Summary
Een methode voor massaspectrometrische analyse van endogene peptiden in menselijke cerebrospinale vloeistof (CSF) wordt gepresenteerd. Door molecuulgewicht cut-off filtratie, chromatografische pre fractionering, massaspectrometrische analyse en een daaropvolgende combinatie van peptide identificatie strategieën, bleek het mogelijk om uit te breiden van de bekende CSF peptidome bijna tien keer in vergelijking naar eerdere studies.
Abstract
Dit protocol beschrijft een methode ontwikkeld om het identificeren van endogene peptiden in menselijke cerebrospinale vloeistof (CSF). Voor dit doel, een eerder ontwikkelde methode gebaseerd op moleculair gewicht cut-off (MWCO) filtratie en massaspectrometrische analyse werd gecombineerd met een off line high-pH omgekeerde fase HPLC pre fractionering stap.
Secretie in CSF is de belangrijkste route voor verwijdering van moleculen werpen door cellen van het centrale zenuwstelsel. Dus, veel processen in het centrale zenuwstelsel worden weerspiegeld in het CB, waardoor zij een waardevolle diagnostische vloeistof. CSF heeft een complexe samenstelling, die eiwitten bevatten die een concentratiebereik van 8-9 ordes van grootte beslaan. Naast eiwitten, hebben vorige studies ook aangetoond van de aanwezigheid van een groot aantal endogene peptiden. Terwijl minder uitgebreid bestudeerd dan eiwitten, kunnen deze ook potentieel belang houden als biomarkers.
Endogene peptiden werden gescheiden van het eiwitgehalte van CSF via MWCO filtratie. Door het verwijderen van een meerderheid van het eiwitgehalte van het monster, is het mogelijk om het monstervolume studeerde en daarmee ook het totale bedrag van de endogene peptiden. De complexiteit van het mengsel gefiltreerd peptide werd aangepakt door met inbegrip van een omgekeerde fase HPLC (RP) pre fractionering stap bij een alkalische pH vóór de LC-MS-analyse. De fractionering werd gecombineerd met een eenvoudige samenvoeging regeling waar 60 breuken werden gebundeld in 12, analyse tijd consumptie kon worden vermindert terwijl het nog steeds grotendeels vermijden co elutie.
Geautomatiseerde peptide identificatie werd uitgevoerd met behulp van drie verschillende peptide/eiwit identificatie softwareprogramma's en de resultaten vervolgens te combineren. De verschillende programma's werden aanvullende in plaats van vergelijkbaar met minder dan 15% van de identificaties overlappen tussen de drie.
Introduction
Biomarkers in cerebrospinale vloeistof (CSF) zijn momenteel onderzoek omzetten in neurodegeneratieve aandoeningen. In de ziekte van Alzheimer, de meest voorkomende neurodegeneratieve stoornis, die meer dan 60 miljoen mensen wereldwijd1,2, een biomarker triplet, bestaande uit de peptide bèta amyloid, microtubulus-stabiliseren eiwit tau, en een phosphorylated tau vorm, de ziekte kan detecteren met hoge gevoeligheid en specificiteit en is opgenomen in de criteria van het diagnostisch onderzoek3. In andere neurodegeneratieve ziekten, zoals Parkinson en Multiple sclerose, hebben proteomic studies vastgesteld talrijke biomerker kandidaten, waarvan sommige momenteel onder evaluatie in klinische studies4,5 zijn ,6.
Naast eiwitten bevat CSF ook een overvloed van endogene peptiden7,8,9,10,11,12. Splitsingsproducten van veel eiwitten van hersenen-afgeleide vormen, vertegenwoordigen deze peptiden ook een potentieel belangrijke bron van ziekte biomarkers. Verhogen van de inventaris van de geïdentificeerde endogene peptiden in menselijke CB en inschakelen van CSF endopeptidomic analyses in klinische studies, een methode ontwikkeld voor de bereiding van de monsters en LC-MS-analyse (een kort protocol-regeling is opgenomen in afbeelding 1 ). De toepassing van deze methode in een recente studie heeft geleid tot de identificatie van bijna 16,400 endogene CSF peptiden in samengevoegde CSF monsters van meerdere personen van niet-specifieke diagnose, uitbreiding van de bekende CSF endopeptidome tienvoudige13. De methode kan optioneel worden gebruikt in combinatie met isobaar etikettering aanpak voor kwantificering.
Bereiding van de monsters
De belangrijkste bron van eiwit massa van CB is plasma bestanddelen (bv albumine en immunoglobulinen) passeren over de bloed hersenen barrière14,15. Hun hoge overvloed belemmert de detectie van lage-overvloedig, hersenen-afgeleide monster onderdelen. Endogene peptiden kunnen gemakkelijk worden gescheiden van de hoge-overvloedig eiwitten, waardoor een aanzienlijk grotere hoeveelheid CSF peptide extract te worden gebruikt bij LC-MS-analyse, zodat detectie van lagere-overvloedig peptiden.
In het protocol hier gepresenteerd, werd molecuulgewicht cut-off (MWCO) filtratie gebruikt voor het scheiden van de CSF peptiden van de eiwitoplossing; een methode die is gebruikt in verscheidene vorige studies8,9,10,11,12,16. De filtratie stap werd gevolgd door een off line RP HPLC pre fractionering stap uitgevoerd via een hoge-pH mobiele fase verloop. Door het uitvoeren van twee RP HPLC stappen in tandem, met pH wordt het belangrijkste onderscheid, resulteert het verschil in selectiviteit tussen de twee stappen hoofdzakelijk uit veranderde peptide retentie als gevolg van verschillende peptide gratis Staten. De toepassing van hoge-pH peptide pre fractionering vóór LC-MS onder zure omstandigheden heeft bewezen efficiënt bij het vergroten van de peptide identificatie17,18, en zelfs te zijn superieur voor dit doel in complexe biologische monsters in vergelijking met meer orthogonale scheiding modi19, zoals sterke cat-ion exchange (SCX) en RP20. Als u wilt verkorten analyse, werd een aaneenschakeling regeling gebruikt, bundeling van elke 12th breuk (b.v., breuken 1, 13, 25, 37 en 49), die als gevolg van de hoog oplossend vermogen van RP-HPLC nog steeds grotendeels vermeden co elutie van peptiden van verschillende breuken in de LC-MS stap20,21.
Peptide identificatie
Peptide identificatie in peptidomic studies verschilt van proteomic studies in dat geen enzym decolleté kan worden opgegeven in de database zoeken, en dientengevolge, identificatie tarieven meestal lager11 zijn. Een recente studie13 bleek dat de identificatie-tarieven voor endogene peptides verkregen met Sequest en mascotte waren aanzienlijk verbeterd wanneer de standaard scoren algoritme van de respectieve softwareprogramma is bewerkt met behulp van het adaptieve scoren algoritme Percolator, die aangeeft dat optimale scoren algoritmen voor endogene peptides van al peptiden13 afwijken. In die studie, identificatie op basis van automatische peptide DOVO sequencing met behulp van de software van de PIEKEN (BSI) bleek te zijn complementair aan de twee fragment ion vingerafdrukken gebaseerde zoekmachines, wat resulteert in een aanzienlijk groter aantal geïdentificeerd peptiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol die hieronder beschreven is een verfijnde versie van de gebruikt in een eerdere studie waar een grote hoeveelheid endogene peptiden werden vastgesteld in menselijke CSF15. Updates voor het oorspronkelijke protocol betrekking hebben op kleine veranderingen in de chemische voorbehandeling van CB en optimalisatie van het verloop gebruikt voor off line high-pH RP HPLC pre fractionering.
Ethische overwegingen
Alle studies van Zweedse patiënt en controle materialen zijn goedgekeurd door de ethische commissies: St. Göran (ref. 2005-554-31/3). CSF monsters uit de Amsterdam dementie Cohort en monsters verzameld op de National Hospital voor neurologie en Neurochirurgie, Londen werden gebruikt voor onderzoek met schriftelijke toestemming van alle deelnemende patiënten en goedkeuring van de regionale ethische commissies. Het materiaal hier gebruikt voornamelijk bestond van overgebleven CB van monsters die zijn genomen met het oog op de diagnose en het was de geïdentificeerde voordat het wordt opgenomen in onze studies. Er is geen mogelijkheid voor het traceren terug het monster aan elke afzonderlijke donor of groep van donoren.
1. extractie van menselijke cerebrospinale vloeistof (CSF):
- Uittreksel van CSF via Lumbaalpunctie (moeten worden uitgevoerd door een getrainde arts) met behulp van een gestandaardiseerd protocol22.
- Verwijderen cel puin en andere niet-oplosbare materiaal door centrifugeren bij 2.500 x g gedurende 20 min.
- Inspecteer visueel of CSF monsters voor verkleuring die op een bloed besmetting als gevolg duiden van de punctie bloeden. De aanzienlijk hogere eiwitconcentratie in het bloed en de aanwezigheid van proteasen kan grote invloed hebben op de analyseresultaten.
2. voorbehandeling van CB (1,5 mL monstervolume, geen kwantificering):
- Ontdooi 1,5 mL CSF aliquots bij kamertemperatuur (RT), de inhoud overbrengen in polypropyleen tubes van 10 mL en voeg 80 µL van 1 M Triethylammonium bicarbonaat (TEAB) als een buffer agent.
- Toevoegen van 0,65 mL 8 M guanidinium hydrochloride (GdnHCl) (actieve concentratie GdnHCl: 2,4 M) en vortex zachtjes op RT gedurende 10 minuten.
Opmerking: De chaotropic-agent, GdnHCl, zowel beïnvloedt oplosmiddel viscositeit en communiceert met de polypeptide-keten, wat resulteert in eiwit ontvouwen worden energiek gunstige23. Dus GdnHCl lost eiwit-aggregaten en herstel van endogene peptiden toeneemt tijdens de daaropvolgende filtratie. - Voeg 60 µL van 200 mM van waterige tris(2-carboxyethyl) Fosfine hydrochloride (TCEP) (actieve concentratie TCEP: 6 mM) en Incubeer bij 55 ° C gedurende 1 uur te verminderen van cysteïne disulphides.
- Voeg 35 µL van 400 mM iodoacetamide (IAA) (actieve concentratie IAA: 4 mM) en Incubeer bij RT in duisternis voor 30 min van alkylate cysteines. De toevoeging van een alkyl-groep zorgt ervoor dat cysteïne residuen niet spontaan als nieuwe disulfide bruggen op elk gewenst moment tijdens de verdere bereiding.
- Voeg 3,25 mL-geïoniseerd water en vortex kort aan het monster vóór MWCO filtratie, wat resulteert in een totale steekproef volume van 5,5 mL verdund. Deze stap dient om te verdunnen van GdnHCl tot minder dan 1 M, zoals een hogere concentratie heeft waargenomen soms veroorzaken uitloging van polymere stoffen uit de filter-apparaten.
3. voorbehandeling van CB (10 x 150 µL monstervolume, isobaar etikettering-kwantificering):
- Ontdooi 150 µL van CSF aliquots van 10 personen op RT en vervolgens de inhoud overbrengen naar individuele 1,5 mL laag-bindende micro-centrifuge buizen en 8 µL van 1 M TEAB als een buffer agent toevoegen.
- Voeg 65 µL van 8 M GdnHCl (actieve concentratie GdnHCl: 2,4 M) en vortex zachtjes op RT gedurende 10 minuten.
- Voeg 6 µL van 200 mM van waterige TCEP (actieve concentratie TCEP: 6 mM) en incubatie bij 55 ° C gedurende 1 uur te verminderen van cysteïne disulphides.
- Toevoegen van 3,5 µL 400 mM waterige IAA (actieve concentratie IAA: 6 mM) en Incubeer bij RT en duisternis voor 30 min alkylate cysteines.
- Bereiden de isobaar etikettering kit (bv., Tandem massa Tag 10plex isobaar etikettering reagens). Laat de isobaar etikettering-reagens flesjes te bereiken RT vóór het openen van hen te vermijden geen onnodige reagens hydratatie, voeg 41 µL van HPLC-grade acetonitril (AcN) ontbinden door zachte agitatie voor 5 min.
- Breng 30 µL van isobaar etikettering-reagens oplossing aan het overeenkomstige monster en incubeer gedurende 1 uur bij RT onder zachte agitatie. Het isobaar etikettering reagens omvat een NHS-ester-groep die met de primaire amines bijwonen peptide N-termini en Lysine residuen reageert.
- Voeg 8 µL van 5% hydroxylamine (actieve concentratie hydroxylamine: 0,16%) en schud voorzichtig op RT voor 20 min om quench de etikettering reactie. Aangezien de afzonderlijk gelabelde monsters worden gecombineerd moeten, voor zorgen dat de etikettering reactie is uitgeblust. Door toevoeging van een overvloed aan amine groepen in de vorm van hydroxylamine, de resterende isobaar etikettering reagens is toegestaan om te reageren en zo inert is gerenderd.
- De inhoud van elk van de 10 individueel gelabelde monsters in een enkele 15 mL polypropyleen buis te combineren.
- 6.4 mL-geïoniseerd water toevoegen aan het gecombineerde monster en de vortex kort om de concentratie van de AcN van 12% tot 3% en de concentratie van GdnHCl GdnHCl op minder dan 1 M als een hogere concentratie geconstateerd kunnen soms veroorzaken uitloging van polymere stoffen van de filter-apparaten.
4. molecuulgewicht cut-off filtratie
- Ter opheffing van potentiële verontreinigingen, voorwaarde de MWCO filters door het laden van 10 mL waterige 1 M GdnHCl, 25 mM TEAB en centrifugeren gedurende 15 minuten op 2.500 x g en RT, negeren de doorstroming (FT).
- Laden van de hele monstervolume op het filter (5 mL niet-gelabelde CSF (stap 2.5) of 10 mL isobarically-gelabelde LIQUOR (stap 3.9)) en centrifugeer voor 30 min op 2.500 x g en RT, laat de doorstroming (FT) in de collectie container. Het resultaat van de filtratie is dat peptides en proteïnen van de kleine zijn gescheiden van de grotere proteïnen en resterende cel puin. Deze stap kan worden gezien als de peptidomic gelijk aan het gebruik van Proteolytische vertering van eiwitten voor het genereren van peptiden in proteomic experimenten.
- Laden 5 mL 25 mM TEAB (waterige) op de filters en Centrifugeer gedurende 15 min bij 2.500 x g en RT, teneinde het herstel van peptiden.
- Vortex de gecombineerde FTs van de vorige twee stappen (totaal 10 mL voor niet-gelabelde of 15 mL isobarically-gelabelde monster), en ga verder met monster verzuring.
5. de zouten en monster Clean-up door vaste fase extractie
- Breng de gefilterde monster uit stap 4.4 voorafgaand aan de vaste fase extractie (SPE). De verzuring is uitgevoerd ter verbetering van de interactie van de opgeloste stof (peptide) met de stationaire fase van de SPE-patroon.
- Voor de niet-gelabelde steekproef (volume 10 mL): 550 µL van 1% trifluorazijnzuur (TFA) - totale volume van het monster toevoegen: 10.55 mL met 0,05% TFA.
- Voor de steekproef isobaar-geëtiketteerd (volume 15 mL): Voeg 20 mL 0,1% TFA te Breng en AcN concentratie van 3% tot 1% - totale volume van het monster te verlagen: 30 mL met 0.066% TFA.
Opmerking: TFA is ook toegevoegd voor de functie als een reagens ion-koppeling, die verbetert de retentie van peptiden niet zelf staat sterk genoeg hydrofobe interactie met het verpakkingsmateriaal van de patroon van de SPE moet worden bewaard. - Als pH > 3, Titreer het monster met 20% fosforzuur tot monster pH is < 3.
- Conditie van de SPE cartridges door toevoeging van 1 mL van 84% AcN, 0,1% mierenzuur zuur (FA) en gooi de FT. eenmaal herhaald. Conditionering van de patroonfilter is vereist voor het verwijderen van ongewenste stoffen die anders zou Elueer samen met de peptiden in opeenvolgende stappen; verder, conditioning verhoogt permeabiliteit van het filter.
- De SPE cartridge equilibreer door toevoeging van 1 mL 0,1% TFA, negeren FT. herhalen eens. Zorgen dat het filter niet droog na de laatste stap van de evenwichtsinstelling werkt - houden van een klein volume op de top van het filter. Evenwichtsinstelling van de cartridge filter wordt uitgevoerd ter voorbereiding van het filter peptiden behouden doordat de hydrofobe stof (acetonitril) links van de stap van conditionering.
- Laden van de hele monstervolume (10.55 mL voor niet-gelabelde monsters of 30 mL isobarically-gelabelde monsters), in verschillende delen, indien nodig, en laat de FT afval tegenkomen. Zorgen ervoor dat de cassette niet droog lopen tussen monster laden rondes of nadat het laatste monstervolume heeft geladen - een klein volume op de top van het filter houden.
- Pass 1 mL 0,1% TFA via de filters te verwijderen van zouten en reagentia en negeren de FT. herhaling eens. Zorgen ervoor dat de cassette niet droog na elke stap wassen loopt - houden van een kleine hoeveelheid vloeistof op de top van de cartridge.
- Plaats 1.5 van mL lage bindende micro buizen onder de cartridge centrifugeren en elueer van het monster door het passeren van 1 mL van 84% AcN, 0,1% FA over de cartridge.
- Verwijder de oplosmiddelen uit het-gezouten monster door verdamping in een vacuüm centrifuge uitvoeren zonder actieve verwarming tot droog, opslaan bij-80 ° C of onmiddellijk overgaan tot hoge-pH fractionering.
6. off line high-pH omgekeerde fase HPLC monster fractionering
-
Bereiden waterige high-pH (HpH) mobiele fasen:
HpH Buffer A: Zuiver water
HpH Buffer B: 84% AcN
HpH Buffer C: 25 mM NH4OH
Laden van HpH buffer: 2.5 mM NH4OH, 2% AcN
Opmerking: HpH laden buffer wordt gebruikt als vervoer oplossing en monster buffer - Opnieuw het ontbinden van het monster in 16 µL HpH laden buffer door zachte agitatie voor 20 min
- Laden van 15 µL het monster op een HPLC-systeem met een interne breuk collector voor 96-diep-Wells-platen geconfigureerd volgens Batth et al. 20 met kleine veranderingen. Fractionate op een stroom van 100 µL/min boven een kolom houden pH-stable scheiding (C18 3,5 µm, 2.1 x 250 mm) en één deel per min verzamelen over het verloop van een lineaire 60 min.
- Gebruik de volgende verloop tijd-punten: t = 0 min, B = 1%, C = 10%; t = 4 min, B = 1%, C = 10%, start breuk collectie; t = 76 min, B = 70%, C = 10%; einde breuk collectie; t = 76.5 min, B = 85%, C = 10%; t = 80 min, B = 85%, C = 10%; t = 80,5 min, B = 1%, C = 10% en t = 90 min, B = 1%, C = 10%.
- Verzamel fracties herhaaldelijk in 12 putjes in een circulaire patroon, dus tekstoperatoren fracties verdeeld door 12 min, wat resulteert in 12 breuken, elk met 6 aaneengeschakelde sub breuken.
- Verwijder het oplosmiddel uit monsters door vacuüm centrifugeren op RT en 3000 rpm tot droog, en op te slaan van de monsters bij-80 ° C vóór de LC-MS-analyse.
7. LC-MS
-
Bereiden waterige mobiele fasen:
Buffer A: 0,1% FA
Buffer B: 0,1% FA, 84% AcN
Laden buffer: 0.05% TFA, 2% AcN
Opmerking: Het laden van de buffer wordt gebruikt als transportoplossing, monster buffer en mobiele fase voor de pomp laden. - Elk van de 12 gehalten opnieuw te ontbinden door toevoeging van 6 µL laden buffer en schudden bij RT voor 20 min
- Belasting 5 µL monster op een nano-flow HPLC, actief in Val kolom configuratie (Val kolom: 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å poriegrootte, 3 µm deeltjesgrootte; scheiding kolom: C18, 75 µm x 500 mm, 100 Å poriegrootte, 2 µm deeltjesgrootte , en het uitvoeren van peptide scheiding op een debiet van 150 nL/min met behulp van de volgende verloop: t = 0 min, B = 2%; t = 10 min, B = 2%; t = 11 min, B = 7%; t = 100 min, B = 26%; t = 170 min, B = 45%; t = 175 min, B = 80%; t = 181 min, B = 2%, en t = 210 min., B = 2%.
-
MS op hoge resolutie hybride massaspectrometer verbonden met de HPLC via de interface van een nano-ESI uitvoeren. Opnemen van full-scanspectra in MS-modus op een resolutie-instelling van 120.000 (2.0e5 AGC target) over de m/z -bereik 350-1.400.
- Werken de massaspectrometer in gegevens-afhankelijke overname modus, selecteert u MS/MS-spectra in de top tien meest intense pieken met m/z > 150 en binnen de intensiteit bereik 1.0e4-1.0e5 voor fragment ion analyse. Isoleren voorloper ionen met behulp van een vierpolige isolatie venster van 1 m/z, maximale injectie tijd van 100 ms en de RF-lens op 60%.
- Toepassen van dynamische uitsluiting met een tijd van de uitsluiting van 15 s en een m/z -tolerantie van ±10 ppm. Uitvoeren van fragmentatie in de hoger-botsing energie dissociatie (HCD) cel en MS/MS overnames in de orbitrap op een resolutie-instelling van 50.000 (5.0e4 AGC streefwaarde) opnemen.
8. peptide identificatie
-
Voor peptide identificatie dienen de resulterende .raw-bestanden uit de massaspectrometrische analyse naar een proteomics search engine toepassing van de volgende instellingen:
Opmerking: In onze eerdere studie15, drie zoekmachines; Mascotte v2.4, Sequest HT en PIEKEN v7.5 werden gebruikt in parallel en de hier opgegeven instellingen werden ingezet voor alle drie de zoekmachines, tenzij anders aangegeven. De meerderheid van de aanpasbare instellingen zijn universeel voor peptide/eiwit identificatie en moet de corresponderende instellingen in een bepaalde zoekmachine.
Spectrum Gegevenskiezer:
Min. voorloper massa: 350 Da
Max. voorloper massa: 5.000 Da
Scantype: volledige
Signaal/ruisverhouding drempel: 1.5
Reeks database opzoeking
Database: UniProt_SwissProt [version2015_11]
Taxonomie: Homo sapiens
Enzym: geen
Max. breuklijnen gemist: 0
Instrument (alleen mascotte): ESI-Trap
Min. peptide lengte (alleen SequestHT): 6
Max. Peptide lengte (alleen SequestHT): 144
Voorloper massa tolerantie: 15 ppm
Fragment van de massale tolerantie: 0,05 Da
Statische wijzigingen: Carbamidomethyl (C); [Als geëtiketteerd] TMT10plex (N-Term)
Dynamische wijzigingen: oxidatie (M); [Als geëtiketteerd] TMT10plex (K)
Peptide-spectrum wedstrijd (PSM) validator
Percolator (mascotte en Sequest HT alleen) of lokvogel Fusion (alleen PIEKEN)
FDR richten: 0.01
Validatie op basis van: q-waarde
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier beschreven methode is toegepast en geëvalueerd in drie studies vóór de invoering van monster pre fractionering (tabel 1). De eerste studie gebruikt off line LC voor het spotten van CSF breuken op een MALDI doel plaat en resulteerde in 730 geïdentificeerde endogene peptiden11. In de twee volgende studies, isobaar etikettering werkte. Vooral in een geval/control studie voor identificatie en karakterisering van mogelijke biomarkers in de CSF endopeptidome en Proteoom gelijktijdig24, en in de tweede studie isobaar etikettering werd gebruikt voor monitoring van behandeling effecten in vivo van een inhibitor γ-secretase op de uitdrukking van de peptide in CB over 36 h16. In het geval/control studie 437 endogene peptiden werden geïdentificeerd, 64 waarvan ingrijpend veranderd in concentratie tussen individuen met AD en gezonde controles. De derde behandeling studie, geïdentificeerd 1798 endogene peptiden, 11 van de gecontroleerde peptides te reageren op de behandeling kon worden aangetoond.
In de vierde studie was het doel te verhogen van het aantal geïdentificeerde CSF peptides, met name voor het identificeren van lagere-overvloedig peptiden. Daarom, peptide pre fractionering door HpH-RP chromatografie was opgenomen en een grotere 10-fold CSF monstervolume werd gebruikt, waardoor identificatie van 16,395 peptiden. In deze studie werd geen isobaar etikettering uitgevoerd. Naast monster fractionering, gebruikt de meest recente studie een gecombineerde peptide identificatie aanpak, overwegende dat de in de eerste drie studies was alleen een database voor eenmalige zoekopdracht uitgevoerd, die naar sommige mate rekeningen voor het grotere aantal peptiden geïdentificeerd. Vergelijking van de resultaten verkregen door de individuele zoekmachines (Mascot, Sequest HT of PIEKEN) uit de meest recente studie geeft aan dat de gebruikte algoritmen zijn tot op zekere hoogte complementaire sinds een relatief klein bedrag, minder dan 15% (2440), van peptiden geïdentificeerd door alle drie de zoekmachines (Figuur 2). Verder, de DOVO-sequencing search engine TOPPEN was het meest efficiënt in identificerende endogene peptiden, maar meer dan 5.400 peptiden zou niet zijn geïdentificeerd als alleen PIEKEN hadden gebruikt (Figuur 2). De toepassing van verschillende zoekmachines op hetzelfde materiaal heeft potentieel problemen met meerdere testen en dit was een test van identificatie juistheid13aangepakt. De verworven ruwe gegevens van de MS/MS, evenals alle resultaten van proteomic zoekopdrachten uit de meest recente proef hebben beschikbaar gesteld in de trots-gegevensbank via ProteomeXchange met id PXD004863.
Figuur 1: een regeling van de protocol visualiseren van de belangrijkste stappen van de methode. Extractie van cerebrospinaal vocht door Lumbaalpunctie gevolgd door centrifugatie om niet-oplosbare materiaal, 2) toevoeging van GdnHCl aan het monster te distantiëren van peptide-eiwit-aggregaten, verhoging van het herstel van endogene peptiden; vermindering en alkylatie van cysteïne disulphides; Isobaar etikettering voor peptide kwantificering (optioneel) 3) moleculair gewicht filtratie te scheiden van de endogene peptiden van de eiwitten, 4) vaste fase extractie te verwijderen van zouten en andere polar verontreinigingen, 5) RP HPLC pre fractionering, alkalische mobiele fase verloop en concatenatie van elke 12th breuk, 6) RP-HPLC-MS/MS, zure mobiele fase verloop, elke aaneengeschakelde breuk uitgevoerd achtereenvolgens, 7) peptide identificatie uitgevoerd door het indienen van gegevens van de MS/MS uit alle 12 analyse loopt als een één sample aan de onderzoeksmotoren, vervolgens peptide IDs werden vergeleken en een opsomming van alle unieke peptide id's werden uitgevoerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Onderzoekssamenvatting | TMT etikettering (j/n) | HpH-RP fractionering (j/n) | Bijbehorende volume van CB per MS-analyse (µl) | Aantal geïdentificeerde peptiden | Commentaar | Referentie |
| Exploratieve CSF peptidome analyse | n | n | 500 | 730 | Off line LC MALDI doelstelling voorbereiding, MALDI-MS; evaluatie van MWCO filters | 4 |
| Kwantitatieve vergelijking van CSF peptiden; monsters van 8 AD + 8 Ctrl | y | n | 200 | 437 | HPLC-ESI MS; gecombineerde peptidomic en Proteoom protocol | 25 |
| AD gamma secretase remmer behandeling studie | y | n | 300 | 1798 | HPLC-ESI MS; CSF uitgepakt op zes tijdstippen na de behandeling | 17 |
| Uitbreiding van de CSF-peptidome | n | y | 750-1000 | 18.031 | HPLC-ESI MS; combinatie van peptide identificatie software | 15 |
Tabel 1: Een compilatie van recente studies uitgevoerd door deze groep die molecuulgewicht filtratie en massaspectrometrische analyse voor de identificatie van endogene peptiden in menselijke CB van toepassing is.
Figuur 2: een Venn-diagram dat is vergelijking van de peptide identificatie resultaten verkregen uit elk van de drie zoekmachines mascotte, Sequest HT en PIEKEN. Een totaal van 16,395 endogene peptiden werden geïdentificeerd. De DOVO-sequencing search engine PIEKEN geïdentificeerd 10,967 endogene peptiden; fragment-ion vingerafdrukken gebaseerde zoekmachines mascotte en Sequest HT geïdentificeerd respectievelijk 8118 en 7304 endogene peptiden. De identificatie-consensus tussen alle drie de zoekmachines bedroeg 2440 endogene peptiden of 14,8%. Er was een relatief grote identificatie overlapping tussen mascotte en Sequest HT, overeenkomt met 70% van hun gecombineerde peptide identificaties. PIEKEN had een relatief kleine identificatie overlappen met zowel de mascotte en de Sequest HT; 20,5% en 18,9% respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De invoering van een hoge-pH RP HPLC pre fractionering stap naar een eerder ontwikkelde protocol voor herstel van endogene peptiden door molecuulgewicht ultrafiltratie11 verminderd relatieve monster complexiteit en daardoor toegestaan voor een 5-voudig groter monstervolume worden bestudeerd. Dit, beurtelings, verhoogd de concentratie van de subset van peptides aanwezig in elke fractie en verbeterd waardoor de kans op detectie van lage overvloedige peptiden.
Door het uitvoeren van een identificatie-strategie voor endogene peptiden die drie proteomic software parallel, bleek het mogelijk om uit te breiden van de bekende CSF endopeptidome meer dan 10-fold. Een totaal van 16,395 endogene peptiden werden geïdentificeerd in een voorbereidende proef op een gegroepeerde CSF monstermateriaal. Onder de identificaties waren een groot aantal endogene peptiden afgeleid van eiwitten eerder opgemerkt in het kader van neurodegeneratieve aandoeningen. Verschillende peptiden geïdentificeerd in de bovengenoemde studies zijn momenteel geëvalueerd als biomarkers in ons laboratorium. Dit proces omvat verschillende stappen, met inbegrip van verificatie van de peptiden identiteiten door CSF stekelige met synthetische analogen geëtiketteerd met zware isotopen, oprichting van gerichte massaspectrometrische testen, beoordelen van peptide stabiliteit tijdens de opslag en bevriezen-ontdooien cycli en analyseren verschillende klinische cohorten.
Wijzigingen werden aangebracht in het oorspronkelijke protocol om te voorkomen dat de introductie van verontreinigende stoffen (in stappen van 2.5 en 3.5) als gevolg van een hoge concentratie van GdnHCl in de steekproef tijdens MWCO-filtratie. Een update aan het pre fractionering verloop (stap 6.3.1) heeft plaatsgevonden, capaciteit langdurige, lineaire kleurovergang wordt gebruikt.
De voornaamste oorzaken van verlies van de analyt in het protocol hier beschreven kunnen worden toegeschreven aan de twee RP chromatografische stappen, alsmede de MWCO filtratie en SPE monster opruimen stap.
De peptide verliezen als gevolg van de interactie met de MWCO-filter of eiwitten behouden daarop, tijdens de filtratie zijn moeilijk te vermijden en kunnen een bron van inter monster variatie.
Verder ontstaan selectieve verliezen waarschijnlijk in de RP-HPLC stappen. Aangezien peptide hydrophobicity afhankelijk van de pH is, kan twee opeenvolgende RP chromatografische stappen uit te voeren op hoge en lage pH, respectievelijk, leiden tot verlies van de subset van peptiden die ook hydrofiele op pH ≥9 moeten worden bewaard als u op de kolom en ook een tweede subset ook hydrofiele op pH ≤3 moeten worden bewaard.
Ten opzichte van eerder gebruikte methoden de tewerkstelling van pre fractionering heeft geleid tot een 10-fold stijging van de identificatie van endogene peptiden. Het is toegestaan voor succesvolle detectie van een groot aantal eerder onbekende peptiden en is daarom een waardevol hulpmiddel in de studie en de verkenning van de CSF-peptidome, en eventueel ook andere complexe biologische monsters.
Gecombineerd met multiplexed isobaar etikettering die het protocol verder worden toegepast om te identificeren biomerker kandidaten voor verschillende neurodegeneratieve aandoeningen in CB, bloed en hersenen weefsel is bedoeld.
Verschillende herstel in de sample voorbereiding stappen draagt bij aan de analytische variatie voor de analyse van CSF eiwitten en peptiden door het uitvoeren van de LC-MS. isobaar etikettering van peptiden in een vroeg stadium in de sample voorbereiding daalt de invloed van dergelijke variatie sterk. Vergeleken met de eerder gemelde monster voorbereiding protocollen, verhoogd de uitvoering van high-pH reversed-phase peptide pre fractionering het aantal geïdentificeerde peptiden met een factor 5. Identificatie van endogene peptiden uit MS/MS-gegevens is aanzienlijk verbeterd bij het combineren van verschillende peptide identificatie software programma's, met verschillende zoektocht algoritmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen strijdige belangen, financiële of andere, tussen auteurs hebben gemeld.
Acknowledgments
Veel dank aan Tanveer Batth en collega's voor advies bij het opzetten van de pre fractionering methode.
Dit werk werd gesteund door financiële middelen van de Zweedse Onderzoeksraad, de Wallström en Sjöblom Foundation, het pistool en Bertil Stohne Stichting Stiftelse, de Magnus Bergwall Stichting, de Stichting Åhlén, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stichting för Gamla Tjänarinnor, Knut en Alice Wallenberg Foundation, Frimurarestiftelsen en FoU-provincie Västra Götalandsregionen.
De belangrijkste ontvangers van financiering van dit project waren Kaj Blennow, Henrik Zetterberg en Johan Gobom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
References
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al.
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).
- Spellman, D. S., et al. Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF. Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).
- Höglund, K., et al. Alzheimer's disease—Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria. Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).
- Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).
- Yuan, X., Desiderio, D. M.
- Berven, F. S., et al. Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome. Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).
- Zougman, A., et al. Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).
- Holtta, M., et al. Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS. PLoS One. 7 (8), e42555 (2012).
- Holtta, M., et al. An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).
- Hansson, K. T., et al.
- Guldbrandsen, A., et al. In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR). Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).
- Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics. J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).
- Hölttä, M., et al. A single dose of the γ-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans. Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11 (2016).
- Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes. J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).
- Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis. J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).
- Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains. J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).
- Hölttä, M., et al. An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).
