Summary
Этот протокол описывает развитие в vitro человека доклинических модели osteoclastogenesis от периферической крови моноциты, культивируемых с линии клеток рака молочной железы для имитации взаимодействия клеток остеокластов рака. Модель может использоваться для нашего понимания формирования метастазы костей и улучшать терапевтические возможности.
Abstract
Перекрестных помех между опухолевые клетки и клетки кость в кость микроокружения имеет решающее значение для понимания механизма формирования метастазов в кости. Мы разработали в vitro полностью человека доклинических модель совместного культуры клеток рака молочной железы и моноцитов, происходят дифференциация направлении остеокластов. Мы оптимизировали модель osteoclastogenesis, начиная от образца периферической крови, собранные из здоровых доноров. Мононуклеаров периферической крови (получения) были впервые разделенных плотность градиентного центрифугирования, семенами на высокой плотности и индуцированных дифференцировать путем добавления двух факторов роста (GFs): рецептор активатор ядерный фактор κB лиганда (RANKL) и макрофагов колониестимулирующий фактор (MCSF). Клетки были оставил в культуре на 14 дней и затем фиксированной и проанализированы по течению анализа. В кости литического метастазы одним из эффектов прибытия клеток рака в кости — индукция osteoclastogenesis. Мы таким образом под сомнение нашу модель с совместного культур клеток рака молочной железы для изучения дифференциации власть раковых клеток по СГФ. Простой способ изучения раковых клеток остеокластов взаимодействия является выполнение косвенные совместно культуры, основанной на использовании кондиционером среднего собраны из культур клеток рака молочной железы и смешивают с свежими среднего. Затем эта смесь используется для побудить дифференциации остеокластов. Мы также оптимизировали метод прямого совместного культуры, в которой рак клеток и претерпевает дифференцировки моноцитов среднего и обмена и секретируемые факторов. Это значительное улучшение по сравнению оригинальный метод косвенного Сопредседатель культуры как исследователи могут наблюдать взаимное взаимодействие типов двух клеток и вниз по течению анализ для раковых клеток и остеокласты. Этот метод позволяет нам изучить влияние препаратов на метастатическим кости микроокружения и семян клеточных линий, помимо тех, которые получены от рака молочной железы. Модель может также использоваться для изучения других заболеваний, таких как остеопороз или других условий, кости.
Introduction
Кости является общий сайт метастазов для различных типов первичных опухолей, таких как рак простаты, легких и молочной железы, с 20-25% пациентов развивающихся костных метастазов в течение болезни1,2,3. В частности 70% больных раком молочной железы несут доказательства костных метастазов в смерти4. Опухоли и стромальных клеток взаимодействия имеет важное значение для прогрессии рака в первичного рака и вторичные поражения. В кости микроокружения литического костных метастазов от рака молочной железы зависит создание патологический порочный круг, происходящих между раковые клетки, костные клетки и микроокружения кости. Раковые клетки нарушить баланс кости, увеличение костной резорбции5,6,7.
В нормальных и патологических условиях остеокласты являются клетки, ответственные за костной резорбции, тогда как остеобластов, в сдаче новой матрицы, отвечают за формирование новой кости8. Активность остеокластов регулируется остеобластов через выражение RANKL, которое связывается с рецептором ранга на поверхности предварительно остеокластов, вызывая предварительно остеокластов фьюжн, необходимый процесс для дифференциации в зрелых остеокластов. Индукции osteoclastogenesis увеличивает костную резорбцию. Большое количество в vivo исследований значительно улучшили наше понимание костных метастазов формирования9,10,11. Груди раковые клетки из первичной опухоли и в кости микроокружения возмущают кости гомеостаза, содействия osteoclastogenesis и костной резорбции8. В этом сценарии все молекулярного взаимодействия, которые происходят между раковые клетки и остеокласты имеют решающее значение. Как уже упоминалось механизм формирования метастазы костей выяснен в в естественных условиях моделей мышей. Однако помимо необходимости для утверждения всех в естественных условиях экспериментов на животных Комитетом по этике, существует ряд других недостатков для выполнения в естественных условиях экспериментов, включая высокие расходы и трудоемких методов. Несколько авторов объединили доклинических в vivo и in vitro модели osteoclastogenesis с помощью мышиных строки предварительно остеокластов, под названием RAW246.79,10,11. Недостатки этой модели проистекают из того факта, что клетки уже привержены становится предварительно остеокластов и не человеческого происхождения. По этим причинам трансляционного исследования значительно выиграют от наличия в vitro полностью человека доклинических моделей для изучения взаимодействия клеток рака кости.
Мы оптимизировали метод osteoclastogenesis в vitro начиная с периферической крови человека образцы12,13. Остеокласты вытекают из моноцитов, которые присутствуют, хотя и в малой степени, в периферической крови. Сначала мононуклеаров отделены от гранулоцитов в цельной крови и эритроцитах Ficoll градиент плотности; Затем они выбраны благодаря их способности соблюдать Пластиковые субстраты, в отличие от лимфоцитов. После посева, клетки культивируемых на 14 дней. GFs, моноциты необходимо дифференцировать сначала в макрофагов и затем остеокласты14,15MCSF и RANKL. MCSF необходима для всей продолжительности assay, тогда как RANKL используется для стимулирования процесса дифференцировки в поздних стадиях osteoclastogenesis. В ранней фазе дифференциации MCSF помогает моноциты размножаться и выжить14,15. В ходе второй части osteoclastogenesis клетки сливаются и зрелые как остеокласты, показывая характерное распределение актина F в кольца и выражая конкретных маркеры например тартрата стойкие кислой фосфатазы (ловушка) и кальцитонина рецептор (CTR) 14 , 15. наш метод состоит из добавления Моноцит культуры для первых 7 дней эксперимента и сочетание MCSF и RANKL MCSF от 7 до 14 дней. В конце эксперимента osteoclastogenesis анализируется путем подсчета дифференцированных клеток, как описано ниже.
Моноцит культур, индуцированной дифференцировать, GFs основой нашей доклинических модели. Мы оптимизировали систему совместного культуры без GFs лучше понять власть osteoclastogenic клеток рака молочной железы. Мы впервые разработал модель косвенного Сопредседатель культур, добавив средства (80% α-минимальным необходимым среднего (α-MEM) и 20% кондиционером среднего собранные от культуры клеток рака молочной железы что проходили около 90% притока к клеткам дифференциация12 . Кондиционерами среднего (не собираются в условиях лишений сыворотки) было собрано после 24 часов и смешивают с свежей среды в пропорции 1:4. Кондиционерами среднего индуцированной значительные остеокластов дифференциации в отношении отрицательного контроля. Однако как информация о взаимных взаимодействие между раковые клетки и клетки костной теряется при использовании косвенных Сопредседатель культур, мы улучшили нашу систему путем проведения прямого сотрудничества культур. Мы посеян раковые клетки в 0,4 мкм вставляет и помещали их в скважинах, где были покрытием мононуклеарных клеток. С помощью этого метода, клетки той же среде и обмена и секретируемые белки. Таким образом мы создали модель полностью человека доклинические osteoclastogenesis индуцированных раковых клеток13.
Эта система является чрезвычайно универсальны и могут использоваться для различных научно-исследовательских целей, например, в фармакологических исследований, изучение роли наркотиков в костных метастазов. Наша модель позволяет изучить эффективность и механизмы действия кости целевой терапии и/или противоопухолевых препаратов в кости микроокружения присутствии раковых клеток13. Проектирование экспериментов с правильного управления, т.е., раковые клетки и остеокласты, культивированный индивидуально, делает его легче понять влияние совместного культуры на активность препарата. Этот подход становится еще более интересным, когда препарат изучаются цели оба раковых клеток и остеокласты, например, эверолимус16. Эта модель также может использоваться для выявления новых путей взаимодействия между раковые клетки и клетки костной ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
человека остеокласты были дифференцированы от получения здоровых доноров, которые дал письменного информированного согласия на участие в исследовании. Протокол исследования был одобрен местного комитета этики, в соответствии с этическим нормам, установленным в Хельсинкской декларации 1964.
1. дифференциация остеокластов
Примечание: собирать периферической крови или Баффи пальто от здорового человека доноров в ЭДТА. Не используйте меньше чем 20 мл периферической крови. Баффи пальто предпочтительнее, потому что они имеют больше обилие мононуклеарных клеток. Выполните все следующие действия в стерильных культуры ткани капюшоном.
- ЭДТА, разбавьте цельную кровь 1:1 с 1 x фосфат амортизированное saline (PBS). Вновь приостановить хорошо.
- Слоя на лимфоцит разделения СМИ (кровь PBS: лимфоцитов разделения СМИ, 2:1) в тубах по 50 мл.
- Пипетка 30 мл крови разбавляют в PBS в 50 мл трубки.
- Нежно подложки 15 мл лимфоцитов разделения средств массовой информации в нижней части трубки 50-мл.
- Центрифуг в 757 × g 10 мин при комнатной температуре (без тормозов).
- Сбор мононуклеарных клеток:
- собирать белый слой мононуклеарных клеток с 5 мл пипетки без агитацию и поместить его в новый Тюбик 50 мл.
- Развести собранные репликацию с 20 мл PBS.
- Мытье репликацию:
- центрифуг в 225 x g 5 мин при комнатной температуре.
- Отказаться от супернатанта, инвертирование трубки. Повторить один раз.
- Лизис РБК:
Примечание: Если ячейка Пелле красный, лечить клетки с красных кровяных клеток лизировать буферного раствора (см. Таблицу материалы).- ,
- Положить Тюбик 50 мл на ДВС.
- Добавить 5 мл красных кровяных клеток лизировать буфер.
- Ждать 3-5 мин для завершения Лизис эритроцитов. Время варьируется в зависимости от степени загрязнения эритроцитов.
- Остановка реакции, добавив 20 мл PBS.
- Центрифуг на 225 x g 5 мин при комнатной температуре. Отказаться от супернатанта, инвертирование трубку.
Примечание: Необязательно: если РБК lysis, мыть получения, как описано ниже.
- Репликацию мыть:
- добавляют 20 мл PBS и центрифуги на 225 g x 5 мин при комнатной температуре.
- Отказаться от супернатанта, инвертирование трубку.
- Вновь приостановить клетки в полной α-MEM (дополненная 1% глютамина (начальной концентрации 100 X) и плода бычьим сывороточным 10%).
- Подсчитать количество ячеек с камерой Нойбауэр.
- Развести 1: 100 образцов в ледяной уксусной кислоте и использовать 10 мкл разбавлением для подсчета клеток.
- Рассчитывать по крайней мере дважды и вычислить среднее реплицирует получить общее среднее количество клеток собранных.
- Пластины клеток:
- плиты клетки в концентрации 750000 получения за см 2.
- Хранить покрытием клетки в инкубаторе при 37 ° C в атмосфере 5% CO 2.
Примечание: Дизайн эксперимент, чтобы включать негативные элементы управления, которые являются клетки, которые рассматриваются с нормальной полной α-MEM без MCSF или RANKL GFs. Помните выполнять каждое условие в по крайней мере 3 технические реплицирует. Выполнить по крайней мере 3 биологических реплицирует.
- Изменить среднего, дополнена GFs:
- ждать около 3 ч после заполнения ячеек и затем удалите средство, Пипетка (200-1000 мкл) отказаться от мусора, дно клетки и эритроцитах.
Примечание: Будьте осторожны при изменении среднего избежать мобильный отряд. - Добавить новый полный α-MEM дополнены 20 нг/мл MCSF (500 мкл/ну).
Примечание: При совместном культивировании с раковых клеток, семя рак клеток на следующий день после посева КСДОР.
- ждать около 3 ч после заполнения ячеек и затем удалите средство, Пипетка (200-1000 мкл) отказаться от мусора, дно клетки и эритроцитах.
- Изменить СМИ каждые 2-3 дня (α-MEM дополнены 20 нг/мл MCSF):
- отказаться от среднего, 200-1000 мкл пипетки.
- Добавить новые свежие среднего по 200-1000 мкл пипетки.
- 6-7 дней после посева клеток, добавить 20 нг/мл RANKL полный α-MEM + MCSF.
- Изменить среднего (полного α-MEM + MCSF + RANKL) каждые 2-3 дня:
- отбросить в среду с 200-1000 мкл пипетки.
- Добавить новое средство с 200-1000 мкл пипетки. Остановить индукции дифференцировки 14 дней после посева клеток.
- Среднего отклонения и мыть дважды с PBS.
- Исправить клетки с параформальдегида:
- оставить клетки сушиться.
- Добавить параформальдегида 4% (см. Таблицу материалы).
- Инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре.
- Отменить параформальдегида и мыть два раза с 500 мкл PBS.
Предупреждение: Параформальдегида токсичен; Пожалуйста, носите перчатки, маску и очки. - Позволяют клеткам сушиться.
- Выполнения ТРЕППИНГА окрашивания по заявлению производителя ' s инструкции (см. Таблицу материалы).
- Граф остеокластов подобных клеток вручную под микроскопом на увеличение 10 X; NA 0,30.
Примечание: Остеокластов как клетки определяются как ловушка + polycarion клетки с по крайней мере 4 ядра.
2. Культуры клеток рака
Примечание: эксперименты могут быть выполнены с различными типами линий клеток молочной железы аденокарцинома например SCP2 17, остеотропные клеточной линии, возникая от тройной негативного человека линии клетки рака молочной железы (MDA-MB-231) и гормональные рецептор положительным клеточная линия MCF7.
- Культуры клетки как монослоя в 75-cm 2 фляги.
- Семя 1,000,000 раковые клетки в колбе 75см 2.
- Хранить клетки при 37 ° C в среде полного α-MEM, дополнен с 1% глютамина и 10% плода бычьим сывороточным в атмосфере 5% CO 2.
- Отсоединить клетки на confluency около 90%:
- отказаться от среднего, мыть с PBS и добавить 2-3 мл трипсина 1 X в PBS.
- Инкубации клеток для 3-5 минут при 37 ° с.
- Собирать отдельные клетки от 75-cm 2 фляги, 10 мл пипетки, добавление 8 мл полной среды остановить ферментативной реакции.
- Центрифуга на 225 g x 5 мин
- Мыть раковые клетки:
- добавляют 10 мл PBS.
- Центрифуга на 600 g x 5 мин
- Количество раковых клеток с камерой Нойбауэр.
- По крайней мере дважды количество раковых клеток и вычислить среднее реплицирует получить общее среднее количество клеток собранных.
3. Прямое сотрудничество культур раковых клеток nd претерпевает дифференцировки моноцитов к остеокласты
- семян раковые клетки на вставок (поры диаметром 0,4 мкм):
- семя раковые клетки в концентрации 4000 клеток / см 2.
- Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO 2.
Примечание: Семя рак клеток на следующий день после посева КСДОР для совместного культуру эксперимента в 0,4 мкм пластины.
- Ждать 24 часа позволить клетки присоединиться.
- Место в сеяный вставить культуры над мононуклеарных культур для начала совместного культуры (см. раздел 1.10 протокола).
- Изменить СМИ каждые 2-3 дней с полным α-MEM.
- Отбросить в среду с 200-1000 мкл пипетки.
- Добавить 500 мкл свежих средних.
Примечание: Основная цель совместного культуры является понять osteoclastogenic власть раковых клеток, таким образом, СГФ не добавляются в α-MEM. В каждом эксперименте Сопредседатель культуры включают negative (см. Примечание в шаге 1.10 протокола) и позитивные элементы управления остеокластов, дифференцированных по RANKL и MCSF (раковые клетки). Раковые клетки посеян в вставки не помещен над мононуклеаров используются как отрицательный контроль совместного культуры.
- Остановить совместное культуры и использовать раковые клетки для течению анализа:
- 13 дней после посева КСДОР и 12 дней после посева клеток рака, место вставки на новой пластинкой.
- Остановить культуры клеток рака, на основе которого течению анализы должны выполняться (см. обсуждение).
- На 14 день, остановить дифференциацию остеокластов и исправить клетки, как сообщалось в шаге 1.15.
- Ловушки, выполняют окрашивание немедленно или в течение 14-30 дней.
Примечание: Дополнительный окрашивание: для подтверждения, что ловушка + polycarion клетки, остеокласты, исследователи могут выполнять дополнительные окрашивания для обнаружения CTR, остеокластов специфических маркеров. Обнаружение F-актина кольца это еще остеокластов конкретных окрашивание пробирного 12 , 13 , 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Метод был оптимизирован для легко дифференцировать остеокласты от моноцитов в периферической крови человека. Моноцит культуры был культивируемых с раковых клеток, подтверждающий (как описано в литературе18), что раковые клетки способны выдержать osteoclastogenesis в костных метастазов. Остеокласты продифференцировано от раковых клеток и GFs показаны на рисунке 1. Остеокластов как ячейка представляет собой ячейку с 4 или больше ядер и является положительным для ловушки, окрашивание (фиолетовый клетки). Признанных отсечения на количество ядер, используемых для определения остеокластов является 318, но мы решили использовать 4 для снижения риска ложных срабатываний до минимума.
Модель показывает что груди рак клеток устойчивого osteoclastogenesis, потому что число остеокластов в скважинах, индуцированных раковых клеток был похож на получения в положительный контроль (рис. 2). Как показано на рисунке 2А, количество клеток также дифференцированы спонтанно в остеокласты в отрицательного контроля. Для того, чтобы подтвердить полезность модели, система была оспорена с противоопухолевых лекарств12,13. Остеокластов цифры были выше в условиях культуры сотрудничества и позитивного управления (CTR +) образцы чем в пробах отрицательный контроль (CTR-). Число остеокластов значительно сократилось в присутствии препарата (эверолимус) в условиях совместного культуры и позитивные элементы (CTR +). T тест был использован для статистического анализа. Клетки были подсчитаны в каждом хорошо. Поверхности тыс.га остеокластов характерно для созревания и могут быть проанализированы с использованием открытого программного обеспечения таких как ImageJ. Остеокласты, производные от GFs были больше, чем те индуцированных раковых клеток (рис. 2B). Лечение противоопухолевых лекарств (эверолимус) отключены эффекты СГФ. Модель предоставляет полезную информацию о роли препарата в osteoclastogenesis ингибирования. Рисунок 2 c показывает, что osteoclastogenesis сократилось в присутствии препарата. Эти результаты были получены путем co-culture-индуцированной osteoclastogenesis. Как объясняется в разделе протокол, ряд других течению анализов может выполняться для изучения механизмов перекрестных помех и/или проанализированы наркотиков. Модель, обобщены в рисунке 3 является весьма versatileand может использоваться для изучения влияния наркотиков на раковые клетки, в частности, остеокласты.
Рисунок 1. Пробирная Osteoclastogenesis. Клетки витражи после 14 дней в культуре. CTR-моноцитов, культивируемых в отсутствие факторов роста; CTR + моноциты, культивируемых с RANKL и MCSF факторов роста; Коко, остеокласты, полученные путем совместного культивирования клеток крови с раковых клеток. 10 крат. Остеокластов как клетки являются клетки с по крайней мере 4 ядра, которые были позитивными в ЛОВУШКУ (фиолетовый клетки). Клетки были количественно путем подсчета клеток в каждой скважине; 4 репликация для каждого условия были выполнены и было рассчитано среднее. Линейки шкалы составляет 400 мкм. Масштаб изображения в нижней панели (100 X) иллюстрирует площадь поверхности 2 остеокласты (красные круги). Стрелки указывают остеокластов ядер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Влияние эверолимус на лечение osteoclastogenesis. (A) число остеокластов согласно наличие/отсутствие наркотиков; были выполнены 4 репликация для каждого условия. CTR-моноцитов, культивируемых в отсутствие факторов роста; CTR + моноциты, культивируемых с RANKL и MCSF факторов роста; Коко, остеокласты, полученные путем совместного культивирования клеток крови с раковых клеток. Данные выражаются как среднее ± SE. Значимость была оценена t теста; * p < 0,05. (B) остеокластов, площадь поверхности была рассчитана путем ImageJ открытым исходным кодом. По крайней мере 50 остеокласты за состояние были измерены. CTR-моноцитов, культивируемых в отсутствие факторов роста; CTR + моноциты, культивируемых с RANKL и MCSF факторов роста; Коко, остеокласты, полученные путем совместного культивирования клеток крови с раковых клеток. (C) изображения клеток после 14 дней в культуре в отсутствие или наличие противоопухолевых лекарств (эверолимус). 10 крат; шкалы бар-400 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Модель совместного культуры. Схема модели и ее возможные течению анализы и будущих приложений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Доклинические в vitro модели изучения механизмов перекрестных помех между раковые клетки и клетки костей необходимы для выявления механизмов костных метастазов, который может использоваться для создания новых терапевтических стратегий. Мы разработали модель полностью человека в пробирке osteoclastogenesis из периферической крови человека (рис. 3). Во время оптимизации методологии ряд критических точек были выявлены и решены. Первый касается количества мононуклеарных клеток семян. Количество клеток, полученные путем подсчета микроскопа является только грубый количественной оценки, как это трудно различать лимфоцитов и моноцитов, причем последний клеток-мишеней для семян для эксперимента osteoclastogenesis. Мы смогли определить моноцитов, потому что лимфоциты не придерживаться пластиковой подложки и таким образом большинство было ликвидировано в первое изменение среды. Клетки были посеяны на высокой плотности, как важно для ячеек иметь возможность взаимодействовать друг с другом для дифференциации, особенно на втором этапе osteoclastogenesis, в котором предварительно остеокласты должны быть близко друг к другу, чтобы предохранитель и стать Зрелые остеокластов. Еще одна трудность возникает тогда, когда есть несколько экспериментальных условиях, потому что они требуют большое количество клеток и большое количество крови. Одним из возможных решений заключается в использовании Баффи пальто, которые имеют высокую концентрацию получения, например, 4 x 105-6 x 106 мононуклеарных клеток обычно собираются из образца Баффи пальто 50 мл, по сравнению с менее чем 1 x 105 репликацию, собранных из 20 мл крови.
Как образцы крови были собраны из разных добровольцев, был некоторую степень изменчивости в osteoclastogenesis assay. Поэтому важно выполнять калибровочных с технической реплицирует по крайней мере 3-4. Необходимы также биологические реплицирует и как использовались различные здоровых доноров, мы не обычно вычислить среднее значений, полученных путем различных экспериментов. Мы обеспечили, что тенденции различные тесты были эквивалентны и затем выбрал один эксперимент от одного из здоровых доноров должны быть включены в рукописи.
Наши доклинические модель включает совместного культивирования моноцитов, происходят дифференциация с раковых клеток. Как мы ранее показали, раковые клетки могут также поддерживать в пробирке osteoclastogenesis12,13. Эта система может использоваться для проверки наркотиков или для изучения механизмов взаимодействия, как это можно выполнить несколько ниже по течению анализы на раковые клетки и остеокласты. В самом деле это возможно для выполнения распространения анализов на раковые клетки и гена выражение анализы/Западная помарка анализов на оба раковых клеток и остеокласты13. Он будет быть интерес понять как секретируемые белки отличаются в различных условиях. Наша модель имеет ряд преимуществ, то есть, это полностью человека модель, которая не зависит от мышиных клеточных линий, в отличие от несколько моделей, о которых сообщалось в литературе. Модель также достаточно надежных и воспроизводимых и может использоваться для других целей. Например другие линии клетки рака может быть совместно культивируемых с остеокластов и различия в их власти osteoclastogenic изучал. Кроме того эта система может использоваться для оценки других физиологических и патологических механизмов для улучшения нашего понимания биологии костей и остеокластов опосредованной заболеваний, таких как остеопороз. Другие типы цитокинов и клетки также может быть совместно культивируемых вместе с остеокласты в зависимости от цели эксперимента.
Несколько ниже по течению анализы возможны с этой моделью. Важно решить на этапе проектирования, исследования, что анализ будет осуществляться таким образом, чтобы достаточное количество скважин может быть заполнена.
Вниз по течению анализов с остеокласты:
(i) ген выражение анализы. План дополнительных скважин остеокластов для извлечения всего РНК, как колодцы, витражи для оценки ловушка не доступны для извлечение RNA. (ii) Вестерн-блот анализ. (iii) количественная оценка площади поверхности остеокластов. Размер остеокластов является параметром для созревания остеокластов и может быть определена количественно с помощью таких ImageJ с открытым исходным кодом.
Вниз по течению анализов с раковые клетки:
(i) распространение анализы как 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium бромид МТТ. (ii) ген выражение анализы. (iii) Вестерн-блот анализ.
Вниз по течению анализов с остеокластов и раковые клетки (сопредседатель культура):
Как раковые клетки и остеокласты долю той же среде культуры, их взаимодействия могут быть изучены с ELISA assay который analyzesthe секрецию определенных цитокинов, GFs и других выделяется белков.
Развитие этой модели имеет решающее значение для нашего проекта, и мы планируем дальнейшего повышения в ближайшем будущем. Крупным шагом вперед было бы дифференцировать моноцитов в 3D минерализованных коллаген подмостей мимических кости матрицу. Затем можно было бы непосредственно оценить активность остеокластов с assay резорбции кости. Как мы по-прежнему узнать больше о различных ролях, сыграл остеокласты в физиологических и патологических обработки начиная от костного ремоделирования регулирования метастазы в кости, наша модель позволит исследователям изолировать и изучения остеокласты в пробирке .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Ибинь Кан для обеспечения линии клеток SCP2 и Кристиано Verna для редакционной помощи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM | Euroclone | BE12-169F | |
| Glutamine | Life-technologies | ECB3000D | |
| Fetal bovine serum | Life-technologies | ECS0180DPR | |
| hMCSF | Peprotech | 300-25 | Storage indications must be respected |
| hRANKL | Peprotech | 310-01 | Storage indications must be respected |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma Aldrich | 387 A | |
| Lymphocyte separation media | Biowest | L0560-100 | |
| Red Blood cell lysing buffer | SIgma | 11814389001 ROCHE |
|
| Trypsin | EuroClone | COD. ECB3052D |
|
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | CRM-HTB-267 | |
| MCF7 | ATCC | HTB-22 | |
| Transwell | Corning | 3470-Clear | These inserts are for 24-well plates; 6.5 mm, 0.4 μM; pore size |
References
- Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. Bone and cancer: the osteoncology. Clin Cases Miner Bone Metab. 10 (2), 121-123 (2013).
- Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. Br J Cancer. 55 (1), 61-66 (1987).
- Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. A new emergency in oncology: bone metastases in breast cancer patients. Oncol Lett. 6 (2), 306-310 (2013).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Cancer Res. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Roodman, G. D. Mechanisms of bone metastasis. N Eng J Med. 350 (12), 1655-1664 (2004).
- Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7 (11), 1285-1297 (2011).
- Chen, Y. C., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. Breast cancer metastasis to the bone: mechanisms of bone loss. Breast Cancer Res. 12 (6), 215 (2010).
- Guise, T. A. Breast cancer bone metastases: it's all about the neighborhood. Cell. 154 (5), 957-959 (2013).
- Ell, B., et al. Tumor-induced osteoclast miRNA changes as regulators and biomarkers of osteolytic bonemetastasis. Cancer Cell. 24 (4), 542-556 (2013).
- Lu, X., et al. VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging α4β1-positive osteoclast progenitors. Cancer Cell. 20 (6), 701-714 (2011).
- Wang, H., et al. The osteogenic niche promotes early-stage bone colonization of disseminated breast cancer cells. Cancer Cell. 27 (2), 193-210 (2015).
- Liverani, C., et al. CSF-1 blockade impairs breast cancer osteoclastogenic potential in co-culture systems. Bone. 66, 214-222 (2014).
- Mercatali, L., et al. The effect of everolimus in an in vitro model of triple negative breast cancer and osteoclasts. Int J Mol Sci. 1 (11), e1827 (2016).
- Glantschnig, H., Fisher, J. E., Wesolowski, G., Rodan, G. A., Reszka, A. A. M-CSF, TNFalpha and RANK ligand promote osteoclast survival by signaling through mTOR/S6 kinase. Cell DeathDiffer. 10 (10), 1165-1177 (2003).
- Sugatani, T., Hruska, K. A. Akt1/Akt2 and mammalian target of rapamycin/Bim play critical roles in osteoclast differentiation and survival, respectively, whereas Akt is dispensable for cell survival in isolated osteoclast precursors. J Biol Chem. 280 (5), 3583-3589 (2005).
- Bertoldo, F., et al. Targeting bone metastatic cancer: role of the mTOR pathway. Biochim Biophys Acta. 1845 (2), 248-254 (2014).
- Kang, Y., Siegel, P. M., Shu, W., Drobnjak, M., Kakonen, S. M., Cordón-Cardo, C., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
- Simone, V., Ciavarella, S., Brunetti, O., Savonarola, A., Cives, M., Tucci, M. Everolimus restrains the paracrine pro-osteoclast activity of breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (15), 692 (2015).
