin og glutamat under i vivo opptak av seksuell atferd. På grunn av tidsmessig presis måte av denne metoden, kan vi mer nøyaktig karakterisere neurotransmission under seksuell oppførsel; samt tillegge bestemte endringer i utgivelsen mønstre tilsvarende tonic endringer under parring utbrudd, og tilsvarende forbigående svingninger i kvinnens mottak av personlige copulatory atferd (f.eks, intromission, ejakulasjon) fra det montering mannlige.
Spesielt brukt vi denne metodikken for å fokusere på å måle utgivelsen mønstre av dopamin og glutamat i NAc egne dyr. NAc er et kritisk område involvert i belønning behandling22 og har blitt beskrevet som en integrert region i belønning aspekter av seksuell atferd23.
Vi observerte at under seksuell atferd, kvinner vise en tonic økning i dopaminergic nivåer i NAc kjernen under parring anfall (figur 5). Mens endringene tonic kan vises for alle parring utbrudd, metodikk beskrevet ovenfor måle tonic endringer mellom hver parring kamp, og dermed øke timelige identifikasjon av generelle endringer tonic nivåer av nevrotransmitter-løslate gjennom hele økten. Videre kan denne beskrevet metodikken finne phasic endringer og timelig kart atferd sannsynligvis disse phasic nevrotransmitter svingninger. Spesielt tyder disse foreløpige resultatene på at under parring utbrudd, dopaminergic transienter i NAc oppstå under vaginal innsetting (intromission) av mannlige (figur 6). Videre, denne tilknytningen med intromission er bestemt, med ubetydelig dopaminergic svar på andre copulatory atferd, som AI.
Et lignende mønster er observert i andre dyr med hensyn til glutamat utgivelse, rask transienter som samsvarer med individuelle intromissions i dorsal NAc kjernen under en copulatory kamp (figur 7). Dette mønsteret er bestemt, med ingen synlig signal forekommer i NAc skall eller mediale caudate av andre dyr.
Figur 1 : Enzymatisk Biosensor teknologi.
Standard fabrikasjon av kommersielt tilgjengelig enzymatisk biosensor sonder som oppdager nevrotransmittere via enzym-mediert behandling (venstre bilde). Ved glutamatergic sensorer, glutamat oksidase er ansatt i enzymatisk laget (høyre bilde) konvertere nonelectroactive nevrotransmitter til electroactive hydrogen peroxide (H2O2) som oppdages av oksidering på den platina-iridium (Pt-Ir) elektroden. Askorbinsyre (AA), en felles interferent som er oksidert på samme potensialet, er utelukket via et tillegg på AA oksidase på enzymatisk laget som konverterer interferent til nonelectroactive vann. Andre negative electroactive interferents i hjernen er utelukket via en passiv selektiv membran. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Komponentene i en Hamster parring Bout.
I hamsters består parring bout av en rekke copulatory atferd, der hunnen forblir i immobile lordosis holdning mens den mannlige anogenitally undersøker (A), monterer (B)og oppnår intromission (C). . En intromission er behaviorally skjelnes fra montering som mannlige trekker sine øvre lemmer mot kroppen, kaster sine bekkenet frem og krøller hans halen oppover, indikerer penetrasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Skull Cap konstruksjon.
Guide cannulae, bein skruer og dental akryl brukes i byggingen av en hodeskalle cap for å tillate innsetting av karbonfiber eller enzymatisk sonde (se15 for trinnvis detaljer). Denne illustrasjonen viser et enkelt kanyle implantat over høyre NAc for en enzymatisk sensor (ingen implantert referanse elektrode) og plast hodet montere for sensoren stabilitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Glutamat Biosensor kalibrering.
Følsomheten til hver biosensor til glutamat er testet i vitro før eksperimentelle innspillingen med 10 µm tillegg av glutamat (grønn) på 37 ° C (siden enzymatiske aktiviteten påvirkes av temperatur). Hver sensor er bekreftet for å være ikke-responsiv til askorbinsyre (AA, rød) eller dopamin (DA, blå). Denne kalibreringen tillater konvertering av endringer i amperometric signalet sett under eksperimentelle opptak til endringer i glutamat konsentrasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Tonic øker dopamin under parring Bout.
A. stiliserte eksempel premating bout lordosis signal vs parring bout lordosis signal. For å måle tonic dopamin utgivelsen, ble amperometric svar dopamin nivåer under lordosis før parring bout (MB) sammenliknet med dem under en MB. Grå bokser angir lordosis før en MB. BlUE bokser angir lordosis under en MB. B. representant kvantifisering fra en dyr sammenligne mener spenningen mellom preMB lordosis og MB lordosis. Feilfelt viser standard feil av gjsnitt (SEM) og stjerne angir betydelig forskjell (p-verdien < 0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Representant dopamin spor.
Phasic versjonen av dopamin er tid-låst til intromissions fra mannlige i dorsal NAc kjernen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Representant glutamat spor.
Glutamat transienter tilsvarer personlige intromissions fra mannlige i dorsal NAc kjernen under en utvidet seksuell opplevelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om det er relativt enkelt, kan noen problemer oppstå når ansette denne teknikken. Først stereotaxic plasseringen av sonder må være nøyaktig: i motsetning til microdialysis som en større radius av ekstracellulære miljøet rundt sonden, denne teknikken kan bare måling av en nevrotransmitter som kommer i direkte kontakt med sonde. Andre, i karbonfiber opptaket, på grunn av liten bredden av fiber, brudd kan oppstå, og proben må settes inn med bevisst omsorg. Ved glutamatergic biosensors, kan enzymatisk degradering oppstå hvis sonden ikke brukes i garanterte tidsrammen 3 uker. Heldigvis alle disse problemene er adresserbare, og kan fjernes med forsvarlig omsorg og oppmerksomhet på detaljer.
En potensielt problematisk påminnelse oppstår i spesifisitet av fast potensial karbonfiber innspillinger. Fordi anvendt potensialet for dopamin sammenfaller med andre monoamines, for eksempel noradrenalin, hvis på innspillingene i områder som løslate begge nevrotransmittere, enn denne mangelen kjemiske kan begrense tolkning av resultatene. I NAc utgjør dette ikke et stort problem, med dopamin blir de primære katekolaminer sender24. Fordi omtrent 98% av cellene i NAc er middels spiny nerveceller som svarer til dopaminergic neurotransmission24, signalet er forutinntatt mot påvisning av dopamin og forenkler bruken av denne mer turn-tasten.
En annen fordel med denne enzymatisk biosensor og fast potensial karbonfiber innspilling system er at dual-sonde opptak kan utføres, slik at både electroactive og nonelectroactive signalstoffer som Dopamin og glutamat kan måles i samme dyret samtidig. Selv om dataene som presenteres her kommer fra opptak i separate dyr, kan disse teknikkene brukes samtidig slik at man kan vurdere konvergens av neurotransmission i flere områder av hjernen eller i samme region bilateralt. Kombinasjonen av opptak innen samme dyret eller sammenligning av opptak over dyr som vist her, er begge kraftige verktøy i Klargjørende mekanismene bak nettverkstilkoblinger og signalering.
I sum viser dette papiret de kraftige teknikkene av enzymatisk biosensing og fast potensial opptak å måle flere electroactive og nonelectroactive nevrotransmittere utnytte enkel eksperimentelle oppsett. Selv om dataene presentert her kommer fra personlige nevrotransmitter opptak over flere dyr, dette systemet gir mulighet til å spille fra 4 sensorer i en dyr samtidig15. Prøven resultatene presentert kollektivt gir innsikt i rask neurotransmission i kvinnelig hamster fra bestemte bruksmønstre copulatory stimulering fra mannlige. Videre vise disse eksperimentene tid-låst svar av dopaminergic og glutamatergic transienter i NAc kjernen av kvinnelige intromission fra det mannlige, tyder på at denne versjonen kan være ansvarlig for koding distinkte givende egenskaper seksuell atferd. Vårt mål er å fortsette benytter parring mønsteret i kvinnelige syrer hamsters å utvikle et mer helhetlig bilde av forholdet mellom i vivo dopamin og glutamat utgivelsen og underliggende kretsene til enkeltkomponenter copulatory stimuli fra mannlige. Vi mener at muligheten til å karakterisere mønstre av disse nevrotransmittere ikke er bare gunstig fra en grunnleggende vitenskap perspektiv23, men også i Klargjørende potensielle terapeutiske metoder for patologisk former for belønning oppførsel slik som narkotika avhengighet25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke lavere Daniel Korus for hans hjelp kjører Matlab koden og lavere Alex Boettcher for hans hjelp i atferdsmessige eksperimenter som kjører. Prosjektet støttes av NSF IOS 1256799 til R.L.M., og ved National Institute on narkotikamisbruk av National Institutes of Health under prisen nummer T32DA007234.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nembutal | Oak Pharmaceuticals Inc. | 76478-501-50 | Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5 mg/100 g body weight, injected intraperotineally. |
| Loxicom analgesic | Norbrook Laboratories | 6451603670 | NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam. |
| Enroflox antibiotic | Norbrook Laboratories | 5552915411 | Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin. |
| Beuthanasia-D | Merck Animal Health | 00061047305 | Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent. |
| Bone screws | Pinnacle Technologies, Inc. | 8111-16 | 1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull. |
| Dental acrylic (Bosworth Duz-All) | Bosworth | 166261C | Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull. |
| Hardware biosensor setup | Pinnacle Technologies, Inc. | 8400-K2 | Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system |
| Base video computer package | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K1 | The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables. |
| Video EQ700 EverFocus camera package | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K10 | EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available. |
| Sirenia Acquisition software | Pinnacle Technologies, Inc. | Free--available to download from pinnaclet.com | Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review. |
| Tethered rat in vitro calibration kit | Pinnacle Technologies, Inc. | 7000-K2-T-BAS | In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051). |
| Stir plate | Corning | 6795-410D | Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors. |
| Water bath capable of closed loop circulation | PolyScience | 8006A11B | PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature. |
| Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae | Pinnacle Technology, Inc. | 7002-CFS | Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission. |
| Ag/AgCl reference electrode | Pinnacle Technology, Inc. | 7065 | Necessary for carbon fiber recordings. |
| Glutamate biosensors | Pinnacle Technology, Inc. | 7001 | Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission. |
| BASi guide cannulae | Pinnacle Technologies, Inc. | 7030 | Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe. |
| BASi cannula plastic headpiece for rats | Pinnacle Technologies, Inc. | 7011 | Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat. |
References
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 7, Unit 7.1.1-7.1.28 (2009).
- Chaurasia, C. S., et al. AAPS-FDA Workshop white paper: Microdialysis principles, application and regulatory perspectives. Pharm Res. 24 (5), 1014-1025 (2007).
- Lindsay, S., Kealey, D. High performance liquid chromatography. , John Wiley and Sons. New York, NY. (1987).
- Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo. Clin Chem. 49 (10), 1763-1773 (2003).
- Hu, Y., Mitchell, K. M., Albahadily, F. N., Michaelis, E. K., Wilson, G. S. Direct measurement of glutamate release in the brain using a dual enzyme-based electrochemical sensor. Brain Res. 659 (1-2), 117-125 (1994).
- Agnesi, F., et al. Wireless instantaneous neurotransmitter concentration system-based amperometric detection of dopamine, adenosine, and glutamate for intraoperative neurochemical monitoring. J Neurosurg. 111 (4), 701-711 (2009).
- Erksine, M. S. Solicitation behavior in the estrous female rat: A review. Horm Beh. 23 (4), 473-502 (1989).
- Weiner, I., Gal, G., Rawlins, J. N., Feldon, J. Differential involvement of the shell and core subterritories of the nucleus accumbens in latent inhibition and amphetamine-induced activity. Behav Brain Res. 81 (1-2), 123-133 (1996).
- Heidbreder, C., Feldon, J. Amphetamine-induced neurochemical and locomotor responses are expressed differentially across the anteroposterior axis of the core and shell subterritories of the nucleus accumbens. Synapse. 29 (4), 310-322 (1998).
- Pierce, R. C., Kalivas, P. W. Amphetamine produces sensitized increases in locomotion and extracellular dopamine preferentially in the nucleus accumbens shell of rats administered repeated cocaine. J Pharmacol Exp Ther. 275 (2), 1019-1029 (1995).
- Pfaff, D. W. Drive: Molecular and physiological analyses of a simple reproductive behavior. , The M.I.T. Press. Cambridge, MA. (1999).
- Carter, C. S. Postcopulatory sexual receptivity in the female hamster: The role of the ovary and the adrenal. Horm Behav. 3 (3), 261-265 (1972).
- Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , The National Academies Press. New York, NY. National Research Council (2011).
- Meisel, R. L., Camp, D. M., Robinson, T. B. A microdialysis study of ventral striatal dopamine during sexual behavior in female Syrian hamsters. Beh Brain Res. 55 (2), 151-157 (1993).
- 4 Channel EEG/EMG/Biosensor Manual V005. , Pinnacle Technology. (2012).
- Pellis, S. M., Pellis, V. C. Play-fighting differs from serious play fighting in both target of attack and tactics of fighting in the laboratory rats Rattus norvegicus. Aggress Behav. 13 (3), 227-242 (1987).
- Pellis, S. M., Pellis, V. C. Differential rates of attack, defense and counterattack during the developmental decrease in play fighting by male and female rats. Dev Psychobiol. 23 (3), 215-231 (1990).
- Pellis, S. M., Hastings, E., Shimizu, T., Kamitakahara, H., Komorowska, J., Forgie, M. L., Kolb, B. The effects of orbital frontal cortex damage on the modulation of defensive responses by rats in playful and non-playful social contexts. Behav Neurosci. 120 (1), 72-84 (2006).
- Wakabayashi, K. T., Kiyatkin, E. A. Rapid changes in extracellular glutamate induced by natural arousing stimuli and intravenous cocaine in the nucleus accumbens shell and core. J Neurophysiol. 108 (1), 285-299 (2012).
- Kapelsohn, K. I. Improved methods for cutting, mounting, and staining tissue for neural histology. Protoc Exch. , (2015).
- Siegel, H. I. Chapter 7: Male sexual behavior. The Hamster: Reproduction and Behavior. , Plenum Press. New York, NY. (1985).
- Day, J. J., Carelli, R. M. The nucleus accumbens and pavlovian reward learning. Neuroscientist. 13 (2), 148-159 (2007).
- Meisel, R. L., Mullins, A. J. Sexual experience in female rodents: Cellular mechanisms and functional consequences. Brain Res. 1126 (1), 56-65 (2006).
- Meredith, G. E., Pennartz, C. M., Groenewegen, H. J. The cellular framework for chemical signaling in the nucleus accumbens. Prog Brain Res. 99, 3-24 (1993).
- Hedges, V. L., Staffend, N. A. Neural mechanisms of reproduction in females as a predisposing factor for drug addiction. Front Neuroendocrinol. 31 (2), 217-231 (2010).
