Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

मानव मस्तिष्कमेरु द्रव में Endopeptidomic विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी

Published: December 4, 2017 doi: 10.3791/56244
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1, 1,2, 1,2,3, 1,2
1Inst. of Neuroscience and Physiology, Dept. of Psychiatry and Neurochemistry, Sahlgrenska Academy at University of Gothenburg, 2Clinical Neurochemistry Laboratory, Sahlgrenska University Hospital, 3Department of Molecular Neuroscience, UCL Institute of Neurology

Summary

मानव मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) में अंतर्जात पेप्टाइड्स के मास spectrometric विश्लेषण के लिए एक विधि प्रस्तुत है । आणविक वजन कट-छानने का काम, क्रोमेटोग्राफिक पूर्व भिन्नीकरण, जन spectrometric विश्लेषण और पेप्टाइड पहचान रणनीतियों के एक अनुवर्ती संयोजन को रोजगार से, यह ज्ञात सीएसएफ peptidome विस्तार करने के लिए संभव था लगभग दस गुना की तुलना में पिछले अध्ययन करने के लिए ।

Abstract

यह प्रोटोकॉल मानव मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) में अंतर्जात पेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए विकसित विधि का वर्णन करता है । इस प्रयोजन के लिए, एक पहले से विकसित आणविक वजन कट-ऑफ (MWCO) निस्पंदन और मास spectrometric विश्लेषण के आधार पर विधि एक ऑफ़लाइन उच्च पीएच रिवर्स चरण HPLC पूर्व अंश कदम के साथ संयुक्त था ।

सीएसएफ में स्राव केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की कोशिकाओं द्वारा बहाया अणुओं को हटाने के लिए मुख्य मार्ग है । इस प्रकार, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में कई प्रक्रियाओं सीएसएफ में परिलक्षित होते हैं, यह एक मूल्यवान नैदानिक द्रव प्रतिपादन । सीएसएफ एक जटिल संरचना है, युक्त प्रोटीन है कि परिमाण के 8-9 आदेश की एक एकाग्रता रेंज अवधि । प्रोटीन के अलावा, पिछले अध्ययनों ने भी अंतर्जात पेप्टाइड्स की एक बड़ी संख्या की उपस्थिति का प्रदर्शन किया है । जबकि कम बड़े पैमाने पर प्रोटीन की तुलना में अध्ययन किया, ये भी के रूप में संभावित ब्याज पकड़ सकता है ।

अंतर्जात पेप्टाइड्स MWCO निस्पंदन के माध्यम से सीएसएफ प्रोटीन सामग्री से अलग किया गया । नमूना से प्रोटीन सामग्री के बहुमत को दूर करके, यह नमूना मात्रा का अध्ययन किया है और इस तरह के अंतर्जात पेप्टाइड्स की कुल राशि को बढ़ाने के लिए संभव है. निस्पंदन पेप्टाइड मिश्रण की जटिलता एक रिवर्स चरण सहित द्वारा संबोधित किया गया था (आरपी) क्षारीय पीएच पर HPLC पूर्व आंशिक कदम नियंत्रण रेखा से पहले-एमएस विश्लेषण. भिन्नीकरण एक साधारण संयोजन योजना के साथ संयुक्त किया गया था जहां ६० अंश 12 में जमा किए गए थे, विश्लेषण समय की खपत को इस प्रकार कम किया जा सकता है जबकि अभी भी काफी हद तक सह-रेफरेंस से परहेज है ।

स्वचालित पेप्टाइड पहचान तीन अलग पेप्टाइड/प्रोटीन पहचान सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग करके किया गया था और बाद में परिणामों के संयोजन । विभिंन कार्यक्रमों के बजाय पूरक थे तीन के बीच छा पहचान के कम से 15% के साथ तुलनीय ।

Introduction

मस्तिष्कमेरु द्रव में (सीएसएफ) वर्तमान में अनुसंधान neurodegenerative विकारों में बदल रहे हैं । अल्जाइमर रोग में, सबसे आम neurodegenerative विकार, दुनिया भर में ६०,०००,००० से अधिक लोगों को प्रभावित करने1,2, एक triplet पेप्टाइड amyloid बीटा, microtubule-स्थिर प्रोटीन ताऊ से मिलकर, और एक phosphorylated तौ रूप, उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ रोग का पता लगा सकते हैं, और नैदानिक अनुसंधान मानदंडों में शामिल किया गया है3। अन्य neurodegenerative रोगों में, जैसे पार्किंसंस रोग और मल्टीपल स्केलेरोसिस, proteomic अध्ययनों ने कई विमार्की उंमीदवारों की पहचान की है, जिनमें से कुछ में वर्तमान में मूल्यांकन के तहत नैदानिक अध्ययन4,5 ,6.

प्रोटीन के साथ, सीएसएफ भी अंतर्जात पेप्टाइड्स की एक बहुतायत7,8,9,10,11,12शामिल हैं । कई मस्तिष्क व्युत्पंन प्रोटीन के क्लीवेज उत्पादों का गठन, इन पेप्टाइड्स भी रोग के एक संभावित महत्वपूर्ण स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं । मानव सीएसएफ में पहचान अंतर्जात पेप्टाइड्स की सूची को बढ़ाने और नैदानिक अध्ययन में सीएसएफ endopeptidomic विश्लेषण सक्षम करने के लिए, एक विधि नमूना तैयारी और नियंत्रण रेखा के लिए विकसित किया गया था-एमएस विश्लेषण (एक संक्षिप्त प्रोटोकॉल योजना चित्रा 1 में शामिल किया गया है ). हाल के एक अध्ययन में इस विधि के आवेदन गैर विशिष्ट निदान के कई व्यक्तियों से परित सीएसएफ के नमूनों में लगभग १६,४०० अंतर्जात सीएसएफ पेप्टाइड्स की पहचान के परिणामस्वरूप, ज्ञात सीएसएफ endopeptidome दस गुना का विस्तार13. विधि वैकल्पिक रूप से ठहराव के लिए isobaric लेबलिंग दृष्टिकोण के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

नमूना तैयारी

सीएसएफ में प्रोटीन द्रव्यमान का मुख्य स्रोत प्लाज्मा घटक (जैसे एल्ब्युमिन और इम्युनोग्लोबुलिन) रक्त मस्तिष्क बाधा14,15से अधिक गुजर रहा है । उनके उच्च बहुतायत कम प्रचुर मात्रा में, मस्तिष्क व्युत्पंन नमूना घटकों का पता लगाने में बाधा । अंतर्जात पेप्टाइड्स आसानी से उच्च प्रचुर मात्रा में प्रोटीन से अलग किया जा सकता है, जिससे सीएसएफ पेप्टाइड निकालने का एक काफी बड़ा खंड की अनुमति के लिए नियंत्रण रेखा के लिए इस्तेमाल किया जा एमएस विश्लेषण, जिससे कम प्रचुर मात्रा में पेप्टाइड्स का पता लगाने को सक्षम करने.

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में आणविक वजन कट-ऑफ (MWCO) निस्पंदन प्रोटीन अंश से सीएसएफ पेप्टाइड्स अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था; एक विधि है कि कई पिछले अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है8,9,10,11,12,16। निस्पंदन कदम एक ऑफ़लाइन आरपी HPLC पूर्व भिन्नीकरण एक उच्च पीएच मोबाइल चरण ढाल पर प्रदर्शन कदम के बाद किया गया था । मिलकर में दो आरपी HPLC कदम प्रदर्शन करके, पीएच मुख्य अंतर होने के साथ, दो कदम के बीच selectivity में अंतर मुख्य रूप से अलग पेप्टाइड प्रभारी राज्यों के एक परिणाम के रूप में बदल पेप्टाइड प्रतिधारण से परिणाम. उच्च पीएच पेप्टाइड के आवेदन पूर्व-भिन्नीकरण से पहले नियंत्रण रेखा-अम्लीय स्थितियों के तहत एमएस में पेप्टाइड पहचान बढ़ाने में कुशल साबित हुआ है17,18, और यहां तक कि जटिल जैविक में इस प्रयोजन के लिए बेहतर हो इस तरह के मजबूत बिल्ली आयन एक्सचेंज (SCX) और आरपी20के रूप में और अधिक ओर्थोगोनल जुदाई मोड19की तुलना में नमूने । विश्लेषण समय को छोटा करने के लिए, एक संयोजन योजना का इस्तेमाल किया गया था, हर 12वें अंश (उदा., 1, 13, 25, ३७, और ४९ अंश), जो आरपी HPLC की उच्च संपति शक्ति के कारण अभी भी काफी हद तक बचा-अलग से पेप्टाइड्स के सह-रेफरेंस को टाल दिया नियंत्रण रेखा में भिंन-MS चरण20,21।

पेप्टाइड पहचान

peptidomic अध्ययन में पेप्टाइड पहचान कि कोई एंजाइम दरार डेटाबेस खोज में निर्दिष्ट किया जा सकता है कि में proteomic अध्ययनों से अलग है, और एक परिणाम के रूप में, पहचान दर आमतौर पर कम कर रहे हैं11. हाल के एक अध्ययन13 से पता चला कि अंतर्जात पेप्टाइड्स Sequest और शुभंकर के साथ प्राप्त के लिए पहचान दरों में काफी सुधार हुआ जब डिफ़ॉल्ट संबंधित सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का स्कोरिंग एल्गोरिथ्म अनुकूली स्कोरिंग का उपयोग कर संशोधित किया गया था एल्गोरिथ्म अंतर्जात पेप्टाइड्स के लिए इष्टतम स्कोरिंग एल्गोरिथ्म जो इंगित करता है, जो tryptic पेप्टाइड्स के13से अलग है । उस अध्ययन में, पहचान स्वचालित पेप्टाइड de नोवो अनुक्रमण के आधार पर सॉफ्टवेयर चोटियों (बीएसआई) का उपयोग करने के लिए दो टुकड़ा आयन फिंगरप्रिंटिंग आधारित खोज इंजन, की पहचान की एक काफी बड़ा सेट में जिसके परिणामस्वरूप के पूरक होना पाया गया पेप्टाइड्स.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नीचे वर्णित प्रोटोकॉल एक परिष्कृत संस्करण एक पिछले अध्ययन में प्रयोग किया जाता है, जहां अंतर्जात पेप्टाइड्स की एक बड़ी राशि मानव सीएसएफ15में पहचान की गई थी । मूल प्रोटोकॉल के अद्यतन रासायनिक पूर्व के लिए मामूली परिवर्तन शामिल सीएसएफ के उपचार के रूप में अच्छी तरह से ऑफ़लाइन उच्च पीएच आरपी HPLC पूर्व भिंन के लिए इस्तेमाल ढाल के अनुकूलन के रूप में ।

नैतिक विचार

स्वीडिश रोगी और नियंत्रण सामग्री के सभी अध्ययनों को नैतिक समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया है: सेंट Göran (ref. 2005-554-31/3) । एंस्टर्डम मनोभ्रंश पलटन और तंत्रिका विज्ञान और न्यूरोसर्जरी के लिए राष्ट्रीय अस्पताल में एकत्र नमूनों से सीएसएफ के नमूने, लंदन सभी भाग लेने वाले रोगियों और क्षेत्रीय नैतिकता समितियों से अनुमोदन से लिखित सहमति के साथ अनुसंधान के लिए इस्तेमाल किया गया । यहां सामग्री का उपयोग मुख्य रूप से छोड़ दिया निदान के प्रयोजन के लिए उठाए गए नमूनों से अधिक सीएसएफ के शामिल है और यह हमारी पढ़ाई में शामिल किया जा रहा से पहले de-पहचाना गया था । वहां वापस किसी भी व्यक्ति दाता या दाताओं के समूह को नमूने अनुरेखण की कोई संभावना नहीं है ।

1. मानव मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) का निष्कर्षण:

  1. काठ का पंचर के माध्यम से सीएसएफ निकालें (एक प्रशिक्षित चिकित्सक द्वारा किया जाना चाहिए) एक मानकीकृत प्रोटोकॉल का उपयोग22.
  2. सेल मलबे और अंय गैर घुलनशील सामग्री २,५०० x g पर 20 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा निकालें ।
  3. नेत्रहीन पंचर रक्तस्राव से उत्पन्न रक्त दूषण का संकेत हो सकता है कि disease के लिए सीएसएफ के नमूनों का निरीक्षण. रक्त में काफी अधिक प्रोटीन एकाग्रता और टीज़ की उपस्थिति बहुत विश्लेषणात्मक परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं ।

2. सीएसएफ का पूर्व उपचार (१.५ मिलीलीटर नमूना मात्रा, कोई ठहराव):

  1. गल १.५ एमएल के कमरे के तापमान पर सीएसएफ aliquots (RT), सामग्री स्थानांतरण करने के लिए 10 मिलीलीटर के ट्यूबों और जोड़ें ८० µ एल के 1 एम Triethylammonium बिकारबोनिट (TEAB) एक बफ़रिंग एजेंट के रूप में ।
  2. जोड़ें ०.६५ एमएल 8 एम guanidinium हाइडरोक्लॉराइड (GdnHCl) (सक्रिय एकाग्रता GdnHCl: २.४ मीटर) और भंवर धीरे आरटी पर 10 मिनट के लिए ।
    नोट: chaotropic एजेंट, GdnHCl, दोनों विलायक चिपचिपापन को प्रभावित करता है और पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला है, जो प्रोटीन का खुलासा ऊर्जावान अनुकूल23जा रहा है में परिणाम के साथ सूचना का आदान प्रदान । इस प्रकार, GdnHCl प्रोटीन समुच्चय भंग और बाद छानने का समय के दौरान अंतर्जात पेप्टाइड्स की वसूली बढ़ जाती है ।
  3. ६० µ एल के २०० मिमी के जलीय tris (2-carboxyethyl) phosphine हाइडरोक्लॉराइड (TCEP) (सक्रिय एकाग्रता TCEP: 6 मिमी) और cysteine disulphides को कम करने के लिए 1 ज के लिए ५५ ° c पर मशीन जोड़ें ।
  4. जोड़ें ३५ µ एल के ४०० mm iodoacetamide (आईएए) (सक्रिय एकाग्रता आईएए: 4 मिमी) और alkylate cysteines के लिए 30 मिनट के लिए आर टी पर गर्मी । एक alkyl समूह के अलावा सुनिश्चित करता है कि cysteine अवशेषों अनायास बाद नमूना तैयारी के दौरान किसी भी बिंदु पर नए disulphide पुलों फार्म नहीं कर सकते ।
  5. MWCO निस्पंदन करने से पहले नमूना पतला करने के लिए संक्षेप में डी-जल और भंवर के ३.२५ मिलीलीटर जोड़ें, ५.५ मिलीलीटर की कुल नमूना मात्रा में जिसके परिणामस्वरूप । यह कदम एक उच्च एकाग्रता के रूप में 1 मीटर से नीचे करने के लिए GdnHCl पतला करने के लिए कई बार फिल्टर उपकरणों से पॉलिमर पदार्थों की नमकीन पानी के कारण मनाया गया है करने के लिए कार्य करता है ।

3. सीएसएफ का पूर्व उपचार (10 x १५० µ l sample Volume, Isobaric ्र-ठहराव):

  1. गल १५० RT पर 10 व्यक्तियों से सीएसएफ aliquots के µ एल और बाद में व्यक्तिगत १.५ मिलीलीटर कम-बाध्यकारी सूक्ष्म केंद्रापसारक ट्यूबों के लिए सामग्री हस्तांतरण और एक बफर एजेंट के रूप में 1 एम TEAB के 8 µ एल जोड़ें ।
  2. जोड़ें ६५ µ 8 एम GdnHCl के एल (सक्रिय एकाग्रता GdnHCl: २.४ मीटर) और भंवर धीरे आरटी पर 10 मिनट के लिए ।
  3. cysteine disulphides को कम करने के लिए 1 ज के लिए ५५ डिग्री सेल्सियस पर जलीय TCEP (सक्रिय एकाग्रता TCEP: 6 मिमी) और गर्मी की २०० मिमी के 6 µ एल जोड़ें ।
  4. जोड़ें ३.५ µ एल ४०० मिमी जलीय आईएए (सक्रिय एकाग्रता आईएए: 6 मिमी) और आरटी और अंधेरे में alkylate cysteines के लिए 30 मिनट के लिए मशीन ।
  5. isobaric ्र किट (उदा., मिलकर मास टैग 10plex isobaric ्र रिएजेंट) तैयार करें । isobaric लेबलिंग की अनुमति दें-रिएजेंट शीशियों को आरटी तक पहुंचने से पहले उंहें खोलने के लिए अनावश्यक एजेंट जलयोजन से बचने के लिए, जोड़ें ४१ µ एल के HPLC ग्रेड acetonitrile (AcN) और 5 मिनट के लिए कोमल आंदोलन से भंग ।
  6. स्थानांतरण 30 µ एल के isobaric लेबलिंग-रिएजेंट समाधान के लिए इसी नमूने और मशीन के लिए 1 एच आरटी में कोमल आंदोलन के तहत । isobaric लेबलिंग एजेंट एक एन एच एस-एस्टर समूह है जो प्राथमिक पेप्टाइड एन पर वर्तमान अमीन के साथ प्रतिक्रिया टर्मिनी के रूप में अच्छी तरह के रूप में Lysine अवशेषों के साथ भी शामिल है ।
  7. 5% hydroxylamine के 8 µ एल जोड़ें (सक्रिय एकाग्रता hydroxylamine: ०.१६%) और 20 मिनट के लिए आरटी पर धीरे से हिला लेबलिंग प्रतिक्रिया बुझाने के लिए । चूंकि पृथक से लेबल किए गए नमूनों को संयोजित किया जाना है, इसलिए सुनिश्चित करें कि लेबलिंग की प्रतिक्रिया बुझती है । hydroxylamine के रूप में अमीन समूहों की एक बहुतायत के अलावा, शेष isobaric लेबलिंग एजेंट प्रतिक्रिया करने की अनुमति दी है और इस प्रकार निष्क्रिय प्रदान की है ।
  8. 10 में से प्रत्येक की सामग्री का मिश्रण व्यक्तिगत रूप से लेबल एक एकल 15 मिलीलीटर के नमूने ट्यूब ।
  9. 3% से AcN एकाग्रता को कम करने के लिए और एक उच्च एकाग्रता के रूप में 1 मीटर से नीचे करने के लिए GdnHCl एकाग्रता GdnHCl करने के लिए संयुक्त नमूना और भंवर संक्षेप करने के लिए de--के पानी के ६.४ मिलीलीटर जोड़ें फ़िल्टर डिवाइस से ।

4. आणविक वजन कट-बंद छानने का रास्ता

  1. आदेश में संभावित संदूषणों को दूर करने के लिए, २,५०० x जी और आरटी में 15 मिनट के लिए जलीय 1 मीटर GdnHCl, 25 मिमी TEAB और केंद्रापसारक के 10 मिलीलीटर लदान द्वारा MWCO फिल्टर हालत, प्रवाह के माध्यम से (फुट) त्यागें ।
  2. फ़िल्टर पर पूरे नमूना मात्रा लोड (5 मिलीलीटर गैर-लेबल्ड सीएसएफ (चरण २.५) या 10 मिलीलीटर isobarically-लेबल्ड सीएसएफ (चरण ३.९)) और 30 मिनट के लिए केंद्रापसारक पर २,५०० x g और RT, संग्रह कंटेनर में प्रवाह के माध्यम से (FT) छोड़ दें । निस्पंदन के परिणाम यह है कि पेप्टाइड्स और छोटे प्रोटीन बड़ा प्रोटीन और अवशिष्ट कोशिका मलबे से अलग कर रहे हैं । इस चरण में proteomic प्रयोगों में पेप्टाइड्स उत्पन्न करने के लिए प्रोटीन के proteolytic पाचन के उपयोग के समकक्ष peptidomic के रूप में देखा जा सकता है.
  3. फिल्टर पर 25 मिमी TEAB (जलीय) के 5 मिलीलीटर लोड और २,५०० एक्स जी और आरटी में 15 मिनट के लिए केंद्रापसारक, क्रम में पेप्टाइड्स की वसूली बढ़ाने के लिए ।
  4. भंवर दो पिछले कदम से संयुक्त FTs (एक कुल 10 मिलीलीटर गैर लेबल या 15 मिलीलीटर isobarically-लेबल नमूना), और नमूना अंलीकरण के लिए आगे बढ़ना ।

5. De-नमकीन और ठोस चरण निष्कर्षण द्वारा साफ नमूना

  1. ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) से पहले ४.४ से फ़िल्टर किए गए नमूने Acidify । अंलीकरण एसपीई-कारतूस के स्थिर चरण के साथ घुला हुआ (पेप्टाइड) बातचीत में सुधार करने के क्रम में किया जाता है ।
  2. गैर-लेबल वाले नमूने के लिए (वॉल्यूम 10 mL): जोड़ें ५५० µ l के 1% Trifluoroacetic अम्ल (TFA)-नमूना की कुल मात्रा: ०.०५% TFA के साथ १०.५५ मिलीलीटर.
  3. isobaric-लेबल वाले नमूने के लिए (वॉल्यूम 15 ml): जोड़ें 20 ml ०.१% TFA करने के लिए acidify और कम AcN एकाग्रता से 3% करने के लिए 1%-नमूना की कुल मात्रा: ०.०६६% TFA के साथ 30 मिलीलीटर.
    नोट: TFA भी अपने कार्य के लिए एक आयन बाँधना एजेंट, जो एसपीई कारतूस की पैकिंग सामग्री के साथ पर्याप्त रूप से मजबूत hydrophobic बातचीत करने के लिए सक्षम नहीं पेप्टाइड्स के प्रतिधारण को बनाए रखने में सुधार के रूप में जोड़ा जाता है ।
  4. यदि पीएच > 3, नमूना पीएच < 3 है जब तक 20% फास्फोरस एसिड के साथ नमूना अनुमापन ।
  5. हालत ८४% AcN, ०.१% फार्मिक एसिड (एफए) के 1 मिलीलीटर के अलावा द्वारा एसपीई कारतूस, और फुट दोहराने एक बार त्यागें । कारतूस फिल्टर के कंडीशनिंग अन्यथा बाद में चरणों में पेप्टाइड्स के साथ साथ elute होगा जो अवांछित पदार्थों को दूर करने के लिए आवश्यक है; इसके अलावा, कंडीशनिंग फिल्टर की पारगम्यता बढ़ जाती है.
  6. Equilibrate ०.१% TFA के 1 मिलीलीटर के अलावा एसपीई कारतूस, एक बार पैर दोहराने को छोड़ दें । सुनिश्चित करें कि फ़िल्टर शुष्क पिछले equilibration चरण के बाद नहीं चला-फ़िल्टर के शीर्ष पर एक छोटी मात्रा रखें । कारतूस फिल्टर के Equilibration hydrophobic पदार्थ (acetonitrile) कंडीशनिंग कदम से छोड़ दिया द्वारा पेप्टाइड्स बनाए रखने के लिए फिल्टर तैयार करने के लिए किया जाता है ।
  7. पूरे नमूना मात्रा (isobarically-लेबल वाले नमूनों के लिए १०.५५ मिलीलीटर या 30 मिलीलीटर), यदि आवश्यक हो तो कई भागों में लोड, और फुट कचरे में चलाने दो । यह सुनिश्चित करें कि कारतूस का नमूना लोड हो रहा है दौर के बीच या अंतिम नमूना मात्रा लोड किया गया है के बाद सूखी नहीं चला है-फिल्टर के शीर्ष पर एक छोटी सी मात्रा रखो ।
  8. फिल्टर पर ०.१% TFA की 1 मिलीलीटर दर्रा साल्ट और रिएजेंट को दूर करने के लिए और एक बार फुट दोहराने को त्यागें । कारतूस के शीर्ष पर तरल की एक छोटी सी मात्रा रखने-प्रत्येक धुलाई चरण के बाद यह एक सूखी भाग नहीं है कि सुनिश्चित करें ।
  9. जगह १.५ मिलीलीटर कम बाध्यकारी माइक्रो केंद्रापसारक ट्यूबों कारतूस के तहत और elute ८४% AcN, कारतूस पर ०.१% एफए की 1 मिलीलीटर गुजर द्वारा नमूना है ।
  10. एक निर्वात में वाष्पीकरण द्वारा de-नमकीन नमूना से सॉल्वैंट्स निकालें सूखी जब तक सक्रिय हीटिंग के बिना चलाने के लिए, पर-८० ° c स्टोर या उच्च पीएच अंश के लिए तुरंत आगे बढ़ना ।

6. ऑफलाइन उच्च पीएच रिवर्स चरण HPLC नमूना भिन्नीकरण

  1. जलीय उच्च पीएच (HpH) मोबाइल चरणों को तैयार करें:
    HpH बफर A: शुद्ध जल
    HpH बफ़र B: ८४% AcN
    HpH बफर सी: 25 मिमी एनएच4ओह
    HpH लोड हो रहा है बफर: २.५ मिमी एनएच4ओह, 2% AcN
    नोट: HpH लोड बफ़र ट्रांसपोर्ट समाधान और नमूना बफ़र के रूप में उपयोग किया जाता है
  2. पुन: भंग 20 मिनट के लिए कोमल आंदोलन द्वारा 16 µ एल HpH लोडिंग बफर में नमूना
  3. ९६ के लिए एक आंतरिक अंश कलेक्टर के साथ एक HPLC प्रणाली पर नमूना 15 µ l लोड-दीप अच्छी तरह से Batth एट अल के अनुसार विन्यस्त प्लेटों. 20 मामूली परिवर्तन के साथ । एक pH-स्थिर पृथक्करण स्तंभ (C18 ३.५ µm, २.१ mm x २५० mm) पर १०० µ l/min के प्रवाह पर Fractionate और एक रेखीय ६० मिनट ग्रैडिएंट पर प्रति मिनट एक अंश एकत्र करें ।
  4. निंन ग्रेडिएंट समय-बिंदुओं का उपयोग करें: t = 0 min, B = 1%, C = 10%; t = 4 min, B = 1%, C = 10%, भिन्न संग्रह प्रारंभ करें; t = ७६ min, B = ७०%, C = 10%; अंत अंश संग्रह; t = ७६.५ min, B = ८५%, C = 10%; t = ८० min, B = ८५%, C = 10%; t = ८०.५ min, b = 1%, c = 10% और t = ९० min, b = 1%, c = 10%.
  5. 12 कुओं में दोहराए जाने वाले अंशों को एक गोलाकार प्रतिमान में एकत्र करें, इस प्रकार 12 मिनट द्वारा स्थानित अंशों को जोड़ना, 12 अंशों में जिसके परिणामस्वरूप, प्रत्येक में 6 श्रेणीबद्ध उप-भिन्न शामिल हैं ।
  6. आरटी और ३००० rpm पर वैक्यूम केंद्रापसारक द्वारा नमूनों से विलायक निकालें सूखी जब तक, और स्टोर-८० डिग्री सेल्सियस से पहले नियंत्रण रेखा-एमएस विश्लेषण पर नमूने ।

7. LC-MS

  1. जलीय मोबाइल चरणों को तैयार करें:
    एक बफर: ०.१% एफए
    बफर बी: ०.१% एफए, ८४% AcN
    बफ़र लोड कर रहा है: ०.०५% TFA, 2% AcN
    नोट: लोड बफ़र परिवहन समाधान, नमूना बफ़र और लोडिंग पंप के लिए मोबाइल चरण के रूप में उपयोग किया जाता है ।
  2. पुनः 6 µ एल लोड हो रहा है और 20 मिनट के लिए आर टी पर मिलाते बफर के अलावा 12 भागों में से प्रत्येक को भंग
  3. एक नैनो-फ्लो HPLC पर 5 µ l का नमूना लोड करें, जाल कॉलम विंयास में आपरेटिंग (ट्रैप कॉलम: ७५ µm x 2 सेमी, सी18, १०० å ताकना आकार, 3 µm कण आकार; पृथक्करण कॉलम: C18, ७५ µm x ५०० mm, १०० å ताकना आकार, 2 µm कण आकार , और निंन ग्रेडिएंट का उपयोग करके १५० nL/min की प्रवाह दर पर पेप्टाइड पृथक्करण करते हैं: t = 0 min, B = 2%; टी = 10 मिनट, बी = 2%; टी = 11 मिनट, बी = 7%; t = १०० min, B = 26%; t = १७० min, B = ४५%; t = १७५ min, B = ८०%; t = १८१ min, b = 2%, और t = २१० min, b = 2%.
  4. एक नैनो-ईएसआई अंतरफलक के माध्यम से HPLC से जुड़े उच्च संकल्प संकर जन स्पेक्ट्रोमीटर पर एमएस प्रदर्शन करते हैं । m/z श्रेणी ३५०-१,४०० पर १२०,००० (2.0 e5 AGC लक्ष्य) का रिज़ॉल्यूशन सेटिंग में MS मोड में पूर्ण स्कैन स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड करें ।
    1. डेटा पर निर्भर अधिग्रहण मोड में जन स्पेक्ट्रोमीटर, का चयन करें ms/एमएस स्पेक्ट्रा शीर्ष दस सबसे तीव्र चोटियों से m/z > १५० और के भीतर तीव्रता सीमा 1.0 e4-1.0 e5 टुकड़ा आयन विश्लेषण के लिए । 1 m/z, १०० ms के अधिकतम इंजेक्शन समय और ६०% पर आरएफ लेंस की एक quadrupole आइसोलेशन विंडो का उपयोग करते हुए अग्रदूत आयनों को अलग करें ।
    2. 15 एस की एक अपवर्जन समय और ± 10 पीपीएम की एक एम/z सहिष्णुता के साथ गतिशील अपवर्जन लागू करें । उच्च-टक्कर ऊर्जा पृथक्करण (HCD) कक्ष में फ़्रेग्मेंटेशन निष्पादित करें और ५०,००० (5.0 e4 AGC लक्ष्य मान) का एक समाधान सेटिंग पर orbitrap में ms/ms प्राप्तिएं रिकॉर्ड है ।

8. पेप्टाइड पहचान

  1. के लिए पेप्टाइड पहचान सबमिट परिणामी. raw-जन spectrometric विश्लेषण से फ़ाइलें एक प्रोटियोमिक् खोज इंजन के लिए निंनलिखित सेटिंग्स लागू:
    नोट: हमारे पिछले अध्ययन में15, तीन खोज इंजन; शुभंकर v 2.4, Sequest एचटी, और चोटियों v 7.5 समानांतर में इस्तेमाल किया गया और यहां सेटिंग्स निर्दिष्ट सभी तीन खोज इंजन के लिए कार्यरत थे, जब तक अंयथा निर्दिष्ट । समायोज्य सेटिंग्स के बहुमत पेप्टाइड/प्रोटीन की पहचान के लिए सार्वभौमिक है और किसी भी खोज इंजन में इसी सेटिंग्स होना चाहिए ।
    स्पेक्ट्रम चयनकर्ता:
    मिन. प्रणेता जन: ३५० डा.
    अधिकतम. प्रणेता जन: ५,००० डा.
    स्कैन प्रकार: पूर्ण
    सिग्नल/शोर थ्रेशोल्ड: १.५
    अनुक्रम डेटाबेस खोज
    डाटाबेस: UniProt_SwissProt [version2015_11]
    वर्गीकरण: होमो sapiens
    एंजाइम: कोई नहीं
    अधिकतम. याद किया दरारें: 0
    इंस्ट्रूमेंट (शुभंकर केवल): ईएसआई-ट्रैप
    Min. पेप्टाइड लंबाई (केवल SequestHT): 6
    अधिकतम. पेप्टाइड लंबाई (केवल SequestHT): १४४
    प्रणेता जन सहिष्णुता: 15 पीपीएम
    टुकड़ा जन सहिष्णुता: ०.०५ डा
    स्थैतिक संशोधन: Carbamidomethyl (C); [यदि बला हो] TMT10plex (N-टर्म)
    गतिशील संशोधन: ऑक्सीकरण (M); [यदि बला हो] TMT10plex (कश्मीर)
    पेप्टाइड स्पेक्ट्रम मिलान (PSM) मांय
    पाझर (शुभंकर और Sequest एचटी केवल) या डेको संलयन (चोटियों केवल)
    लक्ष्य एफडीआर: ०.०१
    मान्यता के आधार पर: q-मान

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

विधि यहां वर्णित लागू किया गया है और तीन अध्ययनों में मूल्यांकन से पहले नमूना पूर्व अंश (तालिका 1) की शुरूआत करने के लिए । पहले अध्ययन एक मालदी लक्ष्य प्लेट पर सीएसएफ भागों खोलना और ७३० की पहचान अंतर्जात पेप्टाइड्स11के परिणामस्वरूप के लिए ऑफलाइन नियंत्रण रेखा का इस्तेमाल किया । दो नम्न अध्ययनों में isobaric ्र कार्यरत था । मुख्य रूप से एक मामले में/सीएसएफ endopeptidome और proteome एक साथ में संभावित उपमार्कों की पहचान और विशिष्ट वर्णन के लिए अध्ययन एक साथ24, और दूसरे अध्ययन में isobaric ्र vivo में उपचार प्रभाव की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया था एक γ के ३६ ज16से अधिक सीएसएफ में पेप्टाइड अभिव्यक्ति पर secretase अवरोधक । मामले में/नियंत्रण अध्ययन ४३७ अंतर्जात पेप्टाइड्स की पहचान की गई, जिनमें से ६४ काफी विज्ञापन और स्वस्थ नियंत्रण के साथ व्यक्तियों के बीच एकाग्रता में बदल दिया. तीसरे, उपचार अध्ययन, पहचान १७९८ अंतर्जात पेप्टाइड्स, मॉनिटर पेप्टाइड्स के 11 के इलाज के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए दिखाया जा सकता है.

चौथे अध्ययन में, उद्देश्य पहचान सीएसएफ पेप्टाइड्स की संख्या में वृद्धि करने के लिए, विशेष रूप से कम प्रचुर पेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए किया गया था । इसलिए, पेप्टाइड पूर्व-भिन्नीकरण द्वारा HpH-RP क्रोमैटोग्राफी शामिल किया गया था और एक 10 गुना बड़ा सीएसएफ नमूना मात्रा, १६,३९५ पेप्टाइड्स की पहचान में जिसके परिणामस्वरूप उपयोग किया गया था । इस अध् ययन में सं isobaric ्र का प्रदर्शन किया गया । नमूना अंश के अलावा, सबसे हाल ही में अध्ययन एक संयुक्त पेप्टाइड पहचान दृष्टिकोण कार्यरत है, जबकि पहले तीन अध्ययनों में केवल एक ही डेटाबेस खोज किया गया था, जो पेप्टाइड्स की बड़ी संख्या के लिए कुछ हद तक खातों के लिए पहचान. व्यक्तिगत खोज इंजन द्वारा प्राप्त परिणामों की तुलना (शुभंकर, Sequest एचटी या चोटियों) सबसे हाल के अध्ययन से संकेत मिलता है कि इस्तेमाल एल्गोरिदम कुछ हद तक एक अपेक्षाकृत छोटी राशि के बाद से पूरक हैं, से कम 15% (२४४०), पेप्टाइड्स की हैं सभी तीन खोज इंजन (चित्रा 2) द्वारा की पहचान की । इसके अलावा, de नोवोअनुक्रमण खोज इंजन चोटियों अंतर्जात पेप्टाइड्स की पहचान करने में सबसे कुशल था, लेकिन अधिक से अधिक ५,४०० पेप्टाइड्स की पहचान नहीं किया गया है, तो केवल चोटियों इस्तेमाल किया गया था (चित्रा 2). एक ही सामग्री पर कई खोज इंजन के आवेदन संभावित कई परीक्षण के मुद्दों है और यह पहचान शुद्धता का परीक्षण13के साथ संबोधित किया गया था । अधिग्रहीत रॉ एमएस/एमएस डेटा, साथ ही सभी परिणाम सबसे हाल ही में परीक्षण से proteomic खोजों में प्राप्त किया गया है के साथ ProteomeXchange के माध्यम से गौरव डेटा भंडार में पहचानकर्ता PXD004863 उपलब्ध कराया गया है ।

Figure 1
चित्र 1: एक प्रोटोकॉल योजना विधि के प्रमुख चरणों visualizing. मस्तिष्कमेरु द्रव का निष्कर्षण काठ का पंचर द्वारा के बाद गैर घुलनशील सामग्री को दूर करने के लिए, 2) अलग पेप्टाइड प्रोटीन समुच्चय करने के लिए नमूने के लिए GdnHCl के अलावा, अंतर्जात पेप्टाइड्स की वसूली में वृद्धि; कमी आणि alkylation cysteine disulphides; isobaric ्र के लिए पेप्टाइड ठहराव (ऐच्छिक) 3) आणविक वजन निस्पंदन प्रोटीन से अंतर्जात पेप्टाइड्स अलग करने के लिए, 4) ठोस चरण निष्कर्षण लवण और अन्य ध्रुवीय दूषित पदार्थों को दूर करने के लिए, 5) आरपी HPLC पूर्व अंश, क्षारीय मोबाइल चरण ढाल और हर 12वें अंश, 6) आरपी HPLC-एमएस/ms, अंलीय मोबाइल चरण ढाल, प्रत्येक श्रेणीबद्ध अंश लगातार चलाने के संयोजन, 7) पेप्टाइड पहचान सभी 12 विश्लेषण से एमएस/ms डेटा प्रस्तुत करके प्रदर्शन के रूप में चलाता है एक खोज इंजन के लिए एकल नमूना, बाद में पेप्टाइड आईडी की तुलना और सभी अद्वितीय पेप्टाइड आईडी का एक योग किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अध्ययन सारांश टीएमटी लेबलिंग (y/ HpH-आरपी भिन्नीकरण (y/ एमएस प्रति सीएसएफ की इसी मात्रा-विश्लेषण (µ एल) पहचाने गए पेप्टाइड्स की संख्या टिप्पणी संदर्भ
Explorative सीएसएफ peptidome विश्लेषण एन एन ५०० ७३० ऑफलाइन एलसी मालदी लक्ष्य तैयारी, मालदी-MS; MWCO फिल्टर का मूल्यांकन 4
सीएसएफ पेप्टाइड्स की मात्रात्मक तुलना; 8 विज्ञापन + 8 Ctrl से नमूने y एन २०० ४३७ HPLC-ईएसआई एमएस; संयुक्त peptidomic और proteomic प्रोटोकॉल 25
AD गामा secretase अवरोधक उपचार अध्ययन y एन ३०० १७९८ HPLC-ईएसआई एमएस; सीएसएफ उपचार के बाद छह समय बिंदुओं पर निकाली गई 17
सीएसएफ peptidome का विस्तार एन y 750-1000 १८.०३१ HPLC-ईएसआई एमएस; पेप्टाइड पहचान सॉफ्टवेयर का संयोजन 15

तालिका 1: हाल ही में इस समूह जो मानव सीएसएफ में अंतर्जात पेप्टाइड्स की पहचान के लिए आणविक वजन निस्पंदन और जन spectrometric विश्लेषण लागू होता है द्वारा किए गए अध्ययनों का एक संकलन ।

Figure 2
चित्रा 2: एक वेन एक तीन खोज इंजन के शुभंकर, Sequest एचटी और चोटियों से प्राप्त की पहचान परिणामों की तुलना आरेख । कुल १६,३९५ अंतर्जात पेप्टाइड्स की पहचान की गई । de नोवो-अनुक्रमण खोज इंजन चोटियों की पहचान १०,९६७ अंतर्जात पेप्टाइड्स; टुकड़ा आयन फिंगरप्रिंटिंग आधारित खोज इंजन शुभंकर और Sequest एचटी की पहचान ८११८ और ७३०४ अंतर्जात पेप्टाइड्स क्रमशः । सभी तीन खोज इंजन के बीच पहचान आम सहमति २४४० अंतर्जात पेप्टाइड्स, या १४.८% की राशि । वहां एक अपेक्षाकृत बड़ी पहचान शुभंकर और Sequest एचटी, उनके संयुक्त पेप्टाइड पहचान के ७०% करने के लिए इसी के बीच ओवरलैप था । चोटियों एक अपेक्षाकृत छोटे पहचान दोनों शुभंकर और Sequest एचटी के साथ ओवरलैप किया था; क्रमशः २०.५% और १८.९% । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

एक उच्च पीएच की शुरूआत आरपी HPLC पूर्व-भिंन आणविक वजन ultrafiltration द्वारा अंतर्जात पेप्टाइड्स की वसूली के लिए एक पहले से विकसित प्रोटोकॉल के लिए कदम के सापेक्ष नमूना जटिलता कम है और इस तरह एक 5 गुना बड़ा के लिए अनुमति दी नमूना मात्रा का अध्ययन किया जाना है । यह, बारी में, प्रत्येक अंश में मौजूद पेप्टाइड्स के सबसेट की एकाग्रता में वृद्धि हुई है और इस तरह कम प्रचुर मात्रा में पेप्टाइड्स का पता लगाने की संभावना में सुधार.

अंतर्जात पेप्टाइड्स जो समानांतर में तीन proteomic सॉफ्टवेअर कार्यरत के लिए एक पहचान रणनीति प्रदर्शन करके, यह ज्ञात सीएसएफ endopeptidome 10 से अधिक गुना विस्तार संभव था । १६,३९५ अंतर्जात पेप्टाइड्स की कुल एक प्रारंभिक परीक्षण में एक परित सीएसएफ नमूना सामग्री पर पहचाने गए । पहचान के अलावा पहले neurodegenerative विकारों के संदर्भ में उल्लेख प्रोटीन से व्युत्पंन अंतर्जात पेप्टाइड्स की एक बड़ी संख्या में थे । उपरोक्त अध्ययनों में पहचाने गए कई पेप्टाइड्स वर्तमान में हमारी प्रयोगशाला में के रूप में किया जा रहा है मूल्यांकन । इस प्रक्रिया में भारी आइसोटोप, लक्षित जन spectrometric परख की स्थापना के साथ लेबल सिंथेटिक एनालॉग के साथ spiking सीएसएफ द्वारा पेप्टाइड्स की पहचान के सत्यापन सहित कई कदम शामिल हैं, भंडारण के दौरान पेप्टाइड स्थिरता का आकलन और फ्रीज-गल चक्र, और विभिंन नैदानिक साथियों का विश्लेषण ।

संशोधन मूल प्रोटोकॉल में किए गए थे ताकि संदूषणों की शुरूआत से बचने के लिए (चरण २.५ और ३.५) MWCO-निस्पंदन के दौरान नमूने में GdnHCl की एक उच्च एकाग्रता का एक परिणाम के रूप में । पूर्व-भिन्नीकरण ग्रैडिएंट (step 6.3.1) के लिए अद्यतन किया गया था, क्षमता लंबे समय तक, रेखीय ग्रेडिएंट का उपयोग किया जाता है ।

यहां प्रोटोकॉल में analyte घाटे के प्राथमिक कारणों को दो आरपी क्रोमेटोग्राफिक कदम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से MWCO निस्पंदन और एसपीई नमूना कदम को साफ करने के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है वर्णित है ।

पेप्टाइड MWCO के साथ बातचीत के कारण नुकसान-फिल्टर, या प्रोटीन उस पर बनाए रखा, निस्पंदन के दौरान से बचने के लिए मुश्किल है और अंतर नमूना भिन्नता का एक स्रोत हो सकता है.

इसके अलावा चुनिंदा नुकसान की संभावना आरपी-क्रोमेटोग्राफिक कदम में उठता है । के बाद से पेप्टाइड hydrophobicity पीएच-निर्भर है, उच्च और कम पीएच पर लगातार दो आरपी क्रोमेटोग्राफिक कदम प्रदर्शन, क्रमशः, के सबसेट के नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते है पेप्टाइड्स कि बहुत हाइड्रोफिलिक पर पीएच ≥ 9 स्तंभ पर रखा जा करने के लिए और इसी तरह एक दूसरे सबसेट भी पीएच ≤ 3 पर हाइड्रोफिलिक को बनाए रखा जाएगा ।

पूर्व-भिन्नता के रोजगार के पहले इस्तेमाल किया तरीकों की तुलना में अंतर्जात पेप्टाइड्स की पहचान में 10 गुना वृद्धि हुई है । यह पहले अज्ञात पेप्टाइड्स की एक बड़ी संख्या का सफल पता लगाने के लिए अनुमति दी है और इसलिए अध्ययन और सीएसएफ peptidome की खोज में एक महत्वपूर्ण उपकरण है, और संभवतः अन्य जटिल जैविक नमूनों के रूप में अच्छी तरह से.

division isobaric ्र के साथ संयोजित प्रोटोकॉल का उद्देश्य सीएसएफ, रक्त और मस्तिष्क ऊतक में विभिन्न neurodegenerative विकारों के लिए उपमार्की उम्मीदवारों की पहचान करने के लिए आगे लागू किया जाना है ।

नमूना तैयारी के चरणों में भिन्न पुनर्प्राप्ति नियंत्रण रेखा द्वारा सीएसएफ और पेप्टाइड्स के विश्लेषण के लिए विश्लेषणात्मक भिन्नता के लिए योगदान देता है-MS. नमूना तैयारी में एक प्रारंभिक चरण में पेप्टाइड्स के प्रदर्शन isobaric लेबलिंग ऐसे का प्रभाव कम हो जाती है भिंनता बहुत है । पहले रिपोर्ट किए गए नमूना तैयारी प्रोटोकॉल की तुलना में, उच्च-पीएच रिवर्स चरण पेप्टाइड पूर्व-भिन्नीकरण के कार्यान्वयन एक कारक 5 द्वारा पहचाने गए पेप्टाइड्स की संख्या में वृद्धि हुई. एमएस/ms-डेटा से अंतर्जात पेप्टाइड्स की पहचान में काफी सुधार किया गया था जब विभिन्न पेप्टाइड पहचान सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के संयोजन, विभिन्न खोज एल्गोरिदम को रोजगार.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

कोई प्रतिस्पर्धी हितों, वित्तीय या अंय लेखकों के बीच, सूचित किया गया है ।

Acknowledgments

नक्वी Batth और सहकर्मियों को पूर्व-भिन्नता विधि स्थापित करने में सलाह के लिए बहुत धन्यवाद.

इस काम को स्वीडिश रिसर्च काउंसिल, द Wallström ऐंड Sjöblom फाउंडेशन, द गन एंड Bertil Stohne फाउंडेशन Stiftelse, द मैगनस Bergwall फाउंडेशन, द Åhlén फाउंडेशन, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för से फंडिंग द्वारा सपोर्ट किया गया । Gamla Tjänarinnor, द Knut और ऐलिस Wallenberg फाउंडेशन, Frimurarestiftelsen, और FoU-Västra Götalandsregionen ।

इस परियोजना के लिए धन के मुख्य प्राप्तकर्ताओं क२ज Blennow, Henrik Zetterberg और जोहान Gobom थे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 1 M Triethylammonium bicarbonate Fluka, Sigma-Aldrich 17902-100ML TEAB
 8 M Guanidinium hydrochloride Sigma-Aldrich G7294-100ML GdnHCl
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Pierce 20490 TCEP
Iodoacetamide SIGMA I1149-5G IAA
Hydroxylamine 50% (w/w) Sigma-Aldrich 457804-50ML
Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade Sigma-Aldrich 271004-2L AcN
Formic acid Fluka, Sigma-Aldrich  56302-1mL-F FA
Triflouroacetic acid Sigma-Aldrich T6508-10AMP TFA
Ammonium hydroxide solution Sigma-Aldrich  30501-1L-1M NH4OH
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane Merck Millipore UFC903024 MWCO-filter
Sep-Pak C18, 100 mg Waters WAT023590 SPE-column
Resprep 12-port SPE Manifold  Restek 26077 Vacuum manifold
TMT10plex Isobaric Label Reagent Set Thermo Fisher Scientific 90110 TMT10plex
UltiMate 3000 RSLCnano LC System Dionex 5200.0356 Online sample separation
Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System Dionex IQLAAAGABHFAPBMBEZ Offline high-pH fractionation
Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMBCX Mass spectrometer for sample analysis
Proteome Discoverer 2.0  Thermo Fisher Scientific IQLAAEGABSFAKJMAUH Proteomics search platform
Mascot v2.4 Matrix Science  -  Proteomics search engine
Sequest HT Thermo  -  Proteomics search engine
PEAKS v7.5  Bioinformatic Solutions Inc.)  -  Proteomics search engine
Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size Thermo Fisher Scientific 164535 Trap column (nano HPLC)
Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size Thermo Fisher Scientific 164942 Separation Column (nano HPLC)
Savant SpeedVac High Capacity Concentrators Thermo Fisher Scientific SC210A-230 SpeedVac/Vacuum concentrator
XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm Waters 186003566 Separation Column (micro HPLC)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
  2. Scheltens, P., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
  3. Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
  4. Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).
  5. Spellman, D. S., et al. Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF. Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).
  6. Höglund, K., et al. Alzheimer's disease—Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria. Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).
  7. Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).
  8. Yuan, X., Desiderio, D. M. Human cerebrospinal fluid peptidomics. J Mass Spectrom. 40 (2), 176-181 (2005).
  9. Berven, F. S., et al. Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome. Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).
  10. Zougman, A., et al. Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).
  11. Holtta, M., et al. Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS. PLoS One. 7 (8), e42555 (2012).
  12. Holtta, M., et al. An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).
  13. Hansson, K. T., et al. Expanding the cerebrospinal fluid endopeptidome. Proteomics. 17 (5), (2017).
  14. Guldbrandsen, A., et al. In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR). Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).
  15. Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics. J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).
  16. Hölttä, M., et al. A single dose of the γ-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans. Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11 (2016).
  17. Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes. J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).
  18. Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis. J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).
  19. Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).
  20. Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
  21. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  22. Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
  23. Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains. J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).
  24. Hölttä, M., et al. An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक १३० मस्तिष्कमेरु द्रव peptidomics अंतर्जात पेप्टाइड्स मार्क्स neurodegeneration अल्जाइमर रोग नियंत्रण रेखा-ms/ms पूर्व अंश division isobaric ्र
मानव मस्तिष्कमेरु द्रव में Endopeptidomic विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hansson, K. T., Skillbäck, T.,… More

Hansson, K. T., Skillbäck, T., Pernevik, E., Holmén-Larsson, J., Brinkmalm, G., Blennow, K., Zetterberg, H., Gobom, J. Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid. J. Vis. Exp. (130), e56244, doi:10.3791/56244 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter