Summary
Представлен метод для масс-спектрометрических анализа эндогенных пептидов в человека спинномозговой жидкости (CSF). Применяя молекулярный вес отключения фильтрации, хроматографического до фракционирования, масс-спектрометрических анализа и последующего сочетание стратегий идентификации пептид, удалось расширить известные ФГО peptidome почти в десять раз по сравнению с предыдущими исследованиями.
Abstract
Этот протокол описывает метод для выявления эндогенного пептидов в человека спинномозговой жидкости (CSF). Для этой цели ранее разработанный метод, основанный на молекулярный вес производства (MWCO) фильтрации и масс-спектрометрических анализ в сочетании с шагом до фракционирования ВЭЖХ автономной высоком рН обратной фазы.
Секреция в спинномозговой жидкости является основным каналом для удаления молекул пролить клетки центральной нервной системы. Таким образом многие процессы в центральной нервной системе, отражены в спинномозговой жидкости, что делает его ценным диагностическим жидкости. CSF имеет сложные композиции, содержащие белки, которые охватывают диапазон концентрации 8-9 порядков. Кроме белков предыдущие исследования также продемонстрировали наличие большого числа эндогенного пептиды. В то время как менее широко изучены чем белков, они также может проводить потенциальный интерес как биомаркеров.
Эндогенные пептиды были отделены от содержание белка в спинномозговой жидкости через MWCO фильтрации. Удаляя большинство содержание белка из примера, можно увеличить объем образца учился и таким образом также общее количество эндогенного пептиды. Сложность смесь фильтруют пептид был рассмотрен, включая фазу обратный шаг до фракционирования ВЭЖХ (RP) в щелочной рН до анализа LC-MS. Фракционирование в сочетании с простой конкатенации схема, где 60 фракций были объединены в 12, потребление времени анализа может быть уменьшено таким образом все еще в значительной степени избегая совместное Элюирующий.
Автоматизированный пептид идентификации была выполнена с помощью трех разных пептидных/белков идентификации программ и впоследствии объединения результатов. Различные программы были взаимодополняющими, а не сопоставимы с менее чем 15% идентификаций, перекрываются между тремя.
Introduction
Биомаркеры в спинномозговой жидкости (CSF) в настоящее время превращения исследований в нейродегенеративных расстройств. В болезни Альцгеймера, наиболее распространенных нейродегенеративных расстройств, влияющих на более чем 60 миллионов человек во всем мире1,2, биомаркер триплет, состоящий из пептида амилоида бета, стабилизации микротрубочек белка Тау и фосфорилированных Тау формы, можно обнаружить болезнь с высокой чувствительностью и специфичностью и была включена в диагностических исследований критерии3. В других нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и рассеянный склероз протеомических исследований выявили многочисленные биомаркера кандидатов, некоторые из которых в настоящее время оценки в клинические исследования4,5 ,6.
Наряду с белков СМЖ также содержит обилие эндогенного пептиды7,8,9,10,,1112. Составляя продукты расщепления многих мозга, полученных белков, эти пептиды также представляют собой потенциально важным источником болезни биомаркеров. Чтобы увеличить перечень выявленных эндогенного пептидов в человека Ликвора и включить ФГО endopeptidomic анализы в клинических исследованиях, был разработан метод для пробоподготовки и анализа LC-MS (схема краткий протокол были включены в Рисунок 1 ). Применение этого метода в недавнем исследовании привело к идентификации почти 16400 эндогенного ФГО пептидов в проб имелось спинномозговой жидкости от нескольких особей диагноз неспецифические, расширения известных endopeptidome ФГО десятикратный13. Метод при необходимости может использоваться в сочетании с Изобарический маркировки подход для количественной оценки.
Подготовка образца
Основным источником белка массы в спинномозговой жидкости является плазмы составляющих (например, альбумин и иммуноглобулины) прохождение крови мозга барьер14,15. Их высокое обилие затрудняет обнаружение низкого обильные, мозга, полученных образцов компонентов. Эндогенные пептиды могут быть легко отделены от высокой обильные протеины, тем самым позволяя значительно больший объем ФГО пептид экстракт использоваться для анализа LC-MS, тем самым позволяя обнаружения нижнего обильные пептидов.
В протоколе, представленные здесь молекулярный вес фильтрации производства (MWCO) был использован для отдельные пептиды спинномозговой жидкости от белковых фракций; метод, который был использован в нескольких предыдущих исследований8,9,10,11,12,16. Фильтрации шаг последовал автономной шаг до фракционирования RP ВЭЖХ, над градиентом высоком рН подвижная фаза. Выполнив два RP HPLC шаги в тандеме, с рН, что основное различие, разница в селективности между двумя этапами объясняется главным образом изменены пептид удержания вследствие разных пептидных обязанности государств. Применение предварительно фракционирование пептид высоком рН до LC-MS кислых условиях оказалась эффективной в повышении пептид идентификации17,18и даже превосходить для этой цели в сложных биологических по сравнению с более ортогональных разделения режимов19, как сильный Кот ионного обмена (SCX) и RP20образцов. Сократить время анализа, была использована схема объединения, объединения каждые 12 дробьй (например, дроби 1, 13, 25, 37 и 49), который благодаря высокой разрешающей способности RP HPLC по-прежнему в значительной степени избежать совместное Элюирующий пептидов из различных фракций в LC-MS шаг20,21.
Идентификация пептидов
Идентификация пептидов в peptidomic исследованиях отличается от протеомических исследований в том, что нет фермента расщепление может быть указано в поиск по базе данных, и как следствие, показатели идентификации обычно ниже11. Недавнее исследование13 показал, что уровень идентификации эндогенного пептиды, полученные с Sequest и талисман существенно были улучшены когда скоринга алгоритм программы соответствующего программного обеспечения по умолчанию была изменена с помощью адаптивного скоринга алгоритм, кофеварки, указав, что оптимальные алгоритмы скоринга для эндогенного пептиды отличается от tryptic пептидов13. В этом исследовании, идентификации на основе автоматического пептид de novo виртуализации с помощью программного обеспечения ПИКОВ (BSI) был найден будет дополнять два фрагмента Ион отпечатков пальцев-на основе поисковых систем, что приводит к значительно больший набор определенных пептиды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Описанные ниже протокол является изысканной версии используется в предыдущем исследовании, где большое количество эндогенных пептиды были определены в человека ФГО15. Обновления для исходного протокола включают незначительные изменения к химической предварительной обработки спинномозговой жидкости, а также оптимизация градиента, используемого для автономных высоком рН RP HPLC до фракционирования.
Этические соображения
Все исследования шведского пациента и контроля материалов были одобрены этические комитетам: St. Йёран (ref. 2005-554-31/3). Образцов спинномозговой жидкости из когорты деменция Амстердам и образцы, собранные в национальном госпитале для неврологии и нейрохирургии, Лондон были использованы для исследований с письменного согласия от всех участвующих пациентов и одобрения от этики региональных комитетов. Материал, здесь используются главным образом состоял из оставшихся Ликвора из образцов, взятых с целью диагностики и было обезличенных перед включением в наших исследованиях. Нет возможности отслеживания обратно образца любой индивидуальный донору или группе доноров.
1. Добыча человека спинномозговой жидкости (CSF):
- Экстракт спинномозговой жидкости через Люмбальная пункция (должны быть выполнены путем квалифицированного врача) с использованием стандартного протокола22.
- Удаление мусора клеток и других материалов, нерастворимых центрифугированием в 2500 g x 20 мин.
- Осмотрите образцов спинномозговой жидкости для обесцвечивания, которые могут свидетельствовать о крови загрязнение в результате прокола кровотечения. Значительно выше концентрации белка в крови и присутствие протеаз может значительно повлиять на результаты анализа.
2. Предварительная обработка ликвора (1,5 мл объем образца, не количественная оценка):
- Оттепель 1,5 мл аликвоты Ликвора при комнатной температуре (RT), передавать содержимое 10 мл полипропиленовые трубы и 80 мкл 1 М Triethylammonium бикарбонат (СТОС) как буферизации агента.
- Добавить 0,65 мл 8 M Гуанидиновые гидрохлорид (GdnHCl) (активные концентрации GdnHCl: 2,4 М) и вихревой мягко на RT на 10 мин.
Примечание: Агент chaotropic, GdnHCl, как влияет на вязкость растворителя и взаимодействует с цепи полипептида, что приводит к белка, разворачивается в энергетически благоприятных23. Таким образом GdnHCl растворяет белки агрегатов и увеличивает восстановление эндогенного пептидов при последующей фильтрации. - 60 мкл 200 мм водных tris(2-carboxyethyl) фосфин гидрохлорид (TCEP) (активные концентрации TCEP: 6 мм) и Инкубируйте на 55 ° C за 1 ч до уменьшения дисульфидов цистеина.
- 35 мкл iodoacetamide 400 мм (IAA) (концентрация активных IAA: 4 мм) и Инкубируйте на RT в темноте за 30 мин до алкилата которым. Добавление группы алкил гарантирует, что остатков цистеина не может сформировать спонтанно новые мосты дисульфида в любой момент во время последующих пробоподготовки.
- Добавление 3.25 мл деионизированной воды и вихревой кратко для разбавления образца до MWCO фильтрации, что приводит к общей выборки объемом 5,5 мл. Этот шаг служит для разбавленных GdnHCl к ниже 1 М, как более высокая концентрация наблюдается иногда вызывают выщелачивания полимерных веществ из фильтра устройств.
3. Предварительная обработка ликвора (10 x 150 мкл пример объем, Изобарический маркировки-количественная оценка):
- Оттепель 150 мкл аликвоты Ликвора из 10 лиц на RT и впоследствии передать содержимое отдельных 1,5 мл low привязки микро пробирок и мкл 8 1 м СТОС буферизации агента.
- 65 мкл 8 M GdnHCl (активные концентрации GdnHCl: 2,4 М) и вихревой мягко на RT на 10 мин.
- Мкл 6 200 мм водный TCEP (активные концентрации TCEP: 6 мм) и инкубации при 55 ° C за 1 ч до уменьшения дисульфидов цистеина.
- Добавить 3,5 мкл 400 мм водный IAA (концентрация активных IAA: 6 мм) и Инкубируйте на RT и тьмы на 30 мин алкилата которым.
- Подготовить Изобарический маркировки комплект (например., тандем массы тег 10plex Изобарический маркировки реагента). Разрешить Изобарический маркировки реагент флаконы для достижения RT перед открытием их избежать ненужных реагент гидратации, 41 мкл ВЭЖХ класс Ацетонитрил (АКС) и растворяют мягкий агитации за 5 мин.
- Передача 30 мкл раствора Изобарический маркировки реагент на соответствующие примеры и инкубировать 1 час на RT под нежным агитации. Изобарический маркировки реагент включает группу ГСЗ Эстер, который реагирует с первичных аминов, присутствующих на пептидной N-Термини, а также с остатками лизина.
- Мкл 8 5% гидроксиламина (активные концентрации гидроксиламина: 0,16%) и слегка встряхните в RT для 20 минут чтобы утолить маркировки реакции. Так как отдельно помечены образцы должны быть объединены, убедитесь, что маркировки реакция угасает. Путем добавления обилие Амин групп в виде гидроксиламина оставшиеся Изобарический маркировки реагент разрешено реагировать и таким образом оказывается инертным.
- Объединить содержимое каждого из 10 индивидуально маркированные образцов в одной 15 мл полипропиленовые трубы.
- Добавить 6.4 мл деионизированной воды в комбинированных образца и вихревой кратко для снижения концентрации AcN от 12% до 3% и концентрации GdnHCl GdnHCl к ниже 1 М, как более высокая концентрация наблюдается иногда вызывают выщелачивания полимерных веществ из фильтра устройств.
4. Молекулярный вес отключения фильтрации
- Во избежание потенциальных загрязнителей, состояние MWCO фильтров путем загрузки 10 мл водного раствора 1 М GdnHCl, 25 мм СТОС и центрифугирование 15 мин на 2500 x g и RT, отбросить проточный (FT).
- Загрузить весь образец тома на фильтр (5 мл-помечены CSF (шаг 2.5) или 10 мл isobarically, меченного CSF (шаг 3.9)) и центрифуги для 30 мин при 2500 x g и RT, оставить проточный (FT) в контейнере коллекции. Результат фильтрации является, что небольшие белков и пептидов отделены от крупных белков и остаточного ячейки мусор. Этот шаг можно рассматривать как peptidomic эквивалентен использованию протеолитических переваривание белков генерировать пептидов в proteomic экспериментов.
- Загрузите 5 мл 25 мм СТОС (водный) на фильтры и центрифуги для 15 мин на 2500 x g и RT, чтобы увеличить восстановления пептидов.
- Вихревой комбинированных ФНС от двух предыдущих шагов (всего 10 мл маркировкой или 15 мл isobarically, меченного образец) и приступить к подкислению образца.
5. де соления и образец очистки экстракцией твердой фазы
- Подкислять отфильтрованных образца от шага 4.4 до извлечения твердой фазы (SPE). Подкисление выполняется для того, чтобы улучшить взаимодействие растворимое (пептид) с неподвижной фазой SPE-картриджа.
- Для образца не помечены (объем 10 мл): 550 мкл 1% Trifluoroacetic кислоты (ТФК) - общий объем образца: 10.55 мл 0,05% TFA.
- Для образца Изобарический помечены (объем 15 мл): добавить 20 мл 0,1% TFA подкислять и снизить концентрацию AcN от 3% до 1% - общий объем образца: 30 мл с 0,066% TFA.
Примечание: TFA также добавляется для своей функции как Ион сопряжения реагента, который улучшает удержание пептидов, сами не способны достаточно сильного гидрофобные взаимодействия с упаковочного материала SPE картриджа будет сохранена. - Если рН > 3, титровать образца с 20% фосфорной кислоты до pH образца является < 3.
- Условие картриджи SPE путем добавления 1 мл 84% AcN, 0.1% муравьиной кислоты (ФА), и отменить FT. повторить один раз. Принадлежности картридж фильтра требуется для удаления нежелательных веществ, которые бы в противном случае элюировать наряду с пептидами в последующих шагах; Кроме того кондиционирования увеличивается проницаемость фильтра.
- Сбалансировать картридж SPE путем добавления 1 мл 0,1% TFA, отбросить FT. повторить один раз. Убедитесь, что фильтр не сухой после последнего шага уравновешивания - сохранить небольшой объем верхней части фильтра. Уравновешивания картридж фильтра выполняется для того, чтобы подготовить фильтр, чтобы сохранить пептиды, удалив гидрофобное вещество (ацетонитриле) слева от принадлежности шаг.
- Загрузить весь образец тома (10.55 мл для образцов, не маркированы или 30 мл для isobarically, меченного образцов), в несколько частей, при необходимости и пусть футов запустить в отходы. Убедитесь, что картридж не иссякнет между пример загрузки раундов или после загрузки последней объем образца - сохранить небольшой объем верхней части фильтра.
- Пройти 1 мл 0,1% TFA через фильтры для удаления соли и реагентов и отбросить FT. повторить один раз. Убедитесь, что картридж не сухой после каждой стирки шаг - сохранить небольшой объем жидкости на верхней части картриджа.
- Место 1,5 мл низкой привязки микро центрифуга трубы под патрон и элюировать образец путем передачи 1 мл 84% AcN, 0.1% Англии над картриджа.
- Удалите растворителей из де соленый образца испарением в вакуумной центрифуги, работать без активного отопления до полного высыхания, хранить при температуре-80 ° C или немедленно приступить к высоком рН фракционирования.
6. автономный высоком рН обратный фазы ВЭЖХ образца фракционирования
-
Подготовьте водный высоком рН (РВД) подвижных фазах:
A: буфера РВД Чистой воды
РВД буфера B: AcN 84%
РВД буфера C: 25 мм NH4OH
РВД загрузки буфера: 2,5 мм NH4OH, 2% AcN
Примечание: РВД загрузки буфера используется как транспортные решения и пример буфера - Повторно растворить образца в 16 мкл РВД загрузки буфера нежный агитации за 20 мин
- Загрузить 15 мкл пример ВЭЖХ системы с сборщика внутреннюю часть 96-штанхглубинных пластин настроена согласно Батт и др. 20 с небольшими изменениями. Фракционировать на поток 100 мкл/мин над столбцом рН stable разделения (C18 3,5 мкм, 2,1 мм x 250 мм) и собирать одной фракции в минуту через градиент линейной 60 мин.
- Используйте градиент время следующее: t = 0 мин, B = 1%, C = 10%; t = 4 мин, B = 1%, C = 10%, начало часть коллекции; t = 76 мин, B = 70%, C = 10%; конец часть коллекции; t = 76,5 мин, B = 85%, C = 10%; t = 80 мин, B = 85%, C = 10%; t = 80,5 мин, B = 1%, C = 10% и t = 90 мин, B = 1%, C = 10%.
- Сбор фракций многократно в 12 скважин в круговую диаграмму, таким образом, объединение фракций, расположенных на 12 мин, в результате 12 фракций, каждая из которых содержит 6 сцепленные суб фракций.
- Удаление растворителя из образцов центрифугированием вакуума в RT и 3000 об/мин до полного высыхания и хранить образцы на-80 ° C до анализа LC-MS.
7. LC-MS
-
Подготовьте водный подвижных фазах:
Буфера ответ: FA 0.1%
Буфер B: FA 0.1%, 84% AcN
Загрузка буфера: 0,05% TFA, 2% AcN
Примечание: Загрузка буфера используется как транспортное решение, буфер образца и подвижная фаза для загрузки насоса. - Повторно распустить каждый из 12 фракций путем добавления 6 мкл загрузки буфера и тряски на RT для 20 мин
- Нагрузки 5 мкл пример на нано потока ВЭЖХ, работающих в ловушку колонке конфигурации (столбец ловушка: 75 мкм x 2 см, C18, 100 Å размер поры, 3 размер частиц мкм; разделения столбцов: C18, 75 мкм x 500 мм, 100 Å размер поры, 2 размер частиц мкм и выполнять разделение пептид со скоростью потока 150 нл/мин с использованием следующих градиента: t = 0 мин, B = 2%; t = 10 мин, B = 2%; t = 11 мин, B = 7%; t = 100 мин, B = 26%; t = 170 мин, B = 45%; t = 175 мин, B = 80%; t = 181 мин, B = 2% и t = 210 мин, B = 2%.
-
Выполните MS с высоким разрешением гибридный масс-спектрометр подключен к ВЭЖХ через интерфейс нано ESI. Записывать спектры полное сканирование в режиме MS на разрешение 120.000 (2.0e5 СМЖЛ целевой) m/z диапазоне 350-1400.
- Действуют масс-спектрометр в режиме приобретения зависящих от данных, выберите МС/МС спектры из Топ 10 наиболее интенсивных пиков с m/z > 150 и в пределах 1.0e4-1.0e5 диапазон интенсивности для анализа фрагмента Ион. Изолируйте ионов прекурсоров с помощью квадрупольного изоляции окна 1 m/z, максимальная инъекции время 100 мс и РФ объектив на 60%.
- Применение динамического исключения исключения время 15 s и m/z допуском ±10 ppm. Выполнение фрагментации в выше столкновение энергии диссоциации (HCD) клеток и записывать МС/МС приобретений в Орбитрэп на разрешение 50000 (5.0e4 СМЖЛ целевое значение).
8. пептидные идентификации
-
Для идентификации пептид представить полученные .raw файлы из масс-спектрометрических анализа для протеомики поисковая система применения следующих параметров:
Примечание: В наших предыдущих исследования15, три поисковых систем; Параллельно были использованы талисман v2.4, Sequest HT и вершины v7.5 и заданные здесь были наняты для всех трех поисковых систем, если не указано иное. Большинство регулируемые параметры являются универсальными для идентификации пептида/белков и должны иметь соответствующие параметры в любой данной поисковой системе.
Спектр выбора:
Min. прекурсоров массы: 350 да
Макс. прекурсоров массы: 5000 да
Тип сканирования: полный
Пороговое значение сигнал/шум: 1.5
Поиск по базе данных последовательности
База данных: UniProt_SwissProt [version2015_11]
Таксономии: Homo sapiens
Фермент: нет
Макс. пропустили раскол: 0
Инструмент (только талисман): ESI-ловушка
Минимальная длина пептида (только SequestHT): 6
Макс. Длина пептида (только SequestHT): 144
Прекурсоров массового терпимости: 15 ppm
Фрагмент массового терпимости: 0,05 да
Статический модификации: Carbamidomethyl (C); [Если помечены] TMT10plex (N-термин)
Динамические изменения: окисления (М); [Если помечены] TMT10plex (K)
Пептид спектр матч (PSM) проверки
Кофеварки (талисман и Sequest HT только) или манок Fusion (только пики)
Целевая ФДР: 0.01
На основе проверки: q значение
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Метод, описанный здесь применялся и оценены в трех исследованиях до введения образца до фракционирования (таблица 1). Первое исследование используется автономный LC для пятнать ФГО дроби на тарелку целевой MALDI и привели к11730 выявленных эндогенного пептиды. В двух следующих исследований было занято Изобарический маркировки. Главным образом в случае/управления исследования для идентификации и характеризации потенциальных биомаркеров в спинномозговой жидкости endopeptidome и протеом одновременно24и в втором исследовании Изобарический маркировки была использована для мониторинга эффектов лечения в естественных условиях ингибитора γ-secretase пептид выражения в спинномозговой жидкости над 36 h16. В случае управления исследовании были выявлены 437 эндогенного пептиды, 64 из которых значительно изменены в концентрации между людьми с AD и здорового контроля. Третий, лечение исследования, определены 1798 эндогенного пептиды, 11 Мониторим пептидов может быть доказано реагировать на лечение.
В четвертом исследовании цель заключалась в том, чтобы увеличить количество выявленных ФГО пептиды, особенно для определения нижнего обильные пептиды. Поэтому, предварительно фракционирование пептид хромотографией РВД-RP был включен и был использован десятикратного больший объем образца спинномозговой жидкости, что приводит к идентификации 16395 пептидов. В этом исследовании не Изобарический маркировки была выполнена. Помимо образцов фракционирования, Последнее исследование занятых комбинированных пептид идентификации подход, тогда как в первых трех исследований был выполнен только одной базы данных поиск, который для некоторых степени приходится большее количество пептиды определены. Сравнение результатов, полученных в отдельных поисковых системах (талисман, Sequest HT или пики) от последнего исследования указывает, что используемые алгоритмы являются в определенной степени взаимодополняющими, поскольку относительно небольшое количество, менее 15% (2440), пептидов в ходе всех трех поисковых систем (рис. 2). Кроме того, de novo-последовательности поиска, двигатель Пикс был наиболее эффективного выявления эндогенного пептиды, но больше чем 5400 пептиды не будет выявлено если только пики были использованы (рис. 2). Применение нескольких поисковых систем на тот же материал имеет потенциал тестирования несколько вопросов, и эта проблема была решена с проверкой правильности идентификации13. Необработанные данные МС/МС, а также все результаты, полученные в поисках proteomic от последнего суда предоставлены в хранилище данных гордость через ProteomeXchange с идентификатором PXD004863.
Рисунок 1: Схема протокола, визуализировать основные шаги метода. GdnHCl добыча спинномозговой жидкости, Люмбальная пункция следуют центрифугирования для удаления нерастворимых материалов, 2) Добавление образца не присоединяться агрегатов пептид белка, увеличение восстановления эндогенного пептиды; сокращение и алкилирования хвоща дисульфидов; Изобарический маркировки для количественной оценки пептида (необязательно) 3) фильтрации молекулярный вес отделить эндогенного пептиды от белков, 4) твердой фазы извлечения для удаления солей и других полярных загрязнений, 5) RP HPLC до фракционирования, щелочные Подвижная фаза градиента и конкатенации каждые 12th фракции, 6) RP ВЭЖХ-МС/МС, кислой подвижная фаза градиент, каждая фракция сцепленные работать последовательно, 7) пептида идентификации осуществляется путем представления МС/МС данных из всех 12 анализа работает как один образец в поисковых системах, впоследствии пептид идентификаторы были сопоставлены и суммирования всех уникальных пептидных идентификаторы была выполнена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Резюме исследования | TMT маркировки (y/n) | РВД-RP фракционирование (y/n) | Соответствующий объем спинномозговой жидкости в MS-анализ (мкл) | Количество выявленных пептиды | Комментарий | Ссылка |
| Исследовательский анализ спинномозговой жидкости peptidome | n | n | 500 | 730 | Автономный LC MALDI целевой подготовки, MALDI-МС; Оценка MWCO фильтров | 4 |
| Количественное сравнение пептидов спинномозговой жидкости; образцы из 8 AD + 8 Ctrl | y | n | 200 | 437 | ВЭЖХ ESI МС; Комбинированные peptidomic и протеомных протокол | 25 |
| AD гамма secretase ингибитор лечения исследование | y | n | 300 | 1798 | ВЭЖХ ESI МС; CSF извлечено в шести точках времени после лечения | 17 |
| Расширение peptidome спинномозговой жидкости | n | y | 750-1000 | 18.031 | ВЭЖХ ESI МС; сочетание пептид идентификации программного обеспечения | 15 |
Таблица 1: Сборник последних исследований, выполняемых этой группы, которая применяет фильтрации молекулярный вес и масс-спектрометрических анализа для идентификации эндогенного пептидов в спинномозговой жидкости человека.
2 фигуры: диаграмму Венна, сравнивая результаты идентификации пептида полученные от каждого из трех поисковых системах талисман, вершины и Sequest HT. В общей сложности 16395 эндогенного пептиды были определены. De novo-последовательность поиска двигатель ПИКОВ определены 10,967 эндогенных пептиды; фрагмент Ион отпечатков пальцев-на основе поисковых системах талисман и Sequest HT определены 8118 и 7304 эндогенного пептиды соответственно. Идентификации консенсус между всеми тремя поисковых систем составил 2440 эндогенного пептиды, или 14,8%. Существует относительно большой идентификации дублирование между талисман и Sequest ХТ, соответствует 70% от их отождествления комбинированных пептида. ПИКИ были сравнительно небольшой идентификации перекрываются с талисман и Sequest HT; 20,5% и 18,9% соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Введение к ранее разработанный протокол для восстановления эндогенного пептидов шаг RP HPLC предварительно фракционирование высоком рН молекулярный вес ультрафильтрации11 снижение относительной выборки сложности и таким образом позволяет для 5 раз больше объем образца необходимо изучить. Это, в свою очередь, увеличение концентрации подмножество пептидов в каждой фракции и тем самым улучшить шансы обнаружения низкого обильные пептиды.
Выполняя стратегию идентификации для эндогенного пептидов, которые заняты три программные proteomic параллельно, можно было расширить известные ФГО endopeptidome более чем 10 раз. В общей сложности 16395 эндогенного пептиды были выявлены в ходе предварительного судебного разбирательства на пуле материала образца спинномозговой жидкости. Среди опознавательные были большое количество эндогенных пептиды, полученные от белков, отмечалось ранее в контексте нейродегенеративных расстройств. В настоящее время несколько пептиды, определенных в вышеупомянутых исследований изучаются как биомаркеров в нашей лаборатории. Этот процесс включает несколько этапов, включая проверку пептиды тождества, пики Ликвора с синтетическими аналогами, помечены тяжелых изотопов, создание целевых масс-спектрометрических анализы, оценки пептид стабильность во время хранения и замораживания оттаивания циклов и анализа различных клинических когорты.
Во избежание введение загрязнителей (шаги 2,5 и 3,5) вследствие высокой концентрации GdnHCl в примере во время MWCO-фильтрации по оригинальному протоколу были внесены изменения. Обновление до фракционирования градиента (шаг 6.3.1) была сделана, используется потенциал длительное, линейный градиент.
Основными причинами потерь аналита в протоколе здесь описано может объясняться хроматографического двухэтапного RP, так MWCO фильтрации и пример SPE убирать шаг.
Пептид, трудно избежать потерь за счет взаимодействия с MWCO-фильтр, или белков, сохранить на нем, во время фильтрации и может быть источником Интер образца вариации.
Дальнейшего селективного потери вероятно возникают в RP-хроматографического шаги. Так как пептид гидрофобность зависит от рН, выполняя два последовательных RP хроматографического шаги на высоких и низких рН, соответственно, может привести к потерям подмножества пептидов, которые являются слишком гидрофильные на ≥9 рН будет сохранена на столбец и аналогично второй подмножество слишком гидрофильные на ≤3 рН будет сохранена.
По сравнению с ранее использовавшихся методов, которые занятости до фракционирования привела к десятикратного увеличения в идентификации эндогенного пептидов. Это позволило для успешного обнаружения большого числа ранее неизвестных пептидов и поэтому является ценным инструментом в изучение и освоение peptidome спинномозговой жидкости, и, возможно, других сложных биологических образцов.
В сочетании с мультиплексной Изобарический маркировки, которые протокол призван применяться для выявления биомаркера кандидатов для различных нейродегенеративных расстройств в спинномозговой жидкости, кровью и тканью мозга.
Различной восстановления на этапах подготовки образца способствует аналитической вариации для анализа ФГО белков и пептидов, LC-г-жа выполнение Изобарический маркировки пептидов на раннем этапе в образце подготовка уменьшается влияние таких Вариация значительно. По сравнению с ранее сообщалось образца подготовка протоколов, осуществление высоком рН обратной фазы пептид предварительно фракционирование увеличилось количество выявленных пептиды с коэффициентом 5. Идентификация эндогенного пептидов из MS/MS-данных был значительно улучшились, при объединении разных пептидных идентификации программного обеспечения программы, используя различные поисковые алгоритмы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Не поступало никаких конкурирующие интересы, финансовые или иные, между авторами.
Acknowledgments
Большое спасибо Танвир Батт и коллег за Советом в создании метода предварительно фракционирования.
Эта работа была поддержана финансирование от шведского исследовательского совета, Валлстрём и Шеблум фонд, пистолет и Бертиль СТОГНЕ фонд Stiftelse, Магнус Bergwall фонд, Фонд Åhlén, Alzheimerfonden, Demensförbundet, för Стифтельсен Gamla Tjänarinnor, кнут и Фонд Рауля Валленберга Алиса, Frimurarestiftelsen и Götalandsregionen FoU-Västra.
Основными получателями финансирования для этого проекта были Kaj Blennow, Хенрик Зеттерберг и Йохан Gobom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
References
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).
- Spellman, D. S., et al. Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF. Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).
- Höglund, K., et al. Alzheimer's disease—Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria. Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).
- Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).
- Yuan, X., Desiderio, D. M. Human cerebrospinal fluid peptidomics. J Mass Spectrom. 40 (2), 176-181 (2005).
- Berven, F. S., et al. Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome. Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).
- Zougman, A., et al. Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).
- Holtta, M., et al. Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS. PLoS One. 7 (8), e42555 (2012).
- Holtta, M., et al. An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).
- Hansson, K. T., et al. Expanding the cerebrospinal fluid endopeptidome. Proteomics. 17 (5), (2017).
- Guldbrandsen, A., et al. In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR). Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).
- Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics. J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).
- Hölttä, M., et al. A single dose of the γ-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans. Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11 (2016).
- Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes. J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).
- Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis. J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).
- Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains. J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).
- Hölttä, M., et al. An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).
