Summary
É apresentado um método para análise de espectrometria de massa de peptídeos endógenos em humano líquido cerebrospinal (CSF). Empregando filtração de corte de peso molecular, pre- fracionamento cromatográfico de, análise de espectrometria de massa e uma subsequente combinação de estratégias de identificação do peptide, foi possível expandir o conhecido peptidome CSF quase dez vezes em comparação a estudos anteriores.
Abstract
Este protocolo descreve um método desenvolvido para identificar endógenos em humano líquido cerebrospinal (CSF). Para este propósito, um método previamente desenvolvido baseado na filtração de corte (MWCO) de peso molecular e análise de espectrometria de massa foi combinada com uma etapa de pre-fracionamento off-line alta-pH de fase reversa HPLC.
Secreção em CSF é a principal via para a remoção de moléculas derramado pelas células do sistema nervoso central. Assim, muitos processos no sistema nervoso central são refletidos no CSF, tornando-o um fluido de diagnóstico valioso. CSF tem uma composição complexa, contendo proteínas que abrangem uma gama de concentração de 8-9 ordens de magnitude. Além de proteínas, estudos anteriores também têm demonstrado a presença de um grande número de peptídeos endógenos. Enquanto menos extensivamente estudados do que proteínas, estas podem também realizar potencial interesse como biomarcadores.
Peptídeos endógenos foram separados do conteúdo de proteína do CSF através da filtragem MWCO. Removendo a maioria do teor de proteína da amostra, é possível aumentar o volume da amostra estudada e assim também o montante total dos peptides endógenos. A complexidade da mistura do peptide filtrado foi abordada, incluindo uma fase reversa etapa de pre-fracionamento HPLC (RP) em pH alcalino, antes da análise por LC-MS. O fracionamento foi combinado com um esquema simples concatenação onde 60 fracções foram agrupadas em 12, consumo de tempo de análise, assim, poderia ser reduzido, ainda em grande parte, evitando eluição co.
Identificação de peptídeo automatizado foi realizada usando três programas de software de identificação de peptídeos/proteínas diferentes e, posteriormente, combinando os resultados. Os diferentes programas foram complementares, ao invés de comparável com menos de 15% das identificações sobrepostas entre os três.
Introduction
Biomarcadores no líquido cerebrospinal (CSF) atualmente são transformar pesquisa em doenças neurodegenerativas. Na doença de Alzheimer, a doença neurodegenerativa mais comum, afetando mais 60 milhões pessoas em todo o mundo1,2, um trio de biomarcador consistindo o beta amyloid do peptide, estabilizadores do microtubule tau de proteína e um fosforilada forma de tau, pode detectar a doença com alta sensibilidade e especificidade e foi incluída na investigação diagnóstica critérios3. Em outras doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson e esclerose múltipla, proteomic estudos identificaram numerosos candidatos biomarcador, alguns dos quais estão atualmente sob avaliação em estudos clínicos,4,5 ,6.
Ao lado de proteínas, CSF também contém uma abundância de peptídeos endógenos7,8,9,10,11,12. Que constituem produtos de clivagem de muitas proteínas derivado do cérebro, estes peptídeos também representam uma fonte potencialmente importante de biomarcadores da doença. Para aumentar o estoque de peptídeos endógenos identificados no CSF humano e habilitar análises de endopeptidomic CSF em estudos clínicos, foi desenvolvido um método para a preparação da amostra e análise de LC-MS (um esquema de protocolo breve foi incluído na Figura 1 ). A aplicação deste método em um estudo recente resultou na identificação de quase 16.400 endógenos do CSF em amostras de CSF em pool de vários indivíduos de diagnóstico específico, expandindo o conhecido CSF endopeptidome dez vezes13. Opcionalmente, o método pode ser usado em conjunto com a abordagem de rotulagem isobárica para quantificação.
Preparação da amostra
A principal fonte de massa para CSF é constituintes do plasma (por exemplo, albumina e imunoglobulinas) passando por cima do sangue cérebro barreira14,15. Sua abundância elevada dificulta a detecção de componentes de amostra baixa-abundante, derivado do cérebro. Endógenos podem ser facilmente separados de proteínas alta-abundante, permitindo assim que um volume significativamente maior de extrato de peptídeo CSF deve ser usado para análise de LC-MS, permitindo a deteção de peptídeos inferior-abundante.
No protocolo aqui apresentado, filtração de peso molecular de corte (MWCO) foi usada para separar os peptídeos CSF a fração de proteína; um método que tem sido usado em vários anteriores estudos8,9,10,11,12,16. A etapa de filtração foi seguida por uma etapa de pre-fracionamento RP HPLC off-line realizada ao longo de um gradiente de fase móvel de alta-pH. Através da realização de duas etapas de RP HPLC em tandem, com pH, sendo a principal distinção, a diferença de seletividade entre as duas etapas resulta principalmente da retenção de peptídeo alterados em consequência de peptídeo diferentes Estados. O aplicativo de pré-fracionamento alta-pH peptídeo antes da LC-MS, sob condições ácidas provou-se eficiente no aumento do peptide identificação17,18e até mesmo a ser superior para esta finalidade no complexo biológico amostras em relação ao mais separação ortogonais modos19, como o forte gato-íon exchange (SCX) e RP20. Para encurtar o tempo de análise, foi utilizado um esquema de concatenação, reunindo todos os 12th fração (por exemplo, frações 1, 13, 25, 37 e 49), que devido ao poder de alta resolução RP HPLC ainda evitou co eluição de peptídeos de diferentes frações na LC-MS passo20,21.
Identificação de peptídeos
Identificação de peptídeos em estudos peptidomic difere de proteomic estudos em que não há clivagem enzimática pode ser especificada em Pesquisar o banco de dados, e como consequência, as taxas de identificação são geralmente inferior11. Um recente estudo13 mostrou que as taxas de identificação de peptídeos endógenos obtidos com Sequest e mascote foram substancialmente melhoradas quando o padrão marcando o algoritmo do respectivo programa foi modificado usando o marcador adaptável algoritmo de coador, indicando que algoritmos de Pontuação ideais para endógenos diferem de peptídeos tryptic13. Nesse estudo, identificação com base no sequenciamento de péptido automático de novo usando o software picos (BSI) foi encontrado para ser complementares para os motores de busca baseado em impressões digitais de íon dois fragmento, resultando em um conjunto significativamente maior de identificado peptídeos.
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Protocol
O protocolo descrito abaixo é uma versão refinada do que usado no estudo anterior, onde uma grande quantidade de peptídeos endógenos foram identificados em humanos CSF15. Atualizações para o protocolo original envolvem alterações menores para o pré-tratamento químico de LCR, bem como a optimização do gradiente usada para off-line pre-fraccionamento RP HPLC de alta-pH.
Considerações éticas
Todos os estudos de materiais sueco do paciente e controle foram aprovados pelos comitês de éticas: Göran St (Ref. 2005-554-31/3). CSF samples a coorte de demência de Amesterdão e amostras coletadas no Hospital Nacional de Neurologia e neurocirurgia, Londres foram usadas para pesquisa com consentimento por escrito de todos os pacientes participantes e aprovação das comissões de ética regionais. O material aqui utilizado principalmente consistia de CSF sobras de amostras colhidas para fins de diagnóstico e era de identificados antes de serem incluídos em nossos estudos. Não há nenhuma possibilidade de rastreamento volta a amostra de qualquer doador individual ou grupo de doadores.
1. extração de líquido cefalorraquidiano humano (CSF):
- Extraia o CSF através de punção lombar (deve ser realizada por um médico treinado) usando um protocolo padronizado de22.
- Remova os detritos celulares e outros materiais não solúveis por centrifugação a 2.500 x g por 20 min.
- Inspecione visualmente amostras do CSF para descoloração que pode indicar a contaminação de sangue resultante de punção sangrar. A concentração significativamente maior de proteína no sangue e a presença de proteases pode afectar grandemente os resultados analíticos.
2. pré-tratamento da CSF (1,5 mL Volume de amostra, sem quantificação):
- Descongelar a 1,5 mL de alíquotas do CSF à temperatura ambiente (RT), transferir o conteúdo para os tubos de polipropileno de 10 mL e adicione 80 µ l de 1m trietilamônio bicarbonato (TEAB) como um agente tamponador.
- Adicionar cloridrato de guanidínio 0,65 mL 8 M (GdnHCl) (ativa concentração GdnHCl: 2.4 M) e vórtice suavemente no RT por 10 min.
Nota: O agente caotrópicas, GdnHCl, tanto afeta a viscosidade do solvente e interage com a corrente do polypeptide, que resulta em proteína desdobramento sendo energeticamente favorável23. Assim, GdnHCl dissolve-se agregados de proteínas e aumenta a recuperação de peptídeos endógenos durante a filtração subsequente. - Adicione 60 µ l de 200 mM de aquosa tris(2-carboxyethyl) cloridrato de fosfina (TCEP) (ativa concentração TCEP: 6mm) e incubar a 55 ° C, durante 1 h reduzir disulphides de cisteína.
- Adicione 35 µ l de iodoacetamide de 400 milímetros (IAA) (ativa concentração IAA: 4 mM) e incube a RT na escuridão por 30 min para alquilação cisteínas. A adição de um grupo alquila garante que os resíduos de cisteína espontaneamente não podem formar novas pontes dissulfeto em qualquer ponto durante a preparação das amostras subsequentes.
- Adicione 3,25 mL de água desionizada e vórtice brevemente para diluir a amostra antes da filtração MWCO, resultando em um volume de amostra total de 5,5 mL. Esta etapa serve para diluir a GdnHCl para abaixo de 1 M, como observou-se uma concentração mais elevada às vezes causar lixiviação de substâncias poliméricas de dispositivos de filtro.
3. pré-tratamento da CSF (10 x 150 µ l Volume de amostra, rotulagem-quantificação isobárica):
- Descongelar a 150 µ l de alíquotas CSF de 10 indivíduos em RT e posteriormente transferir o conteúdo para tubos de centrífuga de micro de ligação de baixa individual 1,5 mL e adicionar 8 µ l de 1m TEAB como um agente tamponador.
- Adicione 65 µ l de 8 M GdnHCl (concentração de ativa GdnHCl: 2.4 M) e vórtice suavemente no RT por 10 min.
- Adicione 6 µ l de 200 mM do TCEP aquosa (ativa concentração TCEP: 6mm) e incubação a 55 ° C, durante 1 h reduzir disulphides de cisteína.
- Adicionar 3,5 µ l 400 milímetros aquosa IAA (ativa concentração IAA: 6mm) e incube a RT e escuridão por 30 min para alquilação cisteínas.
- Preparar o kit de rotulagem isobárico (EG., reagente rotulagem isobárica de Tag de massa em Tandem 10plex). Permitir que os frascos de reagente-rotulagem isobárico chegar RT antes de abri-los para evitar hidratação reagente desnecessários, adicionar 41 µ l de acetonitrila grau CLAE (AcN) e dissolver por agitação suave por 5 min.
- Transferir 30 µ l de solução isobárica de rotulagem-reagente para a amostra correspondente e incubar durante 1 h em RT sob agitação suave. O reagente de rotulagem isobárico inclui um grupo de NHS-éster que reage com as aminas primárias presentes ao peptídeo N-termini, bem como com resíduos de lisina.
- Adicione 8 µ l de hidroxilamina 5% (hidroxilamina ativo concentração: 0.16%) e agitar suavemente no RT por 20 min para saciar a reação de rotulagem. Desde que as amostras separadamente rotuladas devem ser combinadas, certifique-se de que a reação de rotulagem é saciada. Pela adição de uma abundância de grupos amina na forma de hidroxilamina, o reagente de rotulagem isobárico restante é permitido reagir e é, portanto, inertes.
- Combine o conteúdo de cada uma das 10 amostras rotuladas individualmente em um tubo de polipropileno único 15 mL.
- Adicionar 6,4 mL de água deionizada para a amostra combinada e vórtice brevemente para reduzir a concentração de AcN de 12% para 3% e a concentração de GdnHCl GdnHCl para abaixo de 1 M, como observou-se uma maior concentração às vezes provocar lixiviação de substâncias poliméricas de dispositivos de filtro.
4. o Peso Molecular de corte filtração
- A fim de remover o potencial contaminantes, condição o MWCO filtra por carregar 10 mL de aquosa 1m GdnHCl, 25 mM TEAB e centrifugação durante 15 minutos a 2.500 x g e RT, descarte o escoamento (FT).
- Carregar o volume de toda a amostra no filtro (5ml não rotuladas CSF (etapa 2.5) ou 10 mL com rótulo isobarically CSF (passo 3.9)) e centrifugar para 30 min em 2.500 x g e RT, deixe o escoamento (FT) no recipiente de coleta. O resultado da filtragem é que pequenas proteínas e peptídeos são separadas de restos de células maiores de proteínas e residual. Este passo pode ser visto como o equivalente à utilização de digestão proteolítica das proteínas de peptidomic para gerar peptídeos em experimentos de proteomic.
- Carrega 5 mL de 25 mM TEAB (aquosa) sobre os filtros e centrifugar por 15 min em 2.500 x g e RT, a fim de aumentar a recuperação de peptídeos.
- Vórtice os FTs combinadas das duas etapas anteriores (um total de 10 mL de não rotuladas ou 15 mL de amostra isobarically com rótulo) e proceder à acidificação da amostra.
5. de salga e amostra limpar por extração de fase sólida
- Acidificar a amostra filtrada da etapa 4.4 antes da extração de fase sólida (SPE). A acidificação é realizada a fim de melhorar a interação do soluto (peptídeo) com fase estacionária do SPE-cartucho.
- Para a amostra não rotuladas (volume de 10 mL): Adicionar 550 µ l de 1% ácido trifluoroacético (TFA) - volume total da amostra: 10,55 mL com 0,05% TFA.
- Para a amostra com rótulo isobárica (volume de 15 mL): Adicionar 20 mL 0,1% TFA para acidificar e baixa concentração de AcN de 3% para 1% - volume total da amostra: 30 mL com 0,066% TFA.
Nota: TFA também é adicionado para sua função como um reagente íon-emparelhamento, que melhora a retenção de peptídeos não se capaz de suficientemente forte interação hidrofóbica com o material de embalagem do cartucho SPE para ser retido. - Se pH > 3, titular a amostra com ácido fosfórico a 20% até pH da amostra é < 3.
- Condicione os cartuchos SPE pela adição de 1 mL de 84% do grupo AcN, 0,1% de ácido fórmico (FA) e descarte o ft. repetir uma vez. Condicionamento do filtro cartucho é necessário para remover substâncias indesejáveis que seriam caso contrário eluir junto com os peptídeos em etapas subsequentes; Além disso, condicionamento aumenta permeabilidade do filtro.
- Equilibrar o cartucho SPE pela adição de 1 mL de 0.1% TFA, descartar ft. repetir uma vez. Certifique-se de que o filtro não funciona seco após a última etapa de equilíbrio - manter um volume pequeno na parte superior do filtro. Equilibrio do filtro cartucho é realizado a fim de preparar o filtro para reter os peptídeos, removendo a substância hidrofóbica (acetonitrilo) deixou da etapa de condicionamento.
- Carregar o volume de toda a amostra (mL 10,55 para amostras não rotuladas ou 30 mL para amostras com rótulo isobarically), em várias partes, se necessário e deixe o FT no lixo. Certifique-se que o cartucho não secar entre amostra rodadas de carregamento ou após o último volume de amostra ter sido carregado - manter um volume pequeno na parte superior do filtro.
- Passar 1 mL de 0.1% TFA sobre os filtros para remover os sais e os reagentes e descartar a repetição ft uma vez. Certifique-se de que o cartucho não funciona seco após cada etapa de lavagem - manter um pequeno volume de líquido em cima do cartucho.
- 1.5 local de micro baixa ligação mL centrifugar tubos sob o cartucho e eluir a amostra, passando a 1 mL de 84% AcN, 0,1% FA sobre o cartucho.
- Remova os solventes da amostra de sal por evaporação em vácuo centrifuga são executada sem aquecimento ativo até secar, armazenar a-80 ° C, ou proceder de imediato à alta-pH fracionamento.
6. offline alta-pH inverter fase HPLC amostra fracionamento
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Prepare-se fases móveis aquosas alto-pH (HpH):
Tapador Buffer r: Água pura
Buffer de HpH b: 84% de AcN
Buffer de HpH c: 25mm NH4OH
Buffer de HpH carregando: 2,5 mM NH4OH, 2% AcN
Nota: O carregamento Tapador buffer é usado como reserva de solução e amostra de transporte - Re-dissolver a amostra no buffer de HpH carregar 16 µ l por agitação suave por 20 min
- Carga de 15 µ l da amostra em um sistema HPLC com um coletor de fração interno para placas de 96 poços profundos configurado de acordo com cleitiane et al 20 com pequenas alterações. Fracionar a um caudal de 100 µ l/min sobre uma coluna de separação de pH estável (C18 3,5 µm, 2,1 mm x 250 mm) e coletar uma fração por min ao longo de um gradiente linear 60 min.
- Use os seguintes gradientes-pontos de tempo: t = 0 min, B = 1%, C = 10%; t = 4 min, B = 1%, C = 10%, iniciar coleção de fração; t = 76 min, B = 70%, C = 10%; coleção de fração final; t = 76,5 min, B = 85%, C = 10%; t = 80 min, B = 85%, C = 10%; t = 80,5 min, B = 1%, C = 10% e t = 90 min, B = 1%, C = 10%.
- Colete frações repetidamente em 12 poços em um padrão circular, assim, concatenando frações espaçadas por 12 min, resultando em 12 fracções, cada uma contendo 6 fracções sub concatenadas.
- Remover o solvente de amostras por vácuo centrifugação a RT e 3000 rpm até secar e armazenar as amostras a-80 ° C, antes da análise por LC-MS.
7. LC-MS
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Prepare-se fases móveis aquosas:
Buffer r: FA 0.1%
Tampão b: 0.1% FA, 84% do grupo AcN
Amortecedor do carregamento: 0.05% TFA, 2% AcN
Nota: Tampão de carregamento é usado como solução de transporte, amortecedor da amostra e fase móvel para a bomba de carga. - Re-dissolver cada uma das 12 frações por adição de 6 µ l tampão de carregamento e agitação no RT por 20 min
- Amostra de carga 5 µ l em uma nano-fluxo HPLC, operando na configuração de coluna de armadilha (coluna de armadilha: 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å tamanho do pore, tamanho de partícula de 3 µm; coluna de separação: C18, 75 µm x 500 mm, 100 Å tamanho do pore, tamanho de partícula de 2 µm e realizar a separação de peptídeos com um caudal de 150 nL/min usando o seguinte gradiente: t = 0 min, B = 2%; t = 10 min, B = 2%; t = 11 min, B = 7%; t = 100 min, B = 26%; t = 170 min, B = 45%; t = 175 min, B = 80%; t = 181 min, B = 2% e t = 210 min, B = 2%.
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Execute MS no espectrômetro de massa de híbrido de alta resolução conectado para a HPLC através de uma interface de nano-ESI. Gravar espectros de varredura completa no modo de MS em uma configuração de resolução de 120.000 (alvo AGC 2.0e5) sobre a faixa de m/z 350-1.400.
- Operar o espectrômetro de massa no modo de aquisição de dados dependentes, selecione os top dez picos mais intensos com m/z > 150 e dentro a intensidade gama 1.0e4-1.0e5 para análise de íon fragmento de espectros de MS/MS. Isole os íons precursor usando uma janela de isolamento de quadrupolo de 1 m/z, tempo de injeção máxima de 100 ms e a lente de RF em 60%.
- Aplicar a exclusão dinâmica com um tempo de exclusão de 15 s e uma m/z de tolerância de ± 10 ppm. Executar a fragmentação na célula superior-colisão energia de dissociação (HCD) e gravar aquisições de MS/MS a orbitrap em uma configuração de resolução de 50.000 (valor-alvo AGC 5.0e4).
8. peptídeo identificação
-
Para identificação de peptídeo submeta os Raw-arquivos resultantes da análise de espectrometria de massa para um motor de busca de proteomics aplicando as configurações a seguir:
Nota: Em nosso anterior estudo15, três motores de busca; Mascote v 2.4, Sequest HT e v 7.5 picos foram usados em paralelo e as configurações especificadas aqui foram empregadas para todos os três motores de busca, a menos que especificado de outra forma. A maioria das configurações ajustáveis é universal para identificação de peptídeos/proteínas e deve ter configurações correspondentes em qualquer motor de busca específico.
Seletor de espectro:
Min. precursor em massa: 350 Da
Max. precursor em massa: 5.000 Da
Tipo de digitalização: completo
Limiar de sinal/ruído: 1.5
Pesquisa de banco de dados de sequência
Banco de dados: UniProt_SwissProt [version2015_11]
Taxonomia: Homo sapiens
Enzima: nenhum
Max. perdeu segmentações: 0
Instrumento (mascote somente): ESI-armadilha
Min. comprimento de peptídeo (SequestHT somente): 6
Max. comprimento do peptide (SequestHT somente): 144
Tolerância de massa precursor: 15 ppm
Fragmento de tolerância em massa: 0.05 Da
Modificações estáticas: Carbamidomethyl (C); [Se etiquetado] TMT10plex (N-termo)
Modificações dinâmicas: oxidação (M); [Se etiquetado] TMT10plex (K)
Peptídeo-espectro correspondem validador (PSM)
Coador (mascote e Sequest HT somente) ou chamariz Fusion (picos somente)
FDR-alvo: 0,01
Validação com base em: q-valor
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Representative Results
O método descrito aqui foi aplicado e avaliado em três estudos antes da introdução de pre-fracionamento de amostra (tabela 1). O primeiro estudo usado LC off-line para detectar frações CSF em uma placa-alvo MALDI e resultou em 730 endógenos identificados11. Em dois estudos seguintes, rotulagem isobárica foi empregado. Principalmente em um caso/controle estudo para identificação e caracterização de potenciais biomarcadores no CSF endopeptidome e proteome simultaneamente24e no segundo estudo isobárica rotulagem foi usado para monitoramento de efeitos do tratamento in vivo de um inibidor de secretase-γ na expressão de peptídeo em CSF sobre h 3616. O estudo de caso/controle 437 endógenos foram identificados, 64 dos quais significativamente alterados em concentração entre indivíduos com AD e controles saudáveis. O terceiro, o estudo do tratamento, identificou 1798 endógenos, 11 dos peptides monitorados poderia ser mostrado para responder ao tratamento.
No quarto estudo, o objetivo era aumentar o número de peptídeos identificados do CSF, particularmente para identificar peptídeos inferior-abundante. Portanto, pre-fracionamento de peptídeo por cromatografia de HpH-RP foi incluído e um 10 vezes maior volume de amostra de CSF foi usado, resultando na identificação de 16.395 peptídeos. Neste estudo, foi realizada sem rotulagem isobárica. Além do fracionamento de amostra, o mais recente estudo empregou uma identificação de peptídeo combinado abordagem, Considerando que, nos três primeiros estudos foi realizada apenas uma pesquisa de banco de dados único, que para algumas contas de extensão para o maior número de peptídeos identificados. Comparar os resultados obtidos pelos mecanismos de pesquisa individual (mascote, Sequest HT ou picos) do mais recente estudo indica que os algoritmos usados são em certa medida complementar desde uma quantidade relativamente pequena, menos de 15% (2440), dos peptídeos são identificado por todos os três motores de busca (Figura 2). Além disso, o novo de-sequenciamento pesquisa motor picos foi a mais eficiente na identificação de peptídeos endógenos, mas mais do que 5.400 peptídeos que não identificaram-se apenas picos tinham sido usado (Figura 2). A aplicação de vários motores de busca sobre o mesmo material tem potencial várias questões de testes e isto foi abordado com um teste de identificação de correção13. Os dados brutos adquiridos do MS/MS, bem como todos os resultados obtidos em pesquisas de proteomic do julgamento mais recente foram disponibilizados no repositório de dados orgulho através de ProteomeXchange com o identificador PXD004863.
Figura 1: um esquema de protocolo visualizando as principais etapas do método. Extração do líquido cefalorraquidiano por punção lombar, seguido de centrifugação para remover o material não solúveis, 2) adição de GdnHCl para a amostra para dissociar agregados de peptídeo-proteína, aumentar a recuperação de peptídeos endógenos; redução e alquilação de disulphides de cisteína; isobárica rotulagem para quantificação de peptídeo (opcional) 3) filtração de peso molecular para separar as proteínas, 4 os peptídeos endógenos) extração de fase sólida para remover sais e outros contaminadores polares, 5) pré-fracionamento de RP HPLC, alcalina gradiente de fase móvel e a concatenação de cada fração deth 12, 6) gradiente de fase móvel RP HPLC-MS/MS, ácida, cada fração concatenada executar consecutivamente, 7) identificação de peptídeo realizada através da apresentação de dados de MS/MS de todas as execuções de 12 análise como um realizou-se a única amostra para os motores de busca, posteriormente peptídeo IDs foram comparados e um somatório de todos originais do peptide IDs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Resumo do estudo | TMT rotulagem (y/n) | Fracionamento de HpH-RP (y/n) | Volume correspondente de LCR por MS-análise (µ l) | Número de peptídeos identificados | Comentário | Referência |
| Análise de peptidome CSF exploratório | n | n | 500 | 730 | Preparação de alvo off-line LC MALDI, MALDI-MS; avaliação de filtros MWCO | 4 |
| Comparação quantitativa de peptídeos da CSF; amostras de 20:00 + 8 Ctrl | y | n | 200 | 437 | HPLC-ESI-MS; peptidomic combinada e protocolo de proteomic | 25 |
| Estudo de tratamento AD gama secretase inibidor | y | n | 300 | 1798 | HPLC-ESI-MS; CSF extraído em seis pontos de tempo após o tratamento | 17 |
| Expandindo o CSF peptidome | n | y | 750-1000 | 18.031 | HPLC-ESI-MS; combinação de softwares de identificação de peptídeo | 15 |
Tabela 1: Uma compilação de estudos recentes realizados por este grupo que se aplica a filtragem de peso molecular e análise de espectrometria de massa para identificação de peptídeos endógenos no CSF humano.
Figura 2: um diagrama de Venn comparando os resultados de identificação de peptídeos obtidos de cada um dos motores de três busca mascote, picos e Sequest HT. Um total de 16.395 endógenos foram identificados. O de novo-picos de motor de busca de sequenciamento identificado 10.967 endógenos; Mascote de motores de busca de baseada em impressões digitais de fragmento de iões e Sequest HT identificado 8118 e 7304 endógenos, respectivamente. O consenso de identificação entre todos os três motores de busca ascendeu a 2440 endógenos, ou 14,8%. Houve uma sobreposição de identificação relativamente grande entre o mascote e Sequest HT, correspondente a 70% de suas identificações de peptídeo combinado. PICOS tinham uma identificação comparativamente pequena sobreposição com o mascote e Sequest HT; 20,5% e 18,9%, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A introdução de uma etapa de pre-fracionamento RP HPLC alta-pH para um protocolo previamente desenvolvido para recuperação de peptídeos endógenos por peso molecular ultrafiltração11 amostra relativa complexidade reduzida e, assim, permitido para um 5-fold maior volume de amostra a ser estudada. Este, por sua vez, aumentou a concentração do subconjunto de peptídeos presentes em cada fração e melhorado, assim, as chances de detectar baixos peptídeos abundantes.
Através da realização de uma estratégia de identificação de peptídeos endógenos que empregava três softwares de proteomic em paralelo, foi possível expandir o conhecido CSF endopeptidome mais de 10 vezes. Um total de 16.395 endógenos foram identificados em um ensaio preliminar com um material de amostra do CSF em pool. Entre as identificações foram um grande número de peptídeos endógenos derivados de proteínas observadas anteriormente no contexto de doenças neurodegenerativas. Vários peptídeos identificados nos estudos acima, atualmente, estão sendo avaliados como biomarcadores em nosso laboratório. Este processo envolve várias etapas, incluindo a verificação das identidades dos peptídeos por cravação CSF com análogos sintéticos marcados com isótopos pesados, estabelecimento de ensaios de espectrometria de massa alvo, avaliar a estabilidade do peptide durante o armazenamento e congelamento-descongelamento ciclos e análise das diferentes coortes clínicas.
Modificações foram feitas para o protocolo original para evitar a introdução de contaminantes (etapas 2.5 e 3.5), como consequência de uma alta concentração de GdnHCl na amostra durante MWCO-filtração. Foi feita uma atualização para o gradiente de pre-fracionamento (etapa 6.3.1), gradiente linear, prolongada de capacidade é usado.
As principais causas de perdas do analito no protocolo aqui descrito podem ser atribuídas para as duas etapas cromatográficas de RP, bem como a filtragem de MWCO e amostra SPE limpar passo.
O peptídeo perdas devido à interação com o MWCO-filtro, ou mantidas, durante a filtração de proteínas são difíceis de evitar e podem ser uma fonte de variação da amostra o inter.
Ainda mais seletivas perdas prováveis surgem nas etapas cromatográficas-RP. Desde que a hidrofobicidade do peptídeo é dependente do pH, realizando dois consecutivos RP cromatográficos passos no alto e baixo pH, respectivamente, pode levar a perdas do subconjunto de peptídeos que são demasiado hidrofílico na ≥9 de pH a ser retido na coluna e, da mesma forma, um segundo subconjunto muito hidrofílico em pH ≤ 3 a ser retido.
Em comparação com métodos utilizados anteriormente, o emprego de pre-fracionamento conduziu a um aumento de 10 vezes na identificação de peptídeos endógenos. Isso tem permitido para a deteção de sucesso de um grande número de peptídeos inéditos e, portanto, é uma ferramenta valiosa no estudo e exploração do peptidome o CSF e possivelmente outras amostras biológicas complexas também.
Combinado com rotulagem isobárica multiplexado que o protocolo destina-se a ser mais aplicado para identificar candidatos de biomarcador para várias doenças neurodegenerativas no tecido CSF, sangue e cérebro.
Variando de recuperação nas etapas de preparação de amostra contribui para a variação analítica para a análise da CSF proteínas e peptídeos por LC-MS. realizando isobárica rotulagem dos peptídeos na fase inicial em diminuições de preparação da amostra a influência de tais variação extremamente. Comparado com protocolos de preparação de amostra relatado anteriormente, a implementação de pre-fracionamento de peptídeo fase reversa de alta-pH aumentou o número de peptídeos identificados por um fator de 5. Identificação de peptídeos endógenos de dados-MS/MS foi melhorada significativamente ao combinar programas de software de identificação diferentes do peptide, empregando algoritmos de busca diferentes.
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Disclosures
Sem interesses concorrentes, financeiros ou outros, entre os autores têm sido relatados.
Acknowledgments
Muito obrigado a Tanveer Batth e colegas para o Conselho em Configurando o método de pre fracionamento.
Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do Conselho Sueco de pesquisa, a Margot Wallström e Sjöblom Foundation, a arma e Bertil Stohne Fundação Stiftelse, Fundação Bergwall Magnus, Åhlén Foundation, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor, o Knut e Alice Wallenberg Foundation, Frimurarestiftelsen e FoU-Västra Götalandsregionen.
Os principais beneficiários do financiamento para este projeto foram Kaj Blennow, Henrik Zetterberg e Johan Gobom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
References
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