Summary
Endojen peptidler insan beyin-omurilik sıvısı (bos) kitle spektrometrik analizi için bir yöntem sunulur. Moleküler ağırlık kesme filtrasyon, Kromatografik ön ayırma, kitle spektrometrik analizi ve peptid kimlik stratejileri sonraki bir arada istihdam ederek, yaklaşık on göre bilinen CSF peptidome genişletmek olası Önceki çalışmalar için.
Abstract
Bu iletişim kuralı endojen peptidler insan beyin-omurilik sıvısı (bos) tanımlamak için geliştirilmiş bir yöntem açıklanır. Bu amaçla daha önce gelişmiş bir yöntem molekül ağırlığı kesme (MWCO) filtrasyon üzerinde temel ve kitle spektrometrik analizi bir çevrimdışı yüksek pH ters faz HPLC ön ayırma adım ile kombine edildi.
Salgı içine CSF merkezi sinir sistemi hücreleri tarafından döken molekülleri kaldırılması için ana yoludur. Böylece, merkezi sinir sistemi birçok süreçlerinde değerli bir tanı sıvı işleme bos yansıtılır. CSF 8-9 büyüklük konsantrasyon aralığı span protein içeren karmaşık bir kompozisyon vardır. Proteinler yanı sıra, önceki çalışmalarda de çok sayıda endojen peptidler varlığını göstermiştir. Daha az yoğun protein okudu, bunlar da potansiyel ilgi biyolojik basılı tutarak.
Endojen peptidler MWCO filtrasyon yoluyla CSF protein içeriğinden ayrı kaldık. Protein içeriği çoğunluğu örnekten kaldırarak, okudu numune hacmi ve böylece aynı zamanda endojen peptidler toplam miktarını artırmak mümkündür. Filtrated peptid karışımı karmaşıklığı ters faz (RP) HPLC ön ayırma adım alkali pH önce LC-MS analizi de dahil olmak üzere tarafından ele alındı. Ayırma kombine edildi nerede 60 kesirler 12 havuzlu bir basit birleştirme düzeni ile analiz zaman tüketimi böylece hala büyük ölçüde ortak elüsyon kaçınarak azaltılabilir.
Otomatik peptid kimlik üç farklı peptit/protein kimlik yazılım programları kullanarak ve daha sonra sonuçları birleştirerek gerçekleştirildi. Farklı programlar tamamlayıcı yerine üç arasında üst üste tanımlamaları % 15'den az ile karşılaştırılabilir.
Introduction
Biyolojik beyin-omurilik sıvısı (bos) içinde şu anda nörodejeneratif hastalıklar araştırma dönüştürme. Alzheimer hastalığı içinde 60 milyon etkileyen en sık görülen nörodejeneratif bozukluğu, insanlar dünya çapında1,2, amiloid beta peptid, protein tau, Mikrotubul sabitleme oluşan bir biyomarker üçlüsü ve bir fosforile tau formu, hastalık yüksek duyarlılık ve özgüllük ile algılayabilir ve tanılama araştırma ölçütünü3' e eklenmiştir. Parkinson hastalığı ve Multipl skleroz, gibi diğer nörodejeneratif hastalıklarda proteomik çalışmalar bazıları şu anda klinik çalışmalar4,5 değerlendirilmesinde altında olan çok sayıda biyomarker adayları belirledik ,6.
Proteinler, CSF endojen peptidler7,8,9,10,11,12bolluğu da içerir. Bölünme ürünleri birçok beyin kaynaklı proteinlerin oluşturan, Bu peptidler de potansiyel olarak önemli hastalık biyolojik bir kaynağı gösterir. İnsan CSF içinde tanımlanan endojen peptidler stok artırmak ve CSF endopeptidomic analizleri klinik çalışmalarda etkinleştirmek için bir yöntem numune hazırlama LC-MS analizi (kısa protokol düzeni şekil 1 ' de dahil edilmiştir için geliştirilmiş ). Yeni yapılan bir çalışmada Bu yöntemde uygulama neredeyse 16400 endojen CSF peptidler havuza alınan CSF örneklerinde belirsiz tanı, birkaç bireylerin bilinen CSF endopeptidome panolarında13genişleyen tanımlaması içinde sonuçlandı. Yöntemi, isteğe bağlı olarak miktar için izobarik etiketleme yaklaşımı ile birlikte kullanılabilir.
Numune hazırlama
Plazma bileşenlerinin (albümin ve immünglobulin) ana kaynağıdır protein seviye CSF, üzerinde kan beyin bariyerini14,15geçen. Onların yüksek bereket düşük bol, beyin kaynaklı örnek bileşenleri tespiti engellemektedir. Endojen peptidler, böylece önemli ölçüde daha büyük bir hacim böylece alt-bol peptidler olarak algılanmasını sağlayan LC-MS çözümleme için kullanılacak CSF peptid ekstresinin izin veren yüksek bol proteinler üzerinden kolayca ayrılabilir.
Burada sunulan iletişim kuralında, molekül ağırlığı kesme (MWCO) filtrasyon CSF peptidler protein fraksiyonu ayırmak için kullanılan; önceki birkaç içinde kullanılan bir yöntem8,9,10,11,12,16çalışmalar. Filtrasyon adım yüksek pH mobil faz degrade gerçekleştirilen çevrimdışı bir RP HPLC ön ayırma adım izledi. Ana ayrım varlık pH ile tandem, iki RP HPLC adımları uygulayarak, iki adım arasında seçicilik farkı esas olarak değiştirilmiş peptid saklama sonucu olarak farklı peptid şarj Birleşik kaynaklanır. Yüksek pH peptid ön ayırma LC-MS önce asidik şartlar altında uygulanması peptid kimlik17,18artan ve hatta bu amaç için karmaşık biyolojik üstün olmak için etkili kanıtlamıştır örnekleri daha fazla dik ayırma modu19, güçlü kedi-iyon değiştirme (SCX) ve RP20gibi göre. Analiz süresini kısaltmak için bir birleştirme düzeni, hangi hala büyük ölçüde peptidler farklı ortak elüsyon kaçınılması RP HPLC yüksek çözme gücü nedeniyle her 12inci kesir (örneğin, kesirler 1, 13, 25, 37 ve 49), biriktirmenin kullanılıp yapıldı. kesirler LC-MS20,21adım.
Peptid tanımlama
Peptid kimlik peptidomic çalışmalarda proteomik çalışmaların bundan hiçbir enzim bölünme veritabanı aramada belirtilen ve sonuç olarak, kimlik oranları genellikle daha düşük11farklıdır. Bir son çalışmada13 adaptif puanlama kullanarak varsayılan algoritma ilgili yazılım programının puanlama değiştirildiğinde endojen peptidler Sequest ve maskotu ile elde edilen kimlik oranları önemli ölçüde geliştirilmiş gösterdi algoritma süzücü, endojen peptidler için en iyi skor algoritmaları, tryptic peptidler13farklı gösteren. Çalışma, tepeler (BSI) yazılımını kullanarak otomatik peptid de novo üzerinde dayandırılmış kimlik iki parça iyon parmak izi tabanlı arama motorları için tamamlayıcı bulundu ki, önemli ölçüde daha büyük kümesi içinde bir sonucu tespit peptidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıda açıklanan protokol nerede endojen peptidler büyük miktarda insan CSF15dakika içinde tespit edildi bir önceki çalışmada kullanılan rafine bir sürümüdür. Özgün iletişim kuralını guncellemeleri CSF kimyasal ön arıtma için küçük değişiklikler yanı sıra optimizasyonu çevrimdışı yüksek pH RP HPLC ön ayırma için kullanılan geçişin içerir.
Etik kaygılar
İsveçli hasta ve kontrol malzemelerin tüm çalışmalar etik komiteleri tarafından onaylanmış olan: St. Göran (ref. 2005-554-31/3). Amsterdam demans kohort CSF örnekleri ve ulusal hastanede toplanan Nöroloji ve Nöroşirürji, Londra için örnekleri tüm katılan hastaların yazılı onayı ve bölgesel etik Komiteler onayı ile araştırma için kullanılmıştır. Burada esas olarak kullanılan malzeme sol-yere CSF tanı amacıyla alınan örnekler üzerinden oluşuyordu ve çalışmalarımız dahil önce de-belirlendi. Geri herhangi bir bireysel donör veya bağış grubu örnek takip hiçbir olasılığı vardır.
1. insan beyin-omurilik sıvısı (bos) çıkarımı:
- Lomber ponksiyon (gerçekleştirilmesi gerekir eğitimli bir doktor tarafından) aracılığıyla CSF ayıklamak bir standart iletişim kuralı22kullanarak.
- Hücre artıkları ve çözünür olmayan diğer malzeme Santrifüjü 2500 x g 20 dk için de çıkarın.
- Kan kirlenme ponksiyon kanama sonucu gösteriyor olabilir renk değişikliği için CSF örnekleri kontrol edin. Kan ve proteaz varlığını önemli ölçüde daha yüksek protein konsantrasyonu analitik sonuçlar büyük ölçüde etkileyebilir.
2. ön tedavisinde CSF (1,5 mL numune hacmi, hiçbir miktar):
- CSF aliquots oda sıcaklığında (RT) 1,5 mL çözülme, 10 mL polipropilen borular için içeriği aktarmak ve 1 M Triethylammonium bikarbonat (TEAB) 80 µL arabelleğe alma Aracısı olarak ekleyin.
- 0.65 mL 8 M guanidinium hidroklorür (GdnHCl) eklemek (etkin konsantrasyon GdnHCl: 2.4 M) ve girdap RT 10 dk, yavaşça.
Not: Chaotropic aracı, GdnHCl, hem solvent viskozite etkiler ve enerjik elverişli23olmak unfolding protein sonuçları polipeptid zinciri ile etkileşim kurar. Bu nedenle, GdnHCl protein toplamları çözülür ve endojen peptidler kurtarılması sırasında sonraki filtrasyon artar. - Sulu, 200 mm 60 µL eklemek tris(2-carboxyethyl) fosfamin hidroklorür (TCEP) (etkin konsantrasyon TCEP: 6 mM) ve sistein disulphides azaltmak 1 h 55 ° C'de kuluçkaya.
- 400 mM iodoacetamide (IAA) 35 µL ekleyin (etkin konsantrasyon IAA: 4 mM) ve RT karanlıkta katıldı alkylate 30 dk için kuluçkaya. Bir alkil grubu eklenmesi sistein kalıntıları kendiliğinden yeni disülfür köprü herhangi bir noktada sonraki numune hazırlama sırasında oluşamıyor sağlar.
- De-iyonize su ve kısaca MWCO filtrasyon, 5.5 mL toplam örnek hacmi içinde kaynaklanan önce örnek sulandırmak için girdap 3.25 mL ekleyin. Bu adım daha yüksek bir konsantrasyon bazen filtre cihazlardan polimer maddelerin leaching neden gözlemlediği gibi GdnHCl için 1 M aşağıda sulandırmak için hizmet vermektedir.
3. ön tedavisinde CSF (10 x 150 µL numune hacmi, izobarik etiketleme-miktar):
- CSF aliquots RT, 10 kişilerden 150 µL çözülme ve daha sonra bireysel 1,5 mL düşük-bağlama mikro santrifüj tüpleri için içeriği aktarmak ve 1 m TEAB 8 µL arabelleğe alma Aracısı olarak ekleyin.
- 8 M GdnHCl 65 µL ekleyin (etkin konsantrasyon GdnHCl: 2.4 M) ve girdap RT 10 dk, yavaşça.
- Sulu TCEP 200 mm 6 µL ekleyin (etkin konsantrasyon TCEP: 6 mM) ve kuluçka 55 ° c sistein disulphides azaltmak 1 h için.
- 3.5 µL 400 mM sulu IAA ekleyin (etkin konsantrasyon IAA: 6 mM) ve RT ve karanlık 30 dk için katıldı alkylate kuluçkaya.
- İzobarik etiketleme çantası hazırla (örn., Tandem Mass etiketi 10plex izobarik etiketleme reaktif). RT gereksiz reaktif hidrasyon önlemek, HPLC sınıf Asetonitril (AcN) 41 µL ekleyin ve 5 min için nazik ajitasyon tarafından dağıtılması için açmadan önce ulaşmak izobarik etiketleme-reaktif şişeleri izin.
- 30 µL izobarik etiketleme-reaktif çözüm için karşılık gelen örnek aktarmak ve nazik ajitasyon altında RT, 1 h için kuluçkaya. İzobarik etiketleme reaktif Birincil aminler peptid N-termini mevcut yanı sıra lizin artıkları ile tepki verir bir NHS-ester grubu içerir.
- 8 µL % 5 hydroxylamine Ekle (etkin konsantrasyon hydroxylamine: %0.16) ve etiketleme tepki gidermek için 20 dk RT yavaşça sallayın. Ayrı olarak etiketli örnekleri birleştirilmek üzere olduğundan, etiketleme tepki söndürülür emin olun. Amin grupları hydroxylamine şeklinde bir bolluk ilavesi, kalan izobarik etiketleme reaktif tepki vermek için izin verilir ve böylece etkisiz hale.
- Her biri tek 15 mL polipropilen boru 10 tek tek etiketli örneklerinde içeriklerini birleştirebilirler.
- Kombine örnek ve kısa bir süre %12 AcN konsantrasyonu % 3 azaltmak için girdap 6.4 mL de-iyonize su ekleyin ve GdnHCl konsantrasyon için GdnHCl yoğun olarak 1 M aşağıda bazen polimerik maddeleri leaching neden olduğu gözlenmiştir Filtre cihazlardan.
4. moleküler ağırlık kesme filtrasyon
- Potansiyel kaldırmak için kirleticiler, durumu MWCO filtreler sulu 1 M GdnHCl, 25 mM TEAB ve 15 dakika 2500 x g ve RT, centrifuging 10 mL yükleyerek, akışı sayesinde (FT) atın.
- Bütün numune hacmi filtresini yüklemek (5 mL etiketli CSF (Adım 2.5) veya 10 mL isobarically etiketli CSF (Adım 3,9)) ve 30 dk 2500 x g ve RT, az terk için akışı aracılığıyla (FT) koleksiyon kapsayıcısında santrifüj kapasitesi. Filtrasyon, peptidler ve küçük proteinler büyük protein ve kalan hücre artıkları ayrılır sonucudur. Bu adımı peptidler proteomik deneylerde oluşturmak için peptidomic proteolitik sindirimi proteinlerin kullanımına eşdeğer olarak görülebilir.
- 5 mL 25 mm TEAB (sulu) filtreleri ve 2500 g x, 15 dk santrifüj ve RT, peptidler kurtarılması artırmak için yükleyin.
- Girdap (bir sigara etiketli toplam 10 mL veya 15 mL isobarically etiketli örnek), iki önceki adımlardan gelen kombine FTs ve örnek asitleştirme için devam edin.
5. de-Tuzlama ve örnek temizlik katı faz çıkarma tarafından
- Filtre uygulanmış örnek adım 4.4 katı faz ayıklama (SPE) önce acidify. Asitleştirme SPE-kartuş durağan faz ile çözünen (peptid) etkileşimi geliştirmek için gerçekleştirilir.
- Sigara etiketli örnek için (Cilt 10 mL): 550 µL % 1 Trifluoroacetic asit (TFA) - örnek hacmi ekleyin: %0,05 10.55 mL TFA.
- İzobarik etiketli örnek için (Cilt 15 mL): 20 mL %0,1 ekleyin TFA acidify ve 3 ile % AcN konsantrasyonu % 1 - örnek hacmi: %0,066 30 mL TFA.
Not: TFA de işlevi için peptidler kendilerini yeterince güçlü hidrofobik etkileşiminin tutulacak SPE kartuşun ambalaj malzemesi ile yetenekli tutma artıran bir iyon eşleştirme reaktifi eklenir. - Eğer pH > 3, titre % 20 fosforik asit ile örnek örnek pH olana < 3.
- SPE kartuşları tarafından %84 AcN, %0,1 formik asit (FA) ve at ft tekrar bir kez 1 ml ek koşul. Kartuş filtre Klima aksi halde sonraki adımda peptidler birlikte elute istenmeyen maddeler kaldırmak için gereklidir; Ayrıca, Merkezi Klima filtresi geçirgenliği artar.
- Buna ek olarak 1 mL 0.1 tarafından SPE kartuş equilibrate % TFA, atmak FT. tekrar bir kez. Filtre son denge adımdan sonra - kuru çalışmaz sağlamak filtre üst kısmında küçük bir ses tutun. Denge kartuş filtre filtre Klima adımından yaptı hidrofobik madde (Asetonitril) kaldırarak peptidler korumak için hazırlamak amacıyla gerçekleştirilir.
- Gerekirse bazı çeşitli bölümlerinde tüm numune hacmi (10.55 mL etiketli olmayan örnekleri için veya isobarically etiketli örnekleri için 30 mL), yüklemek ve çalıştırmak içine atık FT izin. Kartuş mermi yükleme örnek arasında kuru çalıştırmayın ve son numune hacmi yüklendikten sonra - filtre üzerine küçük bir ses tutun emin olun.
- 1 mL %0.1 geçmek TFA süzgeçleri üzerindeki tuzları ve Kimyasalları kaldırmak ve bir kez FT. tekrar atmak için. Kartuşu her yıkama adımdan sonra - kuru çalışmadığından emin olun sıvı kartuş üstüne küçük bir hacim tutmak.
- Yer 1.5 mL düşük bağlama mikro santrifüj kapasitesi Kartuş altında tüpler ve örnek 1 mL % 84 geçirerek elute AcN, % 0,1 SK kartuş üzerinde.
- Çözücüler buharlaşma ezelî kuru kadar etkin Isıtma-80 ° C'de depolamak ya da hemen yüksek pH ayırma için devam çalıştırmak bir vakum santrifüj içinde de-tuzlu örnekten kaldırmak.
6. çevrimdışı yüksek pH ters faz HPLC örnek ayırma
-
Sulu yüksek-pH (YBH) mobil aşamaları hazırlayın:
YBH arabellek A: Saf su
YBH arabellek B: %84 AcN
YBH arabellek C: 25 mM NH4OH
Arabellek YBH yükleme: 2.5 mM NH4OH, %2 AcN
Not: YBH yükleme arabellek taşıma çözüm ve örnek arabellek kullanılır - 16 µL arabellek YBH yükleme örnek 20 dk için nazik ajitasyon tarafından yeniden dağıtılması
- 96-derin-da tabak Batth vd göre yapılandırılmış bir iç kesir toplayıcının 15 µL örnek bir HPLC sistemi üzerinde yükleyin 20 küçük değişiklikler ile. 100 µL/min bir akışı bir pH-kararlı ayrılık sütun üzerinde (C18 3.5 µm, 2.1 mm x 250 mm) fractionate ve min başına bir kesir bir doğrusal 60 dk degrade toplamak.
- Aşağıdaki degrade zaman puan kullanın: t 0 dak, B = % 1, C = = %10; t 4 dk, B = % 1, C = = %10, başlangıç kesir koleksiyonu; t 76 dk, B = % 70, C = = %10; sonunda kesir koleksiyonu; t 76,5 min, B = % 85, C = = %10; t 80 dk, B = % 85, C = = %10; t 80,5 min, B = % 1, C = % 10 ve t = 90 dk, B = % 1, C = = %10.
- Böylece 12 kesirler her 6 art arda eklenmiş alt kesir içeren kaynaklanan 12 dk tarafından aralıklı kesirler birleştirerek oluşan bir dairesel düzende 12 kuyu içinde hkr kesirler toplamak.
- Çözücü tarafından RT ve 3000 rpm kadar kuru vakum Santrifüjü örnekleri çıkarın ve örnekleri-80 ° c LC-MS analiz önce saklayın.
7. LC-MS
-
Sulu mobil aşamaları hazırlayın:
Arabellek A: % 0,1 SK
Arabellek B: % 0,1 SK, %84 AcN
Yükleme arabellek: % 0.05 TFA, %2 AcN
Not: arabellek yük taşıma çözüm, örnek arabellek ve yükleme pompa mobil faz olarak kullanılır. - Her biri 12 kesirler için 20 dk RT titreyerek ve arabellek yükleme 6 µL eklenmesi tarafından yeniden dağıtılması
- Yük 5 µL örnek üzerinde tuzak sütun yapılandırmada çalışma bir nano-akış HPLC (tuzak sütun: 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å gözenek boyutu, 3 µm partikül büyüklüğü; ayrılık sütun: C18, 75 µm x 500 mm, 100 Å gözenek boyutu, 2 µm parçacık boyutu ve peptid ayrılık 150 nL/dk aşağıdaki degradenin kullanarak akış hızında gerçekleştirmek: t = 0 dak, B = %2; t = 10 dk, B = %2; t = 11 dk, B = %7; t 100 dk, B = % 26; = t = 170 dk, B = %45; t = 175 min, B = %80; t 181 min, B = %2 ve t = 210 min, B = = % 2.
-
MS HPLC bir nano-ESI arayüzü üzerinden bağlı yüksek çözünürlüklü hibrid Kütle Spektrometre gerçekleştirin. Tam tarama spectra 350-1400 m/z aralığında 120.000 (2.0e5 AGC hedef) çözünürlük ayarı, MS modunda kaydedin.
- Kütle Spektrometre veri bağımlı satın alma modunda işletmek, MS/MS spectra en iyi on en yoğun doruklarına m/z > 150 ile ve yoğunluk aralığı 1.0e4-1.0e5 parça iyon analiz için içinde seçin. %60 1 m/zquadrupole yalıtım penceresi, en büyük enjeksiyon zaman 100 ms ve RF lens kullanarak habercisi iyonları yalıtmak.
- Bir hariç tutma süresi 15 dinamik dahil etmeme geçerli s ve m/z hoşgörü ±10 ppm. Parçalanma çarpışma daha yüksek enerji ayrılma (PİLGRİM6A) hücreye gerçekleştirmek ve orbitrap bir çözünürlük ayarı 50.000 (5.0e4 AGC hedef değeri), MS/MS satın almalar kaydetmek.
8. peptid tanımlama
-
Peptid tanımlama için elde edilen .çiğ-dosyalarından kitle spektrometrik analizi aşağıdaki ayarları uygulanıyor proteomik arama motoru için gönderin:
Not: bizim önceki15, üç arama motorları çalışma; Burada belirtilen ayarları tüm üç arama motorları için aksi belirtilmediği sürece istihdam edildi ve maskot v2.4, Sequest HT ve tepeler v7.5 paralel olarak kullanıldı. Ayarlanabilir ayarları çoğunluğu peptit/protein tanımlama için evrensel ve ilgili ayarları herhangi bir arama motorunda olmalıdır.
Spektrum seçici:
Min. habercisi kitle: 350 Da
Max. öncü kitle: 5. 000'da
Tarama türü: tam
Sinyal/gürültü eşik: 1.5
Sıra veritabanı arama
Veritabanı: UniProt_SwissProt [version2015_11]
Taksonomi: Homo sapiens
Enzim: hiçbiri
Max. İçkilerimiz cevapsız: 0
Enstrüman (sadece maskotu): ESI-tuzak
Min. peptid uzunluğu (sadece SequestHT): 6
Max. peptid uzunluğu (sadece SequestHT): 144
Öncü kitle tolerans: 15 ppm
Parçası kitle tolerans: 0,05 Da
Statik değişiklikler: Carbamidomethyl (C); [Etiketli Eğer] TMT10plex (N-terim)
Dinamik değişiklikler: oksidasyon (M); [Etiketli Eğer] TMT10plex (K)
Peptid spektrumlu maç (PSM) doğrulayıcı
Süzücü (maskotu ve Sequest HT sadece) veya yem füzyon (sadece tepeler)
Hedef FDR: 0,01
Doğrulama dayalı: q-değer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan yöntemi uygulanan ve örnek ön ayırma (tablo 1) getirilmesi önce üç çalışmalar değerlendirildi. İlk çalışma çevrimdışı LC CSF kesirler maldı hedef tabağa tespit için kullanılan ve 730 tanımlanan endojen peptidler11' sonuçlandı. İki aşağıdaki çalışmalarda, izobarik etiketleme istihdam edildi. Öncelikle bir vaka/kontrol içinde çalışma kimlik belgesi ve olası biyolojik CSF endopeptidome ve Proteom karakterizasyonu için aynı anda24ve ikinci çalışma izobarik etiketleme içinde tedavisinin etkileri içinde vivo izleme için kullanılan CSF peptid ifadede 36 s16üzerinde bir γ-secretase engelleyici. Vaka/kontrol çalışması 437 endojen peptidler tespit edilmiştir, 64 hangi önemli ölçüde değişmiş reklam ile bireyler arasındaki konsantrasyon ve sağlıklı kontrol. Üçüncü, tedavi çalışma, 1798 endojen peptidler tespit, tedaviye yanıt için izlenen peptidler 11 gösterilebilir.
Dördüncü çalışmada, özellikle alt bol peptidler tanımlamak için tanımlanan CSF peptidler sayısını artırmak için amacı oldu. Bu nedenle, peptid ön ayırma YBH-RP Kromatografi tarafından dahil edildi ve 16,395 peptidler tanımlaması içinde kaynaklanan bir 10 kat daha büyük CSF numune hacmi kullanıldı. Bu çalışmada, hiçbir izobarik etiketleme gerçekleştirildi. Örnek ayırma yanı sıra, en son çalışmanın bir kombine peptid kimlik istihdam yaklaşım, ilk üç çalışmalarda sadece bir tek veritabanı araması yapılır ise, bazı ölçüde hesapları peptidler daha fazla sayıda için için teşhis etti. En son çalışma tek tek arama motorları (maskotu, Sequest HT veya tepeler) tarafından elde edilen sonuçları karşılaştırarak gösterir bir dereceye kadar beri nispeten az miktarda tamamlayıcı kullanılan algoritmaları vardır, daha az % 15 (2440), peptidler vardır tüm üç arama motorları (Şekil 2) tarafından tanımlanır. Ayrıca, de novo-tepeler olsaydı 5.400 peptidler tespit edilmiştir değil daha verimli tanımlayıcı endojen peptidler, ama daha fazla (Şekil 2) kullanılan arama motoru DORUKLARINA yapıldı en sıralama. Birkaç arama motorları aynı malzeme üzerinde uygulama birden çok test sorunları potansiyeli ve bu tanıma doğruluğu13bir test ile ele alındı. Alınan ham MS/MS veri yanı sıra en son deneme proteomik aramalarında elde tüm sonuçları tanımlayıcısı PXD004863 ile gurur veri deposu ProteomeXchange üzerinden kullanılabilir olan.
Şekil 1: yönteminin başlıca adımları görselleştirme bir protokol düzeni. Beyin omurilik sıvısı lumbar ponksiyon çözünür olmayan malzeme, 2 çıkarmak için Santrifüjü tarafından takip tarafından çıkarılması) yanı sıra, endojen peptidler kurtarılması artan peptid-protein toplamları ayırmak için GdnHCl örnek; azaltma ve sistein disulphides alkillenme; endojen peptidler proteinler, 4 ayrı moleküler ağırlık filtrasyon) izobarik peptid miktar (isteğe bağlı) 3 için etiketleme) tuzları ve 5 kutup diğer kirleri çıkarmak için katı faz ayıklama) RP HPLC ön ayırma, alkalin mobil faz degrade ve her 12inci kesir birleşimi 6) RP HPLC-MS/MS, asidik mobil faz degrade, art arda eklenmiş her kesir çalıştırmak arka arkaya, 7) tüm 12 analiz metinler MS/MS verileri göndererek gerçekleştirilen peptid kimlik bir peptid kimlikleri karşılaştırıldı arama motorları, daha sonra tek örnek ve tüm benzersiz peptid kimlikleri toplamı uygulandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Çalışma Özeti | TMT (e/h) etiketleme | YBH-RP ayırma (e/h) | CSF MS-analiz (µl) başına karşılık gelen hacmi | Tanımlanan peptidler sayısı | Yorum | Başvuru |
| Yönler CSF peptidome analizi | n | n | 500 | 730 | Çevrimdışı LC maldı hedef hazırlık, maldı-MS; MWCO filtreleri değerlendirilmesi | 4 |
| CSF peptidler nicel karşılaştırılması; 8 reklam örnekleri + 8 Ctrl | y | n | 200 | 437 | HPLC-ESI MS; kombine peptidomic ve proteomik Protokolü | 25 |
| Reklam gama secretase inhibitörü tedavisi çalışma | y | n | 300 | 1798 | HPLC-ESI MS; Altı saat noktalarda tedaviden sonra çıkarılan CSF | 17 |
| CSF peptidome genişletilmesi | n | y | 750-1000 | 18.031 | HPLC-ESI MS; peptid kimlik yazılımlar birleşimi | 15 |
Tablo 1: Son yıllarda yapılan çalışmalarda moleküler ağırlık filtrasyon ve kitle spektrometrik analiz insan CSF endojen peptidler tanımlaması için geçerlidir bu grup tarafından gerçekleştirilen bir derleme.
Şekil 2: peptid kimlik sonuçları karşılaştırarak bir Venn Şeması her üç arama motorları elde maskotu, Sequest HT ve tepeler. 16,395 endojen peptidler toplam tespit edildi. De novo-arama motoru DORUKLARINA sıralama tespit 10,967 endojen peptidler; Maskot parçası-iyon parmak izi tabanlı arama motorları ve Sequest HT 8118 ve 7304 endojen peptidler sırasıyla tespit edilmiştir. Tüm üç arama motorları arasında kimlik fikir birliği 2440 endojen peptidler veya % 14.8 olarak gerçekleşti. Maskot ve Sequest HT, kombine peptid kimliklerinin % 70'i için karşılık gelen arasında nispeten büyük kimlik örtüşme vardı. ZİRVELERİ vardı nispeten küçük bir kimlik üst üste maskotu ve Sequest HT; ile %20,5 ve % 18.9 sırasıyla. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir yüksek-pH RP HPLC ön ayırma adım endojen peptidler kurtarılması için daha önce gelişmiş bir iletişim kuralı için moleküler ağırlık Ultrafiltrasyon11 tarafından getirilmesi göreli örnek karmaşıklığı azaltmak ve böylece bir 5-fold daha büyük için izin belirlenmesi için numune hacmi. Bu, sırayla, peptidler her kesir mevcut alt kümesini konsantrasyonu artar ve böylece düşük bol peptidler algılama olasılığını geliştirilmiş.
Bir kimlik stratejisi için üç proteomik yazılımları paralel olarak istihdam endojen peptidler gerçekleştirerek, bilinen CSF endopeptidome 10 kat daha fazla genişletmek mümkündü. 16,395 endojen peptidler toplam bir havuza alınan CSF örnek malzeme üzerinde bir ön denemede tespit edildi. Kimlikleri arasında çok sayıda endojen peptidler yukarıda belirtildiği nörodejeneratif hastalıklar bağlamında proteinler elde edildi. Bizim laboratuvar biyolojik olarak birkaç peptidler yukarıdaki çalışmalarda tespit şu anda değerlendirilen. Bu işlem ile sentetik analogları ağır izotoplar, peptid istikrar depolama sırasında değerlendirme hedeflenen kitle spektrometrik deneyleri kurulması ile etiketli CSF spiking peptidler kimlik doğrulaması da dahil olmak üzere birkaç adım içerir ve donma-çözülme çevrimleri ve analizi, mühendislerimizin farklı klinik birlik.
Değişiklikler özgün iletişim kuralına giriş kirletici (Adım 2.5 ve 3.5) önlemek için GdnHCl MWCO-filtrasyon sırasında yüksek bir konsantrasyon örnek sonucu olarak yapılmıştır. Ön ayırma degrade (adım 6.3.1) için bir güncelleştirme yapıldığı, kapasite uzun süreli, doğrusal gradyan kullanılır.
Burada açıklanan protokolündeki analit kayıp birincil nedenleri iki RP Kromatografik adım gibi MWCO filtrasyon ve SPE örnek adım kadar temiz bağlanabilir.
Kayıp MWCO-filtre veya, filtrasyon sırasında muhafaza proteinler ile etkileşim nedeniyle önlemek için zor olan ve bir kaynak olabilir peptid Inter örnek varyasyon.
Daha fazla seçici kayıp büyük olasılıkla RP Kromatografik adımda ortaya çıkmaktadır. Peptid hydrophobicity pH bağımlı olduğu için iki ardışık RP Kromatografik, yüksek ve düşük adımları pH, sırasıyla, zararlarını çok üstünde belgili tanımlık sütun ve biraz benzer şekilde korunabilmesi için pH ≥9, hidrofilik peptidler alt neden olabilir alt korunabilmesi için pH ≤3 çok hidrofilik.
Kıyasla daha önce kullanılan yöntemleri öncesi ayırma istihdam endojen peptidler tanımlaması 10 kat artış yol açmıştır. Evvelce tanımlanamayan peptidler, çok sayıda başarılı tespiti için izin verdi ve bu yüzden çalışma ve keşif CSF peptidome ve muhtemelen diğer karmaşık biyolojik örnekler de değerli bir araçtır.
Çoğaltılmış izobarik protokol daha fazla biyomarker adayları çeşitli nörodejeneratif hastalıkları içinde CSF, kan ve beyin dokusu için tanımlamak için uygulanması amaçlanmıştır etiketleme ile birlikte.
Örnek hazırlama adımlarda değişen kurtarma CSF proteinlerin ve peptidler analizi için analitik varyasyon LC-Bayan gerçekleştirme izobarik peptidler örnek hazırlama azalır erken bir aşamada etiketleme tarafından böyle etkisi katkıda değişim büyük ölçüde. Daha önce raporlanmış örnek hazırlama iletişim kurallarına göre yüksek pH ters faz peptid ön ayırma uygulanması bir faktör 5 tarafından tanımlanan peptidler sayısı arttı. MS/MS-verilerden endojen peptidler tanımlaması önemli ölçüde farklı peptid kimlik yazılım programları, istihdam farklı arama algoritmaları birleştirirken düzelmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir rakip çıkarları, finansal veya diğer yazarlar arasında bildirilmiştir.
Acknowledgments
Çok zeki önder Batth ve meslektaşları kadar ön ayırma yöntemini ayarlama tavsiye için teşekkürler.
Bu eser İsveçli Araştırma Konseyi, Wallström ve Sjöblom Vakfı, silah ve Bertil Stohne Vakfı Stiftelse, Magnus Bergwall Vakfı, Åhlén Vakfı, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för finansman tarafından desteklenen Gamla Tjänarinnor, Knut ve Alice Wallenberg Vakfı, Frimurarestiftelsen ve FoU-Västra Götalandsregionen.
Bu proje için finansman Ana alıcılar Kaj Blennow, Henrik Zetterberg ve Johan Gobom vardı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
References
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).
- Spellman, D. S., et al. Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF. Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).
- Höglund, K., et al. Alzheimer's disease—Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria. Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).
- Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).
- Yuan, X., Desiderio, D. M. Human cerebrospinal fluid peptidomics. J Mass Spectrom. 40 (2), 176-181 (2005).
- Berven, F. S., et al. Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome. Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).
- Zougman, A., et al. Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).
- Holtta, M., et al. Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS. PLoS One. 7 (8), e42555 (2012).
- Holtta, M., et al. An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).
- Hansson, K. T., et al. Expanding the cerebrospinal fluid endopeptidome. Proteomics. 17 (5), (2017).
- Guldbrandsen, A., et al. In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR). Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).
- Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics. J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).
- Hölttä, M., et al. A single dose of the γ-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans. Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11 (2016).
- Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes. J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).
- Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis. J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).
- Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains. J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).
- Hölttä, M., et al. An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).
