Summary
Det här protokollet beskriver utveckling av ett in vitro- human preklinisk modell av osteoclastogenesis från perifert blod monocyter odlade med bröst cancer cellinjer att efterlikna cancer cell-osteoclast interaktionen. Modellen skulle kunna användas till ytterligare vår förståelse av metastaser benbildning och förbättra terapeutiska alternativ.
Abstract
Överhörning mellan tumörceller och benceller i det ben närmiljön är avgörande för att förstå mekanismen av metastaser benbildning. Vi utvecklat en in vitro- fullt humana preklinisk modell av en samtidig kultur av bröstcancer cancerceller och monocyter som genomgår differentiering mot osteoklaster. Vi har optimerat en modell av osteoclastogenesis från ett urval av perifert blod som samlats in från friska donatorer. Perifera mononukleära blodceller (PBMC) först skildes genom täthet lutning centrifugering, seedade på en hög densitet och inducerad att skilja genom att lägga till två tillväxtfaktorer (GFs): receptor activator av nuclear factor-κB ligand (RANKL) och makrofag granulocytkolonistimulerande faktor (MCSF). Cellerna var kvar i kultur i 14 dagar och sedan fasta och analyseras av efterföljande analys. En av effekterna av cancer cell ankomst i ben är osteolytiska metastaser, induktion av osteoclastogenesis. Vi utmanas således vår modell med samtidig kulturer av bröstcancer cancerceller att studera differentiering kraften i cancerceller med avseende på GFs. Ett enkelt sätt att studera cancer cell-osteoclast interaktion är att utföra indirekta samtidig kulturer baserat på användningen av luftkonditionering medium samlas in från breast cancer cellkulturer och blandas med färskt medium. Denna blandning används sedan för att inducera osteoclast differentiering. Vi har också optimerat en metod för direkt samarbete kultur i vilken cancer celler och monocyter som genomgår differentiering dela medium och utbyta utsöndrade faktorer. Detta är en betydande förbättring över den ursprungliga indirekta samtidig kultur-metoden som forskare kan iaktta ömsesidiga växelverkan mellan de två celltyper och utföra efterföljande analyser för både cancerceller och osteoklaster. Denna metod gör det möjligt för oss att studera effekten av läkemedel på den benmetastaser närmiljön och utsäde cellinjer än de som härrör från bröstcancer. Modellen kan också användas för att studera andra sjukdomar såsom osteoporos eller andra ben villkor.
Introduction
Ben är en vanlig plats för metastaser för olika typer av primära tumörer såsom prostata-, lung- och bröstcancer cancer, med 20-25% av patienterna utveckla skelettmetastaser under sjukdom1,2,3. 70% av patienter med bröstcancer bär särskilt bevis för skelettmetastaser vid död4. Tumör- och stromal interaktion är viktig för cancer progression i både primär cancer och sekundära lesioner. I den ben mikromiljö beror osteolytiska skelettmetastaser från bröstcancer på etableringen av en patologisk ond cirkel uppstår mellan cancerceller, benceller och den ben mikromiljö. Cancerceller störa ben balans, öka benresorption5,6,7.
I normala och patologiska förhållanden är osteoklaster cellerna som är ansvariga för benresorption, osteoblaster, i sätta in ny matris, är ansvariga för nytt Ben bildas8. Aktiviteten hos osteoklasterna regleras av osteoblaster genom uttrycket av RANKL, som binder till sin receptor RANK på före osteoclast ytan, förmå före osteoclast fusion, en nödvändig process för differentiering in mogna osteoklaster. Induktion av osteoclastogenesis ökar benresorption. Ett stort antal in-vivo studier har avsevärt förbättrat vår förståelse av ben metastaser bildning9,10,11. Bröstcancerceller från den primära tumören och i de ben mikromiljö stör ben homeostas, främja osteoclastogenesis och ben resorption8. I det här fallet är alla molekylära interaktioner som sker mellan cancerceller och osteoklaster av avgörande betydelse. Som redan nämnts, har mekanismen av metastaser benbildning klargjorts i i vivo möss-modeller. Förutom behovet för godkännande av alla i vivo våra djurförsök av etikkommitté finns det dock flera andra nackdelar att utföra i vivo experiment inklusive höga kostnader och tidskrävande metoder. Flera författare har kombinerat prekliniska i vivo och in vitro- modeller av osteoclastogenesis med hjälp av en murin före osteoklaster kallas RAW246.79,10,11. Nackdelarna med denna modell härrör från det faktum att cellerna har redan åtagit sig att bli pre osteoklaster inte och av mänskligt ursprung. Av dessa skäl kunde translationell forskning stor nytta tillgängligheten av in vitro- fullt mänskliga prekliniska modeller att studera ben cancer cell interaktioner.
Vi har optimerat en metod av osteoclastogenesis in vitro- som start från perifert blod prover12,13. Osteoklaster är framgår av monocyter, som är närvarande, om än i liten utsträckning, i perifert blodprover. Mononukleära celler separeras först från erytrocyter och granulocyter i helblod av Ficoll täthetlutning; de väljs sedan tack vare sin förmåga att hålla sig till plast substrat, till skillnad från lymfocyter. Efter sådd, odlas celler i 14 dagar. MCSF och RANKL är GF krävs av monocyter att skilja först i makrofager och sedan till osteoklaster14,15. MCSF behövs för hela analysen, medan RANKL används för att framkalla differentiering processen i sena stadier av osteoclastogenesis. I den tidiga fasen av differentiering hjälper MCSF monocyter föröka sig och överleva14,15. Under den andra delen av osteoclastogenesis, celler smälter samman och mogna som osteoklasterna, visar karakteristiska fördelningen av aktin F i ringar och uttrycker specifika markörer såsom tartrat-resistenta syra fosfatas (TRAP) och kalcitonin receptor (CTR) 14 , 15. vår metod består i att lägga till MCSF till monocyt kulturen under de första 7 dagarna av experimentet och en kombination av MCSF och RANKL från dag 7 till 14. Vid slutet av experimentet analyseras osteoclastogenesis genom att räkna de differentierade cellerna, enligt nedan.
Monocyt kulturerna inducerad att skilja av GFs utgör grunden för vår preklinisk modell. Vi har optimerat en samtidig kultur system utan GFs att bättre förstå osteoclastogenic kraften av bröstcancerceller. Vi först utvecklades en modell av indirekta samtidig kulturer genom att lägga till ett medium (80% α-väsentliga minimalmedium (α-MEM) och 20% luftkonditionerade medium samlas in från en kultur av bröstcancer cancerceller att var ca 90% konfluenta celler genomgår differentiering12 . Konditionerat medium (inte samlas in serum deprivation villkor) samlades efter 24 timmar och blandas med färskt medium på en andel av 1:4. Det luftkonditionerade mediet inducerad betydande osteoclast differentiering med avseende på den negativa kontrollen. Dock som informationen på det ömsesidiga samspelet mellan cancerceller och benceller bryts när använda indirekta samtidig kulturer, förbättrat vi vårt system genom att utföra direkt samtidig kulturer. Vi seedade cancerceller i 0,4 µM infogar och placerade dem i brunnar där mononukleära celler var klädd. Med den här metoden celler dela samma medium och utbyta utsöndrade proteiner. Vi har därför skapat en helt human preklinisk modell av osteoclastogenesis framkallas genom cancer celler13.
Detta system är extremt mångsidig och kan användas för olika forskningsändamål, t.ex., i farmakologiska studier som undersöker rollen av droger i skelettmetastaser. Vår modell gör det möjligt att studera effekt och verkningsmekanismer av ben-riktade terapier eller antitumöreffekt droger i den ben närmiljön i närvaro av cancer celler13. Utformar experimenten med rätt kontroller, gör dvs, cancerceller och osteoklaster odlade individuellt, det lättare att förstå effekterna av samtidig kultur på drogen aktivitet. Detta tillvägagångssätt blir ännu mer intressant när drogen studeras mål både cancer celler och osteoklaster, t.ex., everolimus16. Denna modell kan också användas för att identifiera nya vägar av samspelet mellan cancerceller och benceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
mänskliga osteoklaster var åtskilt från PBMC av friska donatorer som gav skriftligt informerat samtycke att delta i studien. Studieprotokollet godkändes av den lokala etiska kommittén, i enlighet med de etiska normer som fastställs i 1964 Helsingforsdeklarationen.
1. osteoclast differentiering
Obs: samla perifert blod eller buffy rockar från friska mänskliga donatorer i EDTA. Använd inte mindre än 20 mL av perifert blod. Buffy rockar är att föredra eftersom de har en större förekomst av mononukleära celler. Utför alla följande steg i en steril vävnadsodling huva.
- Späd EDTA helblod 1:1 med 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Återsuspendering väl.
- Lager på lymfocyter separation media (blod PBS: lymfocyter separation media, 2:1) i 50 mL rör.
- Pipettera 30 mL blod utspätt i PBS i en 50 mL tub.
- Försiktigt underfång 15 mL av lymfocyter separation media i botten av röret 50 mL.
- Centrifugera vid 757 × g under 10 minuter vid rumstemperatur (inga bromsar).
- Samlar de mononukleära cellerna:
- samla vita lagret av mononukleära celler med 5 mL pipett utan omskakning och placera den i en ny 50 mL tub.
- Späd de insamlade PBMC med 20 mL PBS.
- Tvätt PBMC:
- Centrifugera vid 225 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
- Kassera supernatanten genom att invertera röret. Upprepa en gång.
- RBC lysis:
Obs: cellpelleten är röd, behandla celler med röda blodkroppar lyseringslösning buffertlösning (se Tabell för material).- Sätta 50 mL röret på ice.
- Tillsätt 5 mL av röda blodkroppar lyseringslösning buffert.
- Vänta 3-5 min för att slutföra erytrocyt Lys. Tiden varierar med graden av erytrocyt förorening.
- Stoppa reaktionen genom tillsats av 20 mL PBS.
- Centrifug på 225 x g under 5 minuter i rumstemperatur. Kassera supernatanten genom att vända tuben.
Obs: Tillval: om RBC Lys utförs, tvätta PBMC enligt beskrivningen nedan.
- Tvätta PBMC:
- Tillsätt 20 mL PBS och centrifugera vid 225 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
- Kasta bort supernatanten genom att vända tuben.
- Slamma upp cellerna i komplett α-MEM (kompletteras med 1% glutamin (initial koncentration 100 X) och 10% fetalt bovint serum).
- Räkna cellerna med en Neubauer kammare.
- Späd den prov 1: 100 i isättika och använda 10 µL av utspädning för att räkna celler.
- Räkna minst två gånger och beräkna medelvärdet av replikerar att få det totala genomsnittliga antalet celler insamlade.
- Platta celler:
- platta celler vid en koncentration på 750.000 PBMC per cm 2.
- Lagra guldpläterade celler i en inkubator vid 37 ° C i en 5% CO 2 atmosfär.
Obs: Design experimentet att inkludera negativa kontroller, vilka är celler som behandlas med normal komplett α-MEM utan MCSF eller RANKL GFs. kom ihåg att utföra varje villkor i minst 3 tekniska replikerar. Utför minst 3 biologiska replikat.
- Ändra det medium som kompletteras med GFs:
- vänta ca 3 h efter den cell sådd och ta sedan bort medlet med pipett (200-1000 µL) att kasta skräp, obundna celler och erytrocyter.
Var försiktig när du ändrar mediet för att undvika cell avlossning. - Lägg till ny komplett α-MEM kompletteras med 20 ng/mL MCSF (500 µL per brunn).
Obs: När samtidig odling med cancerceller, utsäde cancer cells dagen efter den PBMC sådd.
- vänta ca 3 h efter den cell sådd och ta sedan bort medlet med pipett (200-1000 µL) att kasta skräp, obundna celler och erytrocyter.
- Ändra media varje 2-3 dagar (α-MEM kompletteras med 20 ng/mL MCSF):
- kasta medlet med en 200-1000 µL pipett.
- Lägg till nytt färskt medium med en 200-1000 µL pipett.
- 6-7 dagar efter cell sådd, lägga till 20 ng/mL av RANKL komplett α-MEM + MCSF.
- Ändra mediet (komplett α-MEM + MCSF + RANKL) varje 2-3 dagar:
- kasta medlet med 200-1000 µL pipett.
- Lägg till nytt medium med 200-1000 µL pipett. Stoppa induktion av differentiering 14 dagar efter cell sådd.
- Släng medium och tvätta två gånger med PBS.
- Fixa celler med PARAFORMALDEHYD:
- lämna celler torka.
- Lägga till 4% PARAFORMALDEHYD (se Tabell för material).
- Inkubera i 20 min i rumstemperatur.
- Kasta PARAFORMALDEHYD och tvätta två gånger med 500 µL av PBS.
Varning: PARAFORMALDEHYD är giftiga; Vänligen Använd skyddshandskar, mask och glasögon. - Tillåta celler torka.
- Utför TRAP färgning enligt tillverkaren ' anvisningar (se Tabell för material).
- Räkna osteoclast-liknande celler manuellt under lupp förstoring 10 X; NA 0,30.
Obs: Osteoclast-liknande celler definieras som fälla + polycarion celler med minst 4 kärnor.
2. Cancer Cell Cultures
Obs: experiment kan utföras med olika typer av bröstcancer adenocarcinom cell linjer såsom SCP2 17, en osteotropic cell fodrar med ursprung från den tredubbla negativa mänskliga Breast cancer cellinje (MDA-MB-231) och den hormonella hormonreceptorpositiv cellinje MCF7.
- Odla cellerna som en enskiktslager i 75-cm 2 kolvar.
- Utsäde 1.000.000 cancerceller i en 75 cm 2 kolv.
- Lagra cellerna vid 37 ° C i komplett α-MEM medium kompletteras med 1% glutamin och 10% fetalt bovint serum i en 5% CO 2 atmosfär.
- Lossa cellerna på en konfluens av ca 90%:
- kasta medlet, tvätta med PBS och tillsätt 2-3 mL av trypsin 1 X i PBS.
- Inkubera cellerna under 3-5 minuter vid 37 ° C.
- Samla in fristående cellerna från 75 cm 2 kolven genom 10 mL pipett att tillsätta 8 mL av komplett medium att stoppa enzymatisk reaktion.
- Centrifugera vid 225 x g i 5 min.
- Tvätta cancercellerna:
- tillsätt 10 mL PBS.
- Centrifugera vid 600 x g i 5 min.
- Räkna cancerceller med en Neubauer kammare.
- Räkna cancerceller minst två gånger och beräkna medelvärdet av replikerar att få det totala genomsnittliga antalet celler insamlade.
3. Direkt samtidig kulturer av cancerceller en nd monocyter som genomgår differentiering mot osteoklaster
- utsäde cancercellerna på skären (por diameter 0,4 µm):
- utsäde cancercellerna vid en koncentration av 4 000 celler per cm 2.
- Inkubera vid 37 ° C och 5% CO 2.
Obs: Utsäde cancer cells dagen efter PBMC seedning för samtidig kultur experimentet i 0,4 µm skär.
- Vänta 24 h så att cellerna att följa.
- Place de seedade infoga kultur över mononukleära kulturerna att starta samtidig kulturen (se avsnitt 1.10 i protokollet).
- Ändra media varje 2-3 dagar med komplett α-MEM.
- Kasta medlet med 200-1000 µL pipett.
- Lägga till 500 µL av färskt medium.
Obs: Det primära syftet med samtidig kulturen är att förstå osteoclastogenic kraften av cancerceller, därför, GF läggs inte till α-MEM. I varje experiment av samtidig kultur inkludera neundersökande kontroller (se anmärkning i steg 1.10 i protokollet) och positiva kontroller av osteoklaster differentierade av RANKL och MCSF (inga cancerceller). Cancerceller som seedade i skären inte placeras över mononukleära celler används som en negativ kontroll av samtidig kultur.
- Stoppa samtidig kulturen och använda cancerceller för efterföljande analys:
- 13 dagar efter PBMC sådd och 12 dagar efter cancer cell sådd, placera insatsen på en ny platta.
- Stoppa cancer cellkultur som är nedströms analyser ska utföras (se diskussionen).
- På dag 14, stoppa osteoclast differentiering och fixa celler, som rapporterats i steg 1.15.
- Utför TRAP färgning omedelbart eller inom 14-30 dagar.
Obs: Valfria färgning: för att bekräfta att fälla + polycarion cellerna osteoklaster, forskare kan utföra ytterligare färgning för att upptäcka CTR, en osteoclast-specifik markör. Påvisande av F-aktin ringar är en annan osteoclast-specifik färgning assay 12 , 13 , 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En metod var optimerad för att enkelt skilja osteoklaster från perifert blod monocyter. Monocyt kulturen var odlade med cancerceller, bekräftar (som beskrivs i litteraturen18) att cancerceller klarar av att upprätthålla osteoclastogenesis i skelettmetastaser. Osteoklaster åtskilt från cancerceller och GFs visas i figur 1. En osteoclast-liknande cell är en cell med 4 eller fler kärnor och positiv för fälla färgning (lila celler). Accepterade cut-off för antalet kärnor som används för att definiera en osteoclast är 318, men vi beslutade att använda 4 för att minska risken för falsklarm minimeras.
Modellen visar att breast cancer celler ihållande osteoclastogenesis eftersom antalet osteoklaster i brunnarna induceras av cancerceller var liknande som erhölls i den positiva kontrollen (figur 2). Som visas i figur 2A, ett antal celler också differentieras spontant efter osteoklaster i den negativa kontrollen. För att bekräfta användbarheten av modellen, utmanades systemet med en antitumöreffekt drog12,13. Osteoclast nummer var högre i samtidig odlingsbetingelser och positiv kontroll (CTR +) prover än i negativ kontroll (CTR-) prover. Osteoclast nummer minskat betydligt i närvaro av drogen (everolimus) i både Co odlingsbetingelser och positiva kontroller (CTR +). T-test användes för statistiska analyser. Cellerna räknades i varje brunn. Den ytan areaof osteoclast är ett kännetecken av mognad och kan analyseras med hjälp av programvara med öppen källkod som ImageJ. Osteoklaster härrör från GFs var större än de som inducerats av cancerceller (figur 2B). Behandling med en antitumöreffekt drog (everolimus) avstängd effekterna av GFs. Modellen gav användbar information om rollen av drogen i osteoclastogenesis hämning. Figur 2 c visar att osteoclastogenesis minskat i närvaro av drogen. Dessa resultat erhölls genom co-culture-inducerad osteoclastogenesis. Som förklaras i avsnittet protokoll, kan ett antal andra nedströms analyser utföras för att undersöka mekanismerna av överhörning och/eller de analyserade läkemedel. Modellen sammanfattas i figur 3 är mycket versatileand kan användas för att studera effekten av läkemedel på cancerceller, särskilt osteoklaster.
Figur 1. Osteoclastogenesis assay. Celler målat efter 14 dagar i kultur. CTR-monocyter odlade i frånvaro av tillväxtfaktorer; CTR + monocyter odlade med RANKL och MCSF tillväxtfaktorer; COCO, osteoklaster erhålls genom samtidig odling blodkroppar med cancerceller. 10 X förstoring. Osteoclast-liknande celler var celler med minst 4 kärnor som var positiva till FÄLLAN (lila celler). Celler kvantifierades genom att räkna cellerna i varje brunn; 4 replikat för varje villkor utfördes och genomsnittet beräknades. Skalstapeln är 400 µm. Image zoom i den undre panelen (100 X) illustrerar yta 2 osteoklaster (röda cirklar). Pilarna anger osteoclast atomkärnor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Effekten av everolimus på osteoclastogenesis behandling. (A) antal osteoklaster enligt närvaro/frånvaro av ett läkemedel; 4 replikat för varje villkor utfördes. CTR-monocyter odlade i frånvaro av tillväxtfaktorer; CTR + monocyter odlade med RANKL och MCSF tillväxtfaktorer; COCO, osteoklaster erhålls genom samtidig odling blodkroppar med cancerceller. Data är uttryckta som medelvärde ± SE. Betydelse utvärderades av t-test; * p < 0,05. (B) Osteoclast ytan beräknades genom ImageJ programvara med öppen källkod. Minst 50 osteoklaster per skick mättes. CTR-monocyter odlade i frånvaro av tillväxtfaktorer; CTR + monocyter odlade med RANKL och MCSF tillväxtfaktorer; COCO, osteoklaster erhålls genom samtidig odling blodkroppar med cancerceller. (C) bilder av celler efter 14 dagar i kultur i frånvaron eller närvaron av en antitumöreffekt drog (everolimus). 10 X förstoring; skalstapeln är 400 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3. Samtidig kultur modell. Ordningen av modellen och dess möjliga nedströms analyser och framtida program. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Preklinisk in vitro- modeller studerar mekanismer för överhörning mellan cancerceller och benceller behövs för att identifiera verkningsmekanismer skelettmetastaser som kan användas för att skapa nya terapeutiska strategier. Vi utvecklat en helt human in vitro- modell av osteoclastogenesis från perifert blod (figur 3). Under optimering av metodiken, var ett antal kritiska punkter identifieras och lösas. Först gäller kvantiteten av mononukleära celler till utsäde. Antalet celler som erhållits genom mikroskopet räkningen är bara en grov kvantifiering eftersom det är svårt att diskriminera mellan lymfocyter och monocyter, den sistnämnda är målceller till utsäde för osteoclastogenesis experimentet. Vi har kunnat identifiera monocyter eftersom lymfocyter inte följer plast substrat och således majoriteten var elimineras vid första förändringen av medium. Cellerna var seedad vid hög täthet, eftersom det är viktigt för cellerna att kunna interagera med varandra för differentiering, särskilt i den andra fasen av osteoclastogenesis där före osteoklaster måste vara nära varandra för att smälta och bli Mogna osteoklaster. En ytterligare svårighet uppstår när det finns flera experimentella villkor eftersom dessa kräver ett stort antal celler och en stor mängd blod. En möjlig lösning är att använda buffy rockar som har en hög koncentration av PBMC, t.ex., 4 x 105-6 x 106 mononukleära celler samlas normalt från ett prov på 50 mL buffy coat jämfört med färre än 1 x 105 PBMC samlas in från en 20 mL blodprov.
Som blodprover samlades in från olika frivilliga, fanns det en viss variation i osteoclastogenesis-analysen. Det var således viktigt att utföra varje analys med minst 3-4 tekniska replikat. Biologiska replikat behövdes också och som olika friska donatorer användes, vi normalt att beräkna inte medelvärdet av värdena av de olika experimenten. Vi sett till att utvecklingen av de olika testerna var likvärdiga och sedan valde ett experiment från en av de friska donatorerna ska ingå i manuskriptet.
Våra prekliniska modellen innebär samtidig odling av monocyter som genomgår differentiering med cancerceller. Som vi tidigare visade, klarar cancerceller även in vitro- osteoclastogenesis12,13. Detta system kan användas att testa droger eller att undersöka mekanismer för interaktion, det är möjligt att utföra flera efterföljande analyser både på cancerceller och osteoklaster. I själva verket är det möjligt att utföra spridning analyser på cancerceller och gen uttryck analyser/Western blot analyser på både cancer celler och osteoklaster13. Det skulle vara av intresse att förstå hur utsöndras proteinerna skiljer sig i olika förhållanden. Vår modell har ett antal fördelar, dvs, det är en helt human modell som inte är beroende av murina cellinjer, till skillnad från flera modeller som rapporterats i litteraturen. Modellen är också ganska robust och reproducerbara, och kan användas för andra ändamål. Exempelvis kan andra cancer cellinjer vara tillsammans odlade med osteoklaster och skillnaden i deras osteoclastogenic makt studerade. Detta system kan dessutom användas för att utvärdera andra fysiologiska eller patologiska mekanismer för att förbättra vår förståelse av ben biologi och osteoclast-medlad sjukdomar som osteoporos. Andra cytokiner och cell typer kan också vara tillsammans odlade tillsammans med osteoklaster beroende på syftet med experimentet.
Flera efterföljande analyser är möjliga med denna modell. Det är viktigt att bestämma under konstruktionsfasen av studien vad analyser kommer att utföras så att ett tillräckligt antal brunnar kan dirigeras.
Nedströms analyser med osteoklaster:
(i) gen uttryck analyser. Planera ytterligare brunnar av osteoklaster att extrahera total-RNA, som brunnarna färgas för TRAP utvärdering inte är tillgängliga för RNA-extraktion. (ii) Western blot analyser. (iii) kvantifiering av osteoclast yta. Osteoclast storlek är en parameter för osteoclast mognad och kan kvantifieras med hjälp av programvara med öppen källkod som ImageJ.
Nedströms analyser med cancerceller:
a spridning analyser såsom MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium metylbromid. (ii) gen uttryck analyser. (iii) Western blot analyser.
Nedströms analyser med osteoklaster och cancerceller (samtidig kultur):
Eftersom cancerceller och osteoklaster delar samma kultur medium, kan deras interaktion studeras med ELISA-testet som analyzesthe utsöndring av specifika cytokiner och GFs, övriga utsöndras proteiner.
Utvecklingen av denna modell var avgörande för vårt projekt och vi planerar att ytterligare förbättra det inom en snar framtid. Ett stort steg framåt skulle vara att skilja monocyter i 3D mineraliserade kollagen ställningar att härma benmatrix. Det skulle då vara möjligt att direkt bedöma osteoclast aktivitet med ett benresorption assay. Vi fortsätter att lära sig mer om de olika roller som spelas av osteoklaster i fysiologiska och patologiska bearbetning alltifrån benremodellering reglera skelettmetastaser, kommer att vår modell ge forskarna möjlighet att isolera och studera osteoklaster in vitro- .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Yibin Kang för att tillhandahålla den SCP2 cellen fodrar och Cristiano Verna för redaktionellt stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM | Euroclone | BE12-169F | |
| Glutamine | Life-technologies | ECB3000D | |
| Fetal bovine serum | Life-technologies | ECS0180DPR | |
| hMCSF | Peprotech | 300-25 | Storage indications must be respected |
| hRANKL | Peprotech | 310-01 | Storage indications must be respected |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma Aldrich | 387 A | |
| Lymphocyte separation media | Biowest | L0560-100 | |
| Red Blood cell lysing buffer | SIgma | 11814389001 ROCHE |
|
| Trypsin | EuroClone | COD. ECB3052D |
|
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | CRM-HTB-267 | |
| MCF7 | ATCC | HTB-22 | |
| Transwell | Corning | 3470-Clear | These inserts are for 24-well plates; 6.5 mm, 0.4 μM; pore size |
References
- Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D.
- Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. Br J Cancer. 55 (1), 61-66 (1987).
- Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. A new emergency in oncology: bone metastases in breast cancer patients. Oncol Lett. 6 (2), 306-310 (2013).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Cancer Res. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Roodman, G. D.
- Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7 (11), 1285-1297 (2011).
- Chen, Y. C., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. Breast cancer metastasis to the bone: mechanisms of bone loss. Breast Cancer Res. 12 (6), 215 (2010).
- Guise, T. A. Breast cancer bone metastases: it's all about the neighborhood. Cell. 154 (5), 957-959 (2013).
- Ell, B., et al. Tumor-induced osteoclast miRNA changes as regulators and biomarkers of osteolytic bonemetastasis. Cancer Cell. 24 (4), 542-556 (2013).
- Lu, X., et al. VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging α4β1-positive osteoclast progenitors. Cancer Cell. 20 (6), 701-714 (2011).
- Wang, H., et al. The osteogenic niche promotes early-stage bone colonization of disseminated breast cancer cells. Cancer Cell. 27 (2), 193-210 (2015).
- Liverani, C., et al. CSF-1 blockade impairs breast cancer osteoclastogenic potential in co-culture systems. Bone. 66, 214-222 (2014).
- Mercatali, L., et al. The effect of everolimus in an in vitro model of triple negative breast cancer and osteoclasts. Int J Mol Sci. 1 (11), e1827 (2016).
- Glantschnig, H., Fisher, J. E., Wesolowski, G., Rodan, G. A., Reszka, A. A. M-CSF, TNFalpha and RANK ligand promote osteoclast survival by signaling through mTOR/S6 kinase. Cell DeathDiffer. 10 (10), 1165-1177 (2003).
- Sugatani, T., Hruska, K. A. Akt1/Akt2 and mammalian target of rapamycin/Bim play critical roles in osteoclast differentiation and survival, respectively, whereas Akt is dispensable for cell survival in isolated osteoclast precursors. J Biol Chem. 280 (5), 3583-3589 (2005).
- Bertoldo, F., et al. Targeting bone metastatic cancer: role of the mTOR pathway. Biochim Biophys Acta. 1845 (2), 248-254 (2014).
- Kang, Y., Siegel, P. M., Shu, W., Drobnjak, M., Kakonen, S. M., Cordón-Cardo, C., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
- Simone, V., Ciavarella, S., Brunetti, O., Savonarola, A., Cives, M., Tucci, M. Everolimus restrains the paracrine pro-osteoclast activity of breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (15), 692 (2015).
