Vi beskriver en metode for å måle aktivering av funksjoner Fc-mediert effektor av antistoffer som er rettet mot influensa virus hemagglutinin. Denne analysen kan også tilpasses for å vurdere muligheten av monoklonale antistoffer eller polyklonale sera målretting andre viral overflate glykoproteiner å overtale Fc-mediert immunitet.
Antistoffer spille en avgjørende rolle i koblingen immunreaksjoner medfødte og adaptive mot viral patogener gjennom antigen bindende domener og Fc-regioner. Her beskriver vi hvordan måle aktiveringen av Fc funksjoner effektor av monoklonale antistoffer målretting influensa virus hemagglutinin med bruk av en genmodifisert Jurkat celle linje uttrykke aktiverings type 1 Fc-FcγR. med denne metoden, den bidrag av bestemte Fc-FcγR vekselsvirkningene av immunglobuliner kan bestemmes i vitro analysen.
Immunitet fra sesongens influensavaksine har tradisjonelt blitt vurdert av hemagglutination hemming (HI) analysen1, som måler tilstedeværelse av antistoffer som mål reseptor binding området av hemagglutinin. Disse HI-aktiv antistoffer kan tildele sterilisering immunitet, men er generelt smale i deres bredden i beskyttelse, gi immunitet til bare en velge noen stammer av influensavirus. Isolering og karakterisering av grovt reaktive monoklonale antistoffer som gjenkjenner hemagglutinin (HA) tyder utviklingen av en universal influensavaksine er innen rekkevidde2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8. en av de viktigste målene for en universell influensavaksine er å indusere en sterk antistoffet svaret mot de konserverte områdene av influensa virus9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. bredt reaktive antistoffer som gjenkjenner disse bevarte epitopes, består av både nøytraliserende og ikke-nøytralisere antistoffer17,18, har vist seg å kreve Fc-FcγR vekselsvirkningene for optimal beskyttelse i vivo og høydepunkt bidrag av Fc-mediert immunitet til generelle immunforsvaret til influensa virus19,20.
Korrelerer beskyttelse er avgjørende i å vurdere immunitet mot infeksjon. Disse verdiene kan forskere og klinikere å beregne effekten av vaksiner, betydningen av data, og i løpet av behandling. Den eneste etablerte relateres til beskyttelse mot influensa virus smitte er hemagglutination hemming analysen. En titer 1:40 er forbundet med en 50% reduksjon i risikoen for sykdom1,21 – og gjenspeiler tilstedeværelse av antistoffer som hemmer agglutinerende ved målretting reseptoren bindende område ligger på globular hodet av HA. Men bør det også bemerkes at T-celle svar kan være en bedre relateres til beskyttelse mot influensa virusinfeksjon hos eldre. Interessant antyder en fersk rapport at neuraminidase hemming aktivitet kanskje være en bedre prediktor for immunitet til influensa22. Heldigvis, typisk i vitro søk som nøytralisering eller neuraminidase hemming analyser kan måle HA stengel – eller neuraminidase-spesifikke antistoffer. De fleste av disse konvensjonelle i vitro analyser, men bare tar hensyn til funksjonen i antigen bindende regionen antistoffer og måler ikke rollen regionen Fc. I tillegg bidrag av ikke-nøytralisere Antistoffene det beskytte via Fc reseptor engasjement i vivo er ikke oppdaget17,18. For å måle vern av antistoffer som induserer Fc-mediert immunitet som antistoff avhengige celle mediert cytotoksisitet (ADCC), er en robust i vitro analysen nødvendig.
Metoden beskrevet nedenfor vurderer muligheten for murine monoklonale antistoffer å overtale Fc-mediert funksjoner ved hjelp av en genetisk modifisert Jurkat celle linje uttrykke aktiverings murint type 1 FcR, FcγRIV. Antistoff engasjement i FcγR transduces intracellulær signaliserer at utløsere kjernefysiske faktor aktivert T-celler-mediert luciferase aktivitet. Analysen har flere fordeler sammenlignet med tradisjonelle teknikker som krever bruk av flowcytometri å merker aktivisering Fc-mediert effektor funksjoner19,23,24, isolasjon og kultur av primære Effektor celler ,25,26. Først kan protokollen beskrevet her lett tilpasses å inkorporere ulike viral mål, FcγRs og antistoffer fra ulike arter (menneskelige og murine). Andre, bruk av en modifisert Jurkat celle linje uttrykke en FcγR med en luciferase reporter gene under en kjernefysiske faktor på aktivert T-celle (NFAT) gir en stort format analysen som kan analyseres lett bruke en plate leser måle luminescence. Her, erstattes tradisjonelle aktivering av primære Effektor celler med induksjon av NFAT-luciferase på antistoff engasjement i en FcγR på overflaten av Jurkat cellen. Denne 96-brønns plate format analysen kan for måling av opptil fire forskjellige prøver triplicates med syv fortynninger-en rekke prøver som kan være tungvint benytter tradisjonell teknikker. Det er flere punkter du bør vurdere med denne analysen som kan påvirke utformingen av eksperimenter og tolkning av data. Viral målet må uttrykkes på cellens overflate for at antistoff anerkjennelse. For å løse dette, kan målet antigen (f.eks en intern viral protein) være direkte belagt på overflaten av en plate. Men har dette ennå ikke blitt grundig testet. I tillegg den endrede Jurkat celle linjen uttrykker bare én type aktivere FcγR og uttrykker ikke noen hemmende FcγRs, mens primære cellelinjer uttrykke alle reseptorer i fysiologiske sammenheng.
Vi har brukt denne analysen til å demonstrere at epitope spesifisitet i en polyklonale sammenheng spiller en avgjørende rolle i å regulere Fc-mediert effektor funksjoner og at optimal aktivering av antistoff-avhengig celle-mediert respons krever to punkter av Kontakt27,28. Her beskriver vi en metode som vurderer evne til strå-spesifikke monoklonale antistoffer å engasjere og aktivere murint aktivere FcγRIV. Men det er unntak29,30, et stort antall bredt reaktive antistoffer målrette antigenically bevart stilken regionen i hemagglutinin og dermed spille en viktig rolle i utviklingen av en universal influensa vaksine.
Metoden beskrevet her tillater brukeren å måle hvor en HA-spesifikke monoklonale antistoffer til å engasjere seg i murine FcγRIV. Målet antigen, influensa virus hemagglutinin, er uttrykt på overflaten av cellene etter infeksjon av virus eller hva av plasmider DNA. Analysen er flere mottagelig å bruke ulike overflaten-uttrykt virale proteiner sammen med andre FcγRs (mennesker eller Trouble). I tillegg, vi har brukt sera prøver for å vurdere muligheten av antistoffer i en polyklonale sammenheng å overtale Fc fun…
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet har blitt finansiert delvis med føderale midler fra National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under CEIRS kontrakt P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
A549 cells | ATCC | CCL-185 | Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells |
HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | Human embryonic kidney cells |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | Transfection reagent |
1X Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
White tissue culture treated 96-well plate | Corning, Inc. | 3917 | Assay plates |
10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
Jurkat cell expressing murine FcgRIV | Promega | M1201 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
Jurkat cell expressing human FcgRIIIa | Promega | G7010 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
Jurkat cell expressing human FcgRIIa | Promega | G9901 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
Luminometer | BioTek | Synergy H1 Multi-Mode reader | Luminescence plate reader |
Bio-Glo Luciferase Assay System | Promega | G7940 | Contains luciferase assay buffer and luciferase assay substrate |
Madin Darby canine kidney cells | ATCC | CCL-34 | Canine kidney cells |