Summary
Este protocolo descreve o desenvolvimento de uma em vitro humana pré-clínicos modelo de osteoclastogenesis de monócitos do sangue periférico cultivados com linhas de células de câncer de mama para simular a interação de osteoclasto-célula de câncer. O modelo pode ser usado para promover nossa compreensão da formação de metástase óssea e melhorar as opções terapêuticas.
Abstract
O crosstalk entre células tumorais e células ósseas no microambiente do osso é crucial para a compreensão do mecanismo de formação de metástase óssea. Desenvolvemos um em vitro totalmente pré-clínicos modelo humano de um co-cultura de células de câncer de mama e monócitos, passando por diferenciação no sentido de osteoclastos. Nós aperfeiçoamos um modelo de osteoclastogenesis a partir de uma amostra de sangue periférico coletada de doadores saudáveis. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) primeiro foram separadas por centrifugação gradiente de densidade, semeadas em uma densidade elevada e induzidas a diferenciar-se pela adição de dois fatores de crescimento (GFs): ativador do receptor do ligante fator nuclear-κB (RANKL) e macrófagos fator colônia-estimulando (MCSF). As células foram deixadas na cultura durante 14 dias e então fixo e analisadas pela análise a jusante. Em metástases ósseas osteolíticas, um dos efeitos da chegada de células de câncer no osso é a indução de osteoclastogenesis. Assim, desafiamos nosso modelo com colegas de culturas de células de câncer de mama para estudar o poder de diferenciação de células de câncer com relação a GFs. Uma maneira simples de estudar a interação de osteoclasto-célula de câncer é realizar culturas co indirectas, baseadas na utilização do meio condicionado colhidos em culturas de células de câncer de mama e misturado com meio fresco. Esta mistura é usada para induzir a diferenciação do osteoclast. Nós também Aperfeiçoamos um método de co-cultura direto no qual câncer células e passando por diferenciação de monócitos compartilham o meio em trocam de fatores secretados. Isto é uma melhoria significativa sobre o método indireto co-cultura original como pesquisadores podem observar as interações recíprocas a tipos de duas células e realizar análises a jusante para as células cancerosas e osteoclastos. Este método permite-nos estudar o efeito das drogas sobre o microambiente metástase óssea e às linhas de célula semente que não sejam aqueles derivados de câncer de mama. O modelo também pode ser usado para estudar outras doenças como a osteoporose ou outras condições de osso.
Introduction
Osso é um local comum de metástases para diferentes tipos de tumores primários, como o câncer de próstata, pulmão e mama, com 20-25% dos pacientes desenvolvendo metástases ósseas durante o curso da doença.1,2,3. Em particular, 70% dos pacientes de câncer de mama carregar evidências de metástases ósseas em morte4. Tumor e células estromais interação é essencial para a progressão do câncer em câncer primário e lesões secundárias. No microambiente do osso, metástases ósseas osteolíticas de câncer de mama dependem do estabelecimento de um ciclo vicioso patológico ocorrendo entre as células cancerosas, células ósseas e o microambiente do osso. As células cancerosas perturbam o equilíbrio do osso, aumentando a reabsorção de osso5,6,7.
Em condições normais e patológicas, osteoclastos são as células responsáveis pela reabsorção óssea, enquanto que os osteoblastos, em depositar a nova matriz, são responsáveis pela formação de osso novo8. Atividade do osteoclasto é regulada por osteoblastos através da expressão de RANKL, que liga a seu receptor RANK na superfície de pre-osteoclasto, induzindo pre-osteoclast fusão, um processo necessário para diferenciação em osteoclastos maduros. A indução de osteoclastogenesis aumenta a reabsorção óssea. Um grande número de estudos em vivo melhoraram significativamente a nossa compreensão da metástase óssea formação9,10,de11. Células de câncer de mama do tumor primário e o microambiente ósseo perturbam a homeostase do osso, promovendo osteoclastogenesis e osso reabsorção8. Neste cenário, todas as interações moleculares que ocorrem entre as células cancerosas e osteoclastos são de importância crucial. Como já mencionado, o mecanismo de formação de metástase óssea já foi elucidado em modelos de ratos na vivo . No entanto, para além da necessidade de aprovação de todos na vivo as experiências com animais pelo Comitê de ética, existem vários outros inconvenientes para realizar experimentos na vivo incluindo altos custos e demorados métodos. Vários autores têm combinado pré-clínicos modelos in vivo e in vitro de osteoclastogenesis usando uma linha de murino de pre-osteoclastos chamado RAW246.79,10,11. As desvantagens deste modelo derivam do fato de que as células já estão empenhadas em tornar-se pre-osteoclastos e não são de origem humana. Por estas razões, pesquisa translacional poderia beneficiar grandemente a disponibilidade em vitro plenamente humano modelos pré-clínicos para estudar interações de célula de câncer de osso.
Nós aperfeiçoamos um método de osteoclastogenesis em vitro a partir de amostras de sangue periférico humano12,13. Os osteoclastos derivam de monócitos, que estão presentes, embora em pequeno grau, em amostras de sangue periférico. Células mononucleares são primeiro separou os eritrócitos e granulócitos presentes em sangue total por gradiente de densidade Ficoll; Eles são então selecionados graças a sua capacidade de aderir ao substrato plástico, ao contrário dos linfócitos. Após a semeadura, as células são cultivadas por 14 dias. MCSF e RANKL são o GFs exigido por monócitos para diferenciar primeiro em macrófagos e depois em osteoclastos14,15. MCSF é necessária para toda a duração do ensaio, enquanto RANKL é usado para induzir o processo de diferenciação em estágios finais de osteoclastogenesis. Na fase inicial de diferenciação, MCSF ajuda monócitos proliferam e sobreviver14,15. Durante a segunda parte do osteoclastogenesis, as células se fundem e amadurecem como osteoclastos, mostrando a distribuição característica de actina F em anéis e expressando marcadores específicos tais como a fosfatase ácida tartarato-resistente (TRAP) e receptor de calcitonina (CTR) 14 , 15. nosso método consiste em Adicionar MCSF para a cultura de monócitos para os primeiros 7 dias do experimento e uma combinação de MCSF e RANKL dos dias 7 a 14. No final do experimento, osteoclastogenesis é analisado pela contagem de células diferenciadas, conforme detalhado abaixo.
As culturas de monócitos induzidas para diferenciar pelo GFs formam a base do nosso modelo pré-clínicos. Nós aperfeiçoamos um sistema co-cultura sem GFs para entender melhor o poder de osteoclastogenic de células de câncer de mama. Primeiro desenvolvemos um modelo de culturas co indiretos adicionando uma média (80% α-meio essencial mínimo (α-MEM) e 20% condicionado médio coletado de uma cultura de células de câncer de mama que foram confluente cerca de 90% de células em fase de diferenciação12 . O meio condicionado (não recolhido em condições de privação de soro) foi coletado após 24 horas e misturado com meio fresco em uma proporção de 1:4. O meio condicionado induzido diferenciação osteoclast significativa em relação ao controle negativo. No entanto, como as informações sobre a interação recíproca entre as células cancerosas e células ósseas são perdidas quando utilizar culturas co indiretas, melhoramos nosso sistema efectuando culturas co diretas. Temos semeado células cancerosas em 0,4 µM insere e colocou-os em poços onde as células mononucleares foram banhadas. Usando esse método, as células compartilham o mesmo meio e trocam proteínas secretadas. Assim, criamos um modelo totalmente humano pré-clínicos de osteoclastogenesis induzida por câncer células13.
Este sistema é extremamente versátil e pode ser usado para fins de investigação diferentes, por exemplo, em estudos farmacológicos, investigando o papel das drogas na metástase óssea. Nosso modelo torna possível estudar a eficácia e os mecanismos de ação das terapias de osso-alvo e/ou drogas antitumorais no microambiente de osso na presença de células de câncer13. Projetando os experimentos com os controles corretos, ou seja, as células cancerosas e osteoclastos cultivados individualmente, torna mais fácil compreender o impacto da cultura co na atividade de drogas. Esta abordagem se torna ainda mais interessante quando ambos câncer células e osteoclastos, por exemplo, everolimus16destina-se a droga em estudo. Este modelo também pode ser usado para identificar novos caminhos de interação entre as células cancerosas e células ósseas.
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Protocol
osteoclastos humanos foram diferenciados de PBMC de doadores saudáveis que deu consentimento escrito para participar no estudo. O protocolo de estudo foi aprovado pelo Comitê de ética local, em conformidade com os padrões éticos estabelecidos na declaração de Helsinque 1964.
1. diferenciação osteoclast
Nota: coletar sangue periférico ou casacos de buffy de doadores humanos saudáveis em EDTA. Não use a menos de 20 mL de sangue periférico. Casacos de Buffy são preferíveis porque eles têm uma maior abundância de células mononucleares. Executar todas as etapas a seguir em uma capa de cultura de tecido estéril.
- Sangue total de EDTA diluir 1:1 com 1 x tampão fosfato salino (PBS). Re-suspender bem.
- Camada na mídia de separação de linfócitos (PBS de sangue: mídia de separação de linfócitos, 2:1) em tubos de 50 mL.
- Pipetar 30 mL de sangue diluído em PBS em um tubo de 50 mL.
- Suavemente subjacência 15 mL de mídia de separação de linfócitos na parte inferior do tubo de 50 mL.
- Centrifugar 757 × g por 10 min à temperatura ambiente (sem freios).
- Coleta as células mononucleares:
- recolher a camada branca de células mononucleares com uma pipeta de 5 mL, sem agitação e colocá-lo em um novo tubo de 50 mL.
- Diluir os PBMCs coletados com 20 mL de PBS.
- Lavar o PBMC:
- centrifugar 225 x g por 5 min à temperatura ambiente.
- Desprezar o sobrenadante por inversão do tubo. Repetir uma vez.
- Lise RBC:
Nota: se o centrifugado é vermelho, tratar as células com células vermelhas do sangue solução-tampão de lise (ver Tabela de materiais).- Colocar o tubo de 50 mL na Ice.
- Adicionar 5 mL de tampão de Lise glóbulo vermelho.
- Esperar 3-5 min para completar a lise de eritrócitos. O tempo varia de acordo com o grau de contaminação eritrocitária.
- Pare a reação adicionando 20 mL de PBS.
- Centrífuga em 225 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante por inversão do tubo.
Nota: Opcional: se a Lise RBC é executada, lave os PBMCs conforme descrito abaixo.
- Lavagem PBMCs:
- Adicionar 20 mL de PBS e centrifugar a 225 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
- Desprezar o sobrenadante por inversão do tubo.
- Re-suspender as células em completa α-MEM (suplementados com glutamina 1% (concentração inicial 100 X) e 10% de soro fetal bovino).
- Contar as células com uma câmara de Neubauer.
- Diluir a amostra 1: 100 em ácido acético glacial e usar 10 µ l da diluição para contar células.
- Contar pelo menos duas vezes e calcular a média de repetições para obter o número médio total de células coletadas.
- Células da placa:
- placa de células em uma concentração de 750.000 PBMC por cm 2.
- Armazenar células chapeadas em uma incubadora a 37 ° C numa atmosfera 5% CO 2.
Nota: Design o experimento para incluir controles negativos, que são as células que são tratadas com α-MEM completa normal sem MCSF ou RANKL GFs. Lembre-se para realizar cada condição pelo menos 3 técnicos de Replica. Realizar pelo menos 3 réplicas biológicas.
- Alterar o suplementado com GFs:
- esperar cerca de 3 h após a semeadura da célula e remova o meio com uma pipeta (200-1.000 µ l) para descarte de detritos, células desanexadas e eritrócitos.
Nota: Tenha cuidado ao alterar o meio para evitar o desprendimento celular. - Adicionar novo completo α-MEM suplementado com 20 ng/mL de MCSF (500 µ l/poço).
Nota: Quando co cultivo com células cancerosas, semente do câncer células o dia após a semeadura de PBMC.
- esperar cerca de 3 h após a semeadura da célula e remova o meio com uma pipeta (200-1.000 µ l) para descarte de detritos, células desanexadas e eritrócitos.
- Alterar os meios de comunicação a cada 2-3 dias (α-MEM suplementado com 20 ng/mL de MCSF):
- descartar o meio de uma pipeta de µ l 200-1.000.
- Add novo meio fresco por pipeta 200-1.000 µ l.
- 6-7 dias após a semeadura de células, adicionar 20 ng/mL de RANKL para α completa-MEM + MCSF.
- Mudar o médio (α completa-RANKL + MEM + MCSF) cada 2-3 dias:
- descartar o meio de uma pipeta de µ l 200-1.000.
- Adicionar novo meio de uma pipeta de µ l 200-1.000. Pare de indução de diferenciação 14 dias após a semeadura de célula.
- Meio de descarte e lavar duas vezes com PBS.
- Corrigir células com paraformaldeído:
- deixar células secar.
- Adicionar paraformaldeído 4% (ver Tabela de materiais).
- Incubar por 20 min em temperatura ambiente.
- Descartar paraformaldeído e lavar duas vezes com 500 µ l de PBS.
Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; por favor, usar luvas, máscara e óculos. - Permitir que células secar.
- Armadilha realizar a coloração de acordo com o fabricante ' instruções de s (veja a Tabela de materiais).
- Contar células osteoclasto manualmente sob o microscópio ampliação de 10x; AT 0,30.
Nota: Células osteoclasto são definidas como armadilha + polycarion células com pelo menos 4 núcleos.
2. Culturas de células de câncer
Nota: as experiências podem ser executadas com diferentes tipos de linhas de células de adenocarcinoma de mama como SCP2 17, uma linha de celular osteotropic originários do triplo negativo humano linhagem de células de câncer de mama (MDA-MB-231) e a linha hormonal positivo do receptor celular MCF7.
- Cultura as células como um monolayer 75cm 2 frascos.
- Semente 1.000.000 células cancerosas em um frasco de 75 cm 2.
- Armazenar as células a 37 ° C em meio α completa-MEM suplementado com 1%-glutamina e 10% o soro bovino fetal numa atmosfera 5% CO 2.
- Separar as células em uma confluência de cerca de 90%:
- descartar o meio de lavagem com PBS e adicionar 2-3 mL de tripsina 1 X em PBS.
- Incubar células para 3-5 min a 37 ° C.
- Recolher as células desanexadas de 75cm 2 frasco de uma pipeta de 10 mL, adicionar 8 mL de meio completo para parar a reação enzimática.
- Centrifugar a 225 x g por 5 min.
- Lavar as células cancerosas:
- Adicionar 10 mL de PBS.
- Centrifugar a 600 x g por 5 min.
- Contar as células de câncer com uma câmara de Neubauer.
- Contar as células de câncer de pelo menos duas vezes e calcular a média de repetições para obter o número médio total de células coletadas.
3. Direto co culturas de células cancerosas um nd monócitos submetidos à diferenciação no sentido de osteoclastos
- propagar as células cancerosas em inserções (poros de diâmetro 0.4 µm):
- propagar as células cancerosas em uma concentração de 4.000 células por cm 2.
- Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2.
Nota: Semente do câncer células o dia depois de PBMC semeando para o experimento de co-cultura em 0,4 µm inserções.
- Esperar 24 h permitir que as células aderir.
- Lugar o semeado inserir cultura sobre as culturas mononucleares para iniciar a cultura co (ver secção 1.10 do protocolo).
- Mudar a mídia cada 2-3 dias com α-MEM completa.
- Descartar o meio de uma pipeta de µ l 200-1.000.
- Adicionar 500 µ l de fresco médio.
Nota: O objectivo principal da cultura co é entender o poder de osteoclastogenic das células cancerosas, portanto, o GFs não é adicionado ao α-MEM. Em cada experimento de co-cultura, incluem necontroles gative (ver nota na etapa 1.10 do protocolo) e controlos positivos de osteoclastos diferenciados por RANKL e MCSF (sem células cancerosas). As células cancerosas semeadas nas bulas não colocadas sobre células mononucleares são usadas como um controle negativo da cultura co.
- Pare a co-cultura e usar células cancerosas para análise a jusante:
- 13 dias após a semeadura de PBMC e 12 dias após câncer célula de semeadura, coloque a inserção em um prato novo.
- Parar de cultura de células de câncer com base nos quais a jusante análises devem ser executadas (ver discussão).
- No dia 14, pare de diferenciação osteoclasto e reparar as células, como relatado na etapa 1.15.
- Armadilha realizar coloração imediatamente ou no prazo de 14 a 30 dias.
Nota: Coloração opcional: para confirmar que a armadilha + polycarion células são os osteoclastos, pesquisadores podem realizar coloração adicional para detectar CTR, um marcador de osteoclast-específicos. A detecção de anéis de F-Actina é mais específico osteoclast coloração ensaio 12 , 13 , 14.
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Representative Results
Um método foi otimizado para diferenciar facilmente osteoclastos dos monócitos do sangue periférico humano. A cultura de monócitos foi cultivada com células cancerosas, confirmando (conforme descrito na literatura18) que as células cancerosas são capazes de sustentar osteoclastogenesis em metástases ósseas. Osteoclastos, diferenciadas das células cancerosas e GFs são mostrados na Figura 1. Uma célula tipo osteoclasto é uma célula com 4 ou mais núcleos e é positiva para a armadilha de coloração (células roxas). O limite aceito para o número de núcleos usados para definir um osteoclasto é 318, mas decidimos usar 4 para reduzir o risco de falsos positivos ao mínimo.
O modelo mostra que mama câncer células sustentada osteoclastogenesis porque o número de osteoclastos em poços induzidos por células cancerosas foi semelhante ao obtido no controle positivo (Figura 2). Como mostrado na Figura 2A, um número de células também diferenciadas espontaneamente em osteoclastos no controle negativo. A fim de confirmar a utilidade do modelo, o sistema foi desafiado com uma droga antitumor12,13. Osteoclast números eram superiores em condições de cultura co e amostras de controle positivo (CTR +) do que em amostras de controlo negativo (CTR-). Números de osteoclast diminuíram significativamente na presença da droga (everolimus) em condições de cultura co e controlos positivos (CTR +). O teste t foi utilizado para análises estatísticas. As células foram contadas em cada poço. A área de superfície no osteoclasto é uma característica de maturação e pode ser analisado usando software de código aberto como o ImageJ. Osteoclastos, derivados de GFs eram maiores do que aqueles induzidos por células cancerosas (Figura 2B). Tratamento com um medicamento antitumoral (everolimus) desligado os efeitos do GFs. O modelo forneceu informações úteis sobre o papel da droga em inibição de osteoclastogenesis. A Figura 2 mostra que osteoclastogenesis diminuiu na presença da droga. Estes resultados foram obtidos por co-culture induzida por osteoclastogenesis. Conforme explicado na seção de protocolo, uma série de outras análises a jusante pode ser realizada para investigar os mecanismos do crosstalk e/ou dos medicamentos analisados. O modelo resumido na Figura 3 é altamente versatileand pode ser usado para estudar o efeito de drogas em células de câncer, em especial, os osteoclastos.
Figura 1. Ensaio de Osteoclastogenesis. Células coradas após 14 dias na cultura. CTR-monócitos cultivados na ausência de fatores de crescimento; CTR + monócitos cultivados com fatores de crescimento RANKL e MCSF; COCO, osteoclastos obtidos por co cultivo de células do sangue com células cancerosas. Ampliação de 10x. Células osteoclasto eram células com pelo menos 4 núcleos que foram positivos para a armadilha (células roxas). As células foram quantificadas através da contagem das células em cada poço; realizaram-se 4 repetições para cada condição e foi calculada a média. Barra de escala é 400 µm. O zoom da imagem no painel inferior (100 X) ilustra a área de superfície de 2 osteoclastos (círculos vermelhos). As setas indicam núcleos osteoclast. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Efeito do everolimus em tratamento de osteoclastogenesis. (A) número de osteoclastos, de acordo com a presença ou ausência de uma droga; realizaram-se 4 repetições para cada condição. CTR-monócitos cultivados na ausência de fatores de crescimento; CTR + monócitos cultivados com fatores de crescimento RANKL e MCSF; COCO, osteoclastos obtidos por co cultivo de células do sangue com células cancerosas. Dados são expressos em média ± SE. Significância foi avaliada pelo teste-t; * p < 0,05. (B) Osteoclast superfície foi calculada pelo ImageJ software open source. Pelo menos 50 osteoclastos por condição foram medidos. CTR-monócitos cultivados na ausência de fatores de crescimento; CTR + monócitos cultivados com fatores de crescimento RANKL e MCSF; COCO, osteoclastos obtidos por co cultivo de células do sangue com células cancerosas. (C) as imagens das células após 14 dias na cultura, na ausência ou presença de uma droga antitumoral (everolimus). Ampliação de 10x; barra de escala é 400 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Modelo de cultura co. Esquema do modelo e dos seus possíveis análises a jusante e aplicações futuras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Modelos pré-clínicos em vitro estudando os mecanismos de interferência entre células cancerosas e células ósseas são necessários para identificar mecanismos de metástase óssea que pode ser usado para criar novas estratégias terapêuticas. Desenvolvemos um modelo totalmente humano em vitro de osteoclastogenesis de sangue periférico humano (Figura 3). Durante a otimização da metodologia, um número de pontos críticos foram identificado e resolvido. O primeiro diz respeito à quantidade de células mononucleares de semente. O número de células obtidas pela contagem de microscópio é apenas uma quantificação difícil, como é difícil discriminar entre linfócitos e monócitos, sendo este último as células alvo a semente para o experimento de osteoclastogenesis. Fomos capazes de identificar os monócitos linfócitos não aderem ao substrato plástico e, assim, a maioria foi eliminada com a primeira mudança do meio. As células foram semeadas em uma densidade elevada, como é essencial para as células para ser capaz de interagir uns com os outros para diferenciação, especialmente na segunda fase do osteoclastogenesis em que pre-osteoclastos precisam estar próximos um do outro para se fundem e tornam-se osteoclastos maduros. Uma outra dificuldade surge quando existem várias condições experimentais porque estes requerem um elevado número de células e uma grande quantidade de sangue. Uma possível solução é usar casacos buffy que têm uma alta concentração de PBMC, por exemplo, 4 x 105-6 x 106 células mononucleares normalmente são coletadas de uma amostra de buffy coat 50 mL em comparação com menos de 1 x 105 PBMCs coletados de um 20 mL de amostra de sangue.
Como foram colhidas amostras de sangue de voluntários diferentes, houve algum grau de variabilidade no ensaio de osteoclastogenesis. Assim, foi importante executar cada ensaio com pelo menos 3-4 repetições de técnicas. Réplicas biológicas também eram necessários e como diferentes doadores saudáveis foram usados, nós não normalmente calcula a média dos valores obtidos através das diferentes experiências. Nós assegurou que as tendências dos diferentes testes eram equivalentes e em seguida, escolheu um experimento de um dos doadores saudáveis para ser incluído no manuscrito.
Nosso modelo pré-clínicos envolve o cultivo co de monócitos, passando por diferenciação com células cancerosas. Como mostramos anteriormente, as células cancerosas também podem sustentar em vitro osteoclastogenesis12,13. Este sistema pode ser usado para testar drogas ou para investigar mecanismos de interação, como é possível realizar várias análises a jusante em ambas as células cancerosas e osteoclastos. Na verdade, é possível realizar ensaios de proliferação nas células cancerosas e gene expressão análises/Western blot os ensaios em ambos câncer células e osteoclastos13. Que iria ser de interesse para entender como secretadas proteínas diferem nas diferentes condições. Nosso modelo tem uma série de vantagens, ou seja, é um modelo totalmente humano que não é dependente na linha de celular murino, ao contrário de vários modelos relatados na literatura. O modelo também é bastante robusto e reprodutível e pode ser utilizado para outros fins. Por exemplo, outras linhas de células de câncer podem ser co cultivadas com osteoclastos e a diferença no seu poder de osteoclastogenic estudada. Além disso, este sistema pode ser usado para avaliar outros mecanismos fisiológicos ou patológicos para melhorar a nossa compreensão da biologia do osso e mediada por osteoclast doenças como a osteoporose. Outros tipos de citocinas e células também podem ser cultivados co juntamente com osteoclastos dependendo o objetivo do experimento.
Várias análises a jusante são possíveis com este modelo. É importante decidir durante a fase de concepção do estudo que serão realizadas análises para que um número adequado de poços pode ser propagado.
Ensaios a jusante com osteoclastos:
(i) análises de expressão de Gene. Plano de poços adicionais dos osteoclastos que extrair o RNA total, como os poços manchados para avaliação de armadilha não estão disponíveis para extração de RNA. (ii) Western blot análises. (iii) a quantificação da área de superfície do osteoclast. Tamanho osteoclasto é um parâmetro para a maturação de osteoclasto e pode ser quantificado usando software de código aberto como o ImageJ.
A jusante ensaios com células cancerosas:
(i) ensaios de proliferação tais como brometo de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium MTT. (ii) análises de expressão de Gene. (iii) Western blot análises.
Ensaios a jusante com osteoclastos e células cancerosas (co-cultura):
Como os osteoclastos e células cancerosas compartilham o mesmo meio de cultura, sua interação pode ser estudada com o ensaio de ELISA secretada de qual analyzesthe a secreção de citocinas específicas, GFs e outras proteínas.
O desenvolvimento deste modelo foi crucial para o nosso projeto e pretendemos melhorá-lo ainda mais no futuro próximo. Um grande passo em frente, seria diferenciar os monócitos em andaimes de colágeno mineralizado 3D para a matriz óssea imitar. Então seria possível avaliar diretamente a atividade do osteoclasto com um ensaio de reabsorção óssea. Como continuamos a aprender mais sobre o diversificado papel desempenhado pelos osteoclastos no processamento fisiológico e patológico que variam de remodelação óssea para regulação de metástases ósseas, nosso modelo permitirá que os investigadores a isolar e estudar osteoclastos in vitro .
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Disclosures
Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer Yibin Kang para fornecer a linha de celular SCP2 e Cristiano Verna para assistência editorial.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM | Euroclone | BE12-169F | |
| Glutamine | Life-technologies | ECB3000D | |
| Fetal bovine serum | Life-technologies | ECS0180DPR | |
| hMCSF | Peprotech | 300-25 | Storage indications must be respected |
| hRANKL | Peprotech | 310-01 | Storage indications must be respected |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma Aldrich | 387 A | |
| Lymphocyte separation media | Biowest | L0560-100 | |
| Red Blood cell lysing buffer | SIgma | 11814389001 ROCHE |
|
| Trypsin | EuroClone | COD. ECB3052D |
|
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | CRM-HTB-267 | |
| MCF7 | ATCC | HTB-22 | |
| Transwell | Corning | 3470-Clear | These inserts are for 24-well plates; 6.5 mm, 0.4 μM; pore size |
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