Vi beskriver en metod att mäta aktivering av Fc-medierad effektor funktioner av antikroppar som riktar den influensa virus hemagglutinin. Denna analys kan också anpassas för att bedöma monoklonala antikroppar eller polyklonala sera inriktning andra virala ytan glykoproteiner förmåga att inducera Fc-medierad immunitet.
Antikroppar har en avgörande roll i koppling medfödd och adaptiv immunsvaret mot virala patogener genom sin antigen bindande domäner och Fc-regioner. Här, vi beskriver hur man mäter aktiveringen av Fc effektor funktioner av monoklonala antikroppar riktade den influensa virus hemagglutinin med användning av en genetiskt modifierade Jurkat cellinje uttrycker en aktivering typ 1 Fc-FcγR. med den här metoden, den bidraget från specifika Fc-FcγR interaktioner som följer av immunglobuliner kan bestämmas med hjälp av ett in vitro- test.
Immunitet som tillhandahålls av vaccinet mot säsongsinfluensa har traditionellt bedömts av hemagglutination hämning (HI) analys1, som mäter förekomst av antikroppar som är riktade till webbplatsens receptor bindande i hemagglutinin. Dessa HI-aktiva antikroppar kan ge sterilisering immunitet, men är generellt sett smala i deras bredd i skydd, som ger immunitet mot endast en Välj några stammar av influensavirus. Isolering och karakterisering av i stort sett reaktiva monoklonala antikroppar som känner igen hemagglutinin (HA) föreslår utveckling av en universell influensavaccin är inom räckhåll2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8. en av de stora målen för en universell influensavaccin är att framkalla en stark antikroppsreaktion mot de konserverade regionerna av influensa virus9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. i huvudsak panelreaktiva antikroppar som känner igen dessa bevarade epitoper, består av både neutraliserande och icke-neutraliserande antikroppar17,18, har visat att kräva Fc-FcγR interaktioner för optimal skydd i vivo och höjdpunkten av Fc-medierad immunitet till övergripande immunsvaret mot influensa virus19,20bidrag.
Korrelat till skydd är avgörande för att bedöma immunitet mot infektion. Dessa mätvärden kan forskare och kliniker att uppskatta effekten av vacciner, betydelsen av data, och behandlingen. Den enda etablerade korrelat för skydd mot infektion med influensa virus är den hemagglutination hämning analysen. En titer på 1:40 är associerade med en 50% minskning av risken för sjukdom1,21 – och återspeglar förekomsten av antikroppar som hämmar agglutination genom att rikta den receptor bindande platsen ligger på klotformig huvud HA. Det bör dock även noteras att T-cell svar kan vara en bättre korrelat för skydd mot influensa virusinfektion hos äldre. Intressant, menar en rapport att neuraminidas hämning aktivitet kan vara en bättre prediktor för immunitet mot influensa22. Lyckligtvis, typiska in vitro- testmetoder som neutralisering eller neuraminidas hämning analyser kan mäta HA stjälk – eller neuraminidas-specifika antikroppar. De flesta av dessa konventionella in vitro- analyser, dock endast beakta funktionen av regionen antigen bindning av antikroppen och mäter inte rollen som regionen Fc. Bidrag från icke-neutraliserande antikroppar som skyddar via Fc receptor engagemang i vivo är dessutom inte upptäckta17,18. För att mäta skydd av antikroppar som inducerar Fc-medierad immunitet såsom antikropp beroende cell medierad cytotoxicitet (ADCC), behövs en robust in vitro- test.
Den metod som beskrivs nedan bedömer förmågan av murina monoklonala antikroppar att inducera Fc-medierad funktioner med hjälp av en genetiskt modifierad Jurkat cellinje uttrycker en aktivera murint typ 1 FcR, FcγRIV. Antikropp engagemang av FcγR transduces Intracellulär signalering som utlösare nukleär faktor av aktiverade T-celler-medierad luciferas aktivitet. Analysen har flera fördelar jämfört med traditionella tekniker som kräver isolering och kultur av primära effektor celler och användningen av flödescytometri till upptäcka aktiveringen av Fc-medierad effektor funktioner19,23,24 ,25,26. Protokollet beskrivs här kan först enkelt anpassas till införliva olika viral mål, FcγRs och antikroppar från olika arter (mänskliga och murina). Användning av en modifierad Jurkat cell linje andra uttrycker en FcγR med ett luciferas reporter gen under en nukleär faktor av aktiverade T-celler (NFAT) möjliggör en storformat analysmetod som kan enkelt analyseras med hjälp av en tallrik läsare mäta luminiscens. Här, ersätts den traditionella aktiveringen av primära effektor celler med induktion av NFAT-luciferas vid antikropp engagemang av en FcγR på ytan av den Jurkat cellen. Denna plattan med 96 brunnar format analys möjliggör mätning av upp till fyra olika prover i exemplar med sju utspädningar – ett antal prover som kan vara besvärligt med traditionella tekniker. Det finns ytterligare punkter att tänka med denna analysmetod som kan påverka utformningen av experiment och tolkningen av data. Viral målet måste uttryckas på cellytan för antikropp erkännande. För att minska detta, kan vara direkt belagd mål antigenet (t.ex. en intern virala protein) på ytan av en platta. Men har detta ännu inte strikt testats. Dessutom den modifierade Jurkat cellinje uttrycker endast en typ av aktivering av FcγR och uttrycka inte någon hämmande FcγRs, medan primär cellinjer express alla receptorer i fysiologiska sammanhang.
Vi har tidigare använt denna analys visar att epitop specificitet i polyklonala sammanhang spelar en avgörande roll i regleringen av Fc-medierad effektor funktioner och att optimal aktivering av antikroppsberoende cellmedierad reaktion kräver två punkter Kontakta27,28. Här beskriver vi en metod som bedömer förmågan av stjälk-specifika monoklonala antikroppar att engagera och aktivera det murint aktivera FcγRIV. Det finns undantag29,30, ett stort antal brett panelreaktiva antikroppar rikta regionen antigena bevarade stjälk i hemagglutinin och därmed en viktig roll i utvecklingen av en universell influensa vaccinet.
Den metod som beskrivs här tillåter användaren att mäta en HA-specifik monoklonal antikropp förmåga att engagera den murina FcγRIV. Målet antigenet, influensa virus hemagglutinin, uttrycks på ytan av celler efter infektion av virus eller transfection av plasmid DNA. Analysen är mer mottagliga för med olika surface-uttryckta virala proteiner i kombination med andra FcγRs (människor eller murin). Dessutom har vi använt sera prover för att analysera antikroppar i ett polyklonala sammanhang förmåga att induc…
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt har delvis finansierats med federala medel från nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under CEIRS kontrakt P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
A549 cells | ATCC | CCL-185 | Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells |
HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | Human embryonic kidney cells |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | Transfection reagent |
1X Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
White tissue culture treated 96-well plate | Corning, Inc. | 3917 | Assay plates |
10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
Jurkat cell expressing murine FcgRIV | Promega | M1201 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
Jurkat cell expressing human FcgRIIIa | Promega | G7010 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
Jurkat cell expressing human FcgRIIa | Promega | G9901 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
Luminometer | BioTek | Synergy H1 Multi-Mode reader | Luminescence plate reader |
Bio-Glo Luciferase Assay System | Promega | G7940 | Contains luciferase assay buffer and luciferase assay substrate |
Madin Darby canine kidney cells | ATCC | CCL-34 | Canine kidney cells |