Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

Summary

Ziel des Protokolls ist eine optimierte Verfahren für die Einrichtung eines in-vitro- Blut – Hirn-Schranke (BBB) Modells basierend auf primäre porcinen Gehirn endothelial Zellen (pBECs) zu präsentieren. Das Modell zeigt hohe Reproduzierbarkeit, hohe Dichtigkeit und eignet sich für Studien der Transport- und intrazellulären Menschenhandel in der Wirkstoffforschung.

Abstract

Das Ziel dieses Protokolls stellt eine optimierte Verfahren für die Reinigung und Pflege der pBECs und in-vitro- Blut – Hirn-Schranke (BBB) Modelle basierend auf pBECs in Mono-Kultur (MC), MC mit Astrozyten konditioniertes Medium (ACM), zu etablieren und berührungslose Kokulturen (NCC) mit Astrozyten von Schweinen oder Ratte Herkunft. pBECs waren isoliert und kultiviert aus Fragmenten der Kapillaren aus dem Gehirn Cortex von Hausschweinen ca. 5-6 Monate alt. Diese Fragmente wurden durch sorgfältige Entfernung der Hirnhaut, Isolation und Homogenisierung der grauen Substanz, Filtration, enzymatischen Verdauung und Zentrifugation gereinigt. Um weitere kontaminierende Zellen zu beseitigen, wurden die Kapillare Fragmente mit Puromycin-haltigen kultiviert Medium. Bei 60-95 % Zusammenfluss pBECs wächst aus der Kapillare Fragmente zu passagiert wurden durchlässige Membranfilter fügt und die Modelle gegründet. Um Barrier Dichtigkeit und BBB charakteristischen Phänotyp der pBECs zu erhöhen, wurden die Zellen mit folgenden Differenzierungsfaktoren behandelt: Membran permeationsfähigen 8-CPT-Zaatari (hier abgekürzt), Hydrocortison und ein Phosphodiesterase-Hemmer, RO-20-1724 (RO). Das Verfahren erfolgte über einen Zeitraum von 9-11 Tage, und bei der Festlegung der NCC-Modell waren die Astrozyten 2 bis 8 Wochen im Voraus kultiviert. Einhaltung der beschriebenen Verfahren des Protokolls ermöglichte die Errichtung der endothelialen Schichten mit stark eingeschränkter parazellulär Durchlässigkeit, mit NCC Modell zeigt einen durchschnittliche Transendothelial elektrischen Widerstand (TEER) 1249 ± 80 Ω cm ², und parazellulär Durchlässigkeit (P_app) für Luzifer gelb 0,90 10^-6 ± 0,13 10^-6 cm s^-1 (meine ± SEM, n = 55). Weitere Auswertung dieser pBEC Phänotyp zeigte guten Ausdruck der engen Knoten Proteine Claudin 5, ZO-1, occludin und Adherens Junction Proteins p120-Catenin. Das vorgestellte Modell eignet sich für eine Vielzahl von Studien der BBB in Gesundheit und Krankheit, und mit der sehr restriktive parazellulär Durchlässigkeit, eignet sich dieses Modell für Studien von Verkehr und Handel mit intrazellulären.

Introduction

Zelluläre Struktur und Funktion der Blut – Hirn-Schranke

An der Schnittstelle von Herz-Kreislauf und zentrales Nervensystem (ZNS) wirkt die BBB als eine wichtige regulatorische Seite für Volumenstörungen Kontrolle über die CNS Mikroumgebung, was für einwandfreie Funktion und Schutz des Nervensystems unerlässlich ist. Die Website der BBB ist die Auskleidung der Blutgefäße Lumen Endothelzellen. Im Gehirn Kapillaren Endothelzellen bilden komplexe interzelluläre enge Kreuzungen und stark polarisierten Expressionsmuster von bestimmten Zustrom und Efflux-Transporter sorgen für hochspezifische molekularen Transport zwischen dem Blut und der Gehirn- ¹. Die tragenden Teile der engen Kreuzung komplexe enthalten Proteine aus der Familie occludin und Claudin, Zonula Occludens (ZO) Proteine, Cingulin und verbundenen Knoten Adhäsionsmoleküle (JAMs). Claudin-5 ist besonders wichtig in der parazellulär Knoten Einschränkung. Induktion und Wartung von diesem charakteristischen BBB endotheliale Phänotyp beinhalten dynamische Wechselwirkungen mit umgebenden Zellen, einschließlich Perizyten, Astrozyten, Neuronen und die Keller-Membranen, die zusammen mit Gehirn endothelial Zellen Form der neurovaskuläre Einheit (NVU)^2,3. Die Mechanismen dieser Interaktionen beteiligt sind noch nicht vollständig geklärt, aber gehören der chemischen Signale zwischen Zellen, die Modulation der BBB Permeabilität kurzfristig und langfristig BBB Funktionen⁴induziert. Vor allem Astrozyten sind dafür bekannt, zu dem Gehirn endothelial Zelle Phänotyp beitragen und sind eine Quelle von regulatorischen Faktoren wie Glia-derived Neurotrophic Factor (tritt bei intrazellulären cAMP)⁵, grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor-⁶, Hydrocortison⁷und transformierende Wachstumsfaktor β (TGF-β)⁸. Die Wirkung von TGF-β, wurde jedoch diskutierten⁹.

Von In Vivo , In Vitro BBB

In Vivo Studien weiterhin wertvolle Informationen über BBB Biologie. Zellmodelle Kultur können jedoch zusätzliche Einblicke und stellen nützliche Werkzeuge für detaillierte molekulare und funktionelle Aspekte der BBB in Gesundheit und Krankheit zu verstehen. Obwohl die komplexen Wechselwirkungen zwischen der Zelltypen und Bestandteile der BBB in in-vitro- Modelle vollends schwierig sind, gibt es seit, die erste Reinigung des Gehirn endothelial Zellen und Anwendung dieser in Mono-Kulturen ^{10 , 11 , 12}, umfangreiche Entwicklung der Reinigung Verfahren und Wachstumsbedingungen der BBB Zell-Kultur-Modelle, wodurch größere Ähnlichkeit mit der in-Vivo -Barriere. Die häufig verwendete in-vitro- BBB-Modelle basieren auf Primärzellen Nagetier, Schweinen und Rindern Ursprungs und auf immortalisierte Zelllinien. Jedes Modell hat verschiedene vor- und Nachteile. Für Vergleich und Modell Wahl sind Validierung Markierungen wie Ausdruck der BBB-Enzyme, Transporter, Rezeptoren und Strukturproteinen verwendet, um Übersichten über die aktuellen Modelle¹zu erstellen.

Ziel des Protokolls

Ein wichtiges Merkmal der BBB Barrier Dichtigkeit und hohe TEER, aber eine große Anzahl der verfügbaren Modelle spiegeln nicht gut in Vivo -Level. Integration von Entwicklung und Optimierung Beiträge von mehreren Labors, ist das Ziel dieses Protokolls, eine Methode für den Aufbau eines hohen TEER in-vitro- BBB Modells basierend auf primäre pBECs in MC mit oder ohne ACM oder NCC mit primären präsentieren Astrozyten Ratte oder porcinen Ursprungs. Die dabei angewandten Verfahren und Etablierung des Modells gehören Bemühungen kontaminierende Zellen zu eliminieren und Differenzierung der pBECs in einem BBB-Phänotyp zu verbessern. Diese Arbeit führte zu die Einrichtung von zuverlässigen, TEER-Modelle mit niedrigen parazellulär Durchlässigkeit und gute funktionelle Expression des wichtigsten festen Knoten Proteine, Transporter und Rezeptoren. Wie die Astrozyten ein beitragender Faktor zum Gehirn endothelial Zelle Phänotypus, stellen die drei unterschiedlichen Bedingungen der Kultur jedoch drei unterschiedliche Phänotypen der Gehirn endothelial Zellen dar. Das NCC-Modell eignet sich speziell für Studien bestimmte spezielle Mechanismen in der Drogeentdeckung, Transportstudien und intrazellulären Menschenhandel, sowie für die Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen wo ist maximale Ausdruck der BBB-Funktionen vorteilhaft.

Ursprung und Geschichte des Protokolls

Das hier beschriebene pBEC-Modell basiert weitgehend auf dem porcinen Modell Eisai Laboratories (London) entwickelt von Dr. Louise Morgan und Kollegen, ist anhand einer erfolgreichen früheren bovine Gehirn Endothelzellen Modell¹³. Die ursprüngliche Methode der Zelle Vorbereitung war eine zwei-Stufen-Filtration mit Nylon Maschen um den Mikrogefäßen, gefolgt von einem subculturing Schritt zur Verbesserung der Reinheit zu fangen. In der früheren Entwicklung der Methode wurden durch Zunahme der ergänzten Form, u. a. ACM optimale BBB Phänotyp und Barrier Dichtigkeit erreicht. Weitere Änderungen an der Methode wurden von R. Skinner Prof N. Rothwell Lab in Manchester UK^14,15. Die Methode wurde von Abbott Labor, KCL London angenommen wo Patabendige es deutlich einfacher machte, durch den Verzicht von Astrozyten oder ACM und durch den Wegfall von kontaminierenden Zellen wie Perizyten mit Puromycin vorzubereiten. Die ersten Papiere bestätigt, dass das MC-Modell einige wichtige Merkmale des in Vivo BBB erhalten, einschließlich der effektiven engen Kreuzungen, Membran Verkehrssysteme und Rezeptor-vermittelten Transcytosis^{16,17 , 18 , 19 , 20}. später S. Yusof wieder Astrozyten Kokultur getestet und fand es TEER, deutlich verbessert, so ist dies die bevorzugte Variante, die derzeit in der Abbott Labor²¹verwendet. Das Modell wurde erfolgreich übertragen, M. Nielsen Lab in Aarhus, wo weitere Änderungen wurden eingeführt (das Protokoll), einschließlich der Vereinfachung grau Rolle, Extraktion, mit nur einem Netz von Filtrationsschritt und einen einzelnen Filter Beschichtung Schritt Kombination von Kollagen und Fibronektin. Das angewandte Verfahren zur Isolierung von porcinen Astrozyten (dieses Protokoll) beruhte auf Protokolle von T. Moos Labor in Aalborg, beschrieben von Thomsen Et al.²²entwickelt. Der TEER und andere Eigenschaften des Modells erzeugt in London und Aarhus sind ähnlich, die verleiht Vertrauen auf den Begriff, den das Modell ohne weiteres zwischen Labors übertragen und reagiert gut auf die sorgfältige Beobachtung und Rationalisierung der Verfahrensschritte. In der Tat hat S. Yusof jetzt das MC-Modell in einem tropischen Land (Malaysia)²³, die weitere Anpassung für die örtlichen Gegebenheiten und Gewebe Quellen beteiligt.

Vorteile gegenüber alternativen Methoden und derzeit etablierte Modelle

Im Vergleich zum Gehirn endothelial Zellen Nagetier und bovinen Ursprungs, bieten pBECs den Vorteil, dass eine niedrigere Rate des Verlustes der in Vivo BBB-Phänotyp nach Isolierung²⁴. Darüber hinaus sind pBECs in der Lage, relativ enge endotheliale Barrieren zu bilden, auch wenn Sie in MC (800 Ω cm²)¹⁶ im Vergleich zu den häufigsten berichteten Kosten von Monolagen Zell-Linien wie bEND.5 und bEND.3 (50 Ω cm²) angebaut ^{25 , 26 , 27}, dende (300-800 Ω cm²)^28,29,30, und CerebEND (500 Ω cm²)^29,31,32und primäre Gehirn endothelial Zellen der Maus (100-300 Ω cm²)SS = “Xref” > 33^,34,35,36 und Ratte (100-300 Ω cm²)^37,38. Allerdings hat der TEER Abhängigkeit auf die Reinigung und Kultur Verfahren dargestellt. In den meisten Fällen zeigt die Zugabe von ACM oder Kokultur mit Astrozyten differenzierende Wirkung auf die Endothelzellen und eine Erhöhung in Dichtigkeit der endothelialen Schichten¹. Trotzdem, mit Bemühungen um die Kultivierung Bedingungen zu optimieren, nur die Rinder-basierte Modelle haben gezeigt TEER Werten vergleichbar mit der Schweine-basierte Modelle (Durchschnitt von 800 Ω cm² MC, bis zu 2500 Ω cm² in Astrozyten Kokultur)^{13 ,39,40,41,42,43,44,45}. Wie die Modelle basierend auf primäre bovine Gehirn haben endotheliale Zellen gezeigt große Unterschiede, sowohl zwischen als auch innerhalb von Laboratorien^{14,45,46,47,48}, Reproduzierbarkeit könnte ein Problem sein. Im pBEC Modell hier berichtet haben der beteiligten Laboratorien mit geringer Variabilität, sowohl in als auch zwischen den Labors sehr ähnlich wie TEER und parazellulär Permeabilität Werte erreicht. Daher sollte es für andere Labors, ein robustes Modell mit geringer Variabilität, mit der hier vorgestellten Methode möglich. Neben enge endotheliale Schichten bilden, wurden Modelle mit pBECs vorher durch Expression von tight Junction-Proteine, funktionale BBB-Transporter, Rezeptoren und Enzymen und nachgewiesene Eignung für verschiedenste Studien¹⁵ validiert ^{, 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59}. Außerdem unveröffentlichte Transkriptom-Daten auf die Ko-Kulturen von pBECs zeigt eine erwartete Profil der BBB-Transportern und Rezeptoren (unveröffentlichte Ergebnisse, Nielsen Et Al.).

Schweine-basiertes BBB-Modell hat einen weiteren Vorteil als Genom, Anatomie, Physiologie und Fortschreiten der Krankheit des Schweins reflektieren die Humanbiologie in höherem Maße als andere etablierte Modelle verfügt über⁶⁰, die günstig sind für die pharmazeutischen Industrie. Da Schweine Gehirne gemeinsame Nebenprodukt der Fleischindustrie sind, bilden sie eine leicht zugängliche Quelle des Gehirns Endothelzellen, minimieren die Anzahl der Tiere für die Experimente benötigt, und bietet einen hohen Reinigung Ertrag aus einem porcinen Gehirn. Obwohl Reinigung und Pflege von Primärzellen ist etwas zeitaufwändig und erfordert Know-how für Standardisierung bei der Einrichtung des Modells, generieren Primärzellen die zuverlässigste BBB-Modelle. Immortalisierte Zelllinien können nicht Ersatz, als wichtige Eigenschaften sein, wie z. B. Barriere Engegefühl, Transporter Expressionsprofile und Mikroumgebung Verordnung nicht entsprechen die experimentelle Befunde in Vivo^{61, 62}. in-vitro- Modelle bieten den Vorteil von live-Cell imaging mit höherer Auflösung, die Visualisierung von intrazellulären Prozessen ermöglichen dadurch, dass einen unmittelbarer Nähe Ansatz für die Stichproben oder beobachteten Zellen, mit Zielen mit höheren Vergrößerung und bessere optische Qualität⁶³. Dies gilt nicht für die Verwendung von zwei-Photonen-Mikroskopie in lebenden Tieren. Des weiteren bieten in-vitro- Modelle die Möglichkeit, Zellen, erlaubt Visualisierung von tagged Proteine und Untersuchung ihrer Menschenhandel transfizieren.

Anwendungen des Modells

Die Funktion der BBB ist nicht festgelegt und kann dynamisch in Physiologie und Pathologie moduliert werden. Bei vielen neurologischen Krankheiten, einschließlich Neurodegenerative entzündliche und infektiöse Erkrankungen, Störungen und erhöhte Durchlässigkeit der BBB beobachtet^64,65,66,67 . Um zu verringern und Fortschreiten der Krankheit und Folgeschäden zu verhindern, sind die Identifizierung und Charakterisierung der molekularen Mechanismen der Modulation der BBB von großer Bedeutung. In diesem Zusammenhang zuverlässige in-vitro- Modelle sind in der hohen Nachfrage durch die pharmazeutische Industrie, und außerdem eine wichtige Rolle bei der Vorhersage des BBB Permeabilität von Drogen an die CNS. Jedes in-vitro- Modell als eine Durchlässigkeit Bildschirm sollte eine restriktive parazellulär Weg, eine physiologisch realistische Zellarchitektur und funktionelle Expression von Transporter Mechanismen⁶⁸anzeigen. Zeigte, in früheren Studien^16,17,57, und durch parazellulär Durchlässigkeit und Ausdruck der TJ und AJ Proteine hier das vorgestellte Modell erfüllt alle diese Kriterien und eignet sich für eine Reihe von BBB Studien in beiden normalen Physiologie und Pathologie. Die Stärken der die vorgestellte Methode der Reinigung und Pflege sind eine Kombination aus Einfachheit und Reproduzierbarkeit und die Möglichkeit, astrocytic zu beeinflussen, mit einem daraus resultierenden robust und zuverlässig hohe TEER in-vitro- BBB-Modell. Für diesen Zweck, Astrozyten von Schweinen und Ratte Ursprung haben gezeigt, dass die BBB-Phänotyp der pBECs in einer ähnlichen Art und Weise²²ergänzen.

Protocol

porcinen Gehirne wurden als Nebenprodukte der dänischen Lebensmittelindustrie erhalten. Dänischen Schlachthöfen sind unter strenger Überwachung und Beobachtung durch das dänische Ministerium für Umwelt und Lebensmittel. Ratten für die Isolierung von Astrozyten verwendet wurden gezüchtet und in den lokalen Tierhaus bei einer Umgebungstemperatur von 22 ° C – 23 ° C und auf einem 12/12 h hell/dunkel-Zyklus unter Kontrolle des Tierarztes und nach Dänisch Gruppe untergebracht Vorschrif…

Representative Results

Gründung der BBB In-vitro- Modelle In der vorgestellten, optimierte Methode Anbau von pBECs und die Errichtung des durchlässige Membran einfügen mit MC oder ohne ACM oder NCC mit Astrozyten (Abbildung 1) für einen Zeitraum von 9 bis 11 Tagen (Abbildung 2) erfolgte. Für die Auswahl von Endothelzellen, wurde eine erste Kultur der gereinigten Kapillare Fragmente…

Discussion

Reinigung und Verbreitung von pBEC

Während die Reinigungsprozedur gehören wichtige Schritte schnelle und wirksame Beseitigung der Hirnhaut und Trennung der weißen und grauen Materie, die wichtig für die Reinigung Ausbeute und Reinheit und für den richtigen Aufbau des Modells ist. Für die vorgestellten in-vitro- BBB-Modell mit pBECs haben wir verbessert und vereinfacht eine Reinigungsprozedur basierend auf mechanische Homogenisierung der isolierten graue Substanz, Größe-selektive …

Materials

Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524
DMEM/F-12	Lonza	BE12-719F
DMEM/Low Glucose	Sigma-Aldrich	D6046
Penicillin/Streptomycin	Gibco Invitrogen	15140
Plasma derived serum (PDS)	First Link UK Ltd.	60-00-89
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco Invitrogen	10-270-106
Trypsin/EDTA	Gibco Invitrogen	15090-046
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001
8-CPT-cAMP	Biolog	C010
RO 20-1724	Sigma-Aldrich	B8279
Gentamicin Sulfate	Lonza	17-518Z
DMSO	Sigma-Aldrich	34896
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
EtOH	VWR	20,824,296	Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1	Sigma-Aldrich	D4513
Collagenase CLS2	Sigma-Aldrich	C6885
ddH2O			Made with Elga System
T75 flasks	Thermo Scientific	156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts)	Costar	CLS3401	12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes	Cellstar	188271
50 ml centrifuge tubes	Cellstar	227261
Petri dishes	Thermo Scientific	150350
Cryo vials	Thermo Scientific	377224
500 ml bottle	Thermo Scientific	159910/159920
Scalpels	Swann-Morten	REF0211	Type 24
Tissue homogenizer	Sigma	D9188
140 μm filters	MERCK	NY4H04700
40 μm filters	Corning	431750
EndOhm chamber system	World Precision Instruments	ENDOHM-12	EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system	World Precision Instruments	300523+STX100C	TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle	Sigma		Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps	KLS Martin	12-409-12-07
Broad tip forceps	VWR	82027-390
Filter holder	MERCK Milipore	Swinnex-47
50 ml syringe	Braun	4617509F
10 ml syringe	Terumo	SSt20ESI
Anti-Occludin antibody	Abcam	ab31721	1:100
Anti-p120 Catenin antibody	BD Transduction laboratories	610133	1:200
Anti-ZO-1 antibody	Invitrogen	61-7300	1:200
Anti-Claudin 5 antibody	Sigma-Aldrich	SAB4502981	1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568	Thermo Scientific	A10042	1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488	Thermo Scientific	A21202	1:500
Sucrose	Perkin Elmer	NEC100X250UC	0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow	Sigma	L0144	10 µg/ml final working conc