Utveckling av en mänsklig preklinisk modell av Osteoclastogenesis från perifert blod monocyter Co odlade med Breast Cancer cellinjer
Summary
Det här protokollet beskriver utveckling av ett in vitro- human preklinisk modell av osteoclastogenesis från perifert blod monocyter odlade med bröst cancer cellinjer att efterlikna cancer cell-osteoclast interaktionen. Modellen skulle kunna användas till ytterligare vår förståelse av metastaser benbildning och förbättra terapeutiska alternativ.
Abstract
Överhörning mellan tumörceller och benceller i det ben närmiljön är avgörande för att förstå mekanismen av metastaser benbildning. Vi utvecklat en in vitro- fullt humana preklinisk modell av en samtidig kultur av bröstcancer cancerceller och monocyter som genomgår differentiering mot osteoklaster. Vi har optimerat en modell av osteoclastogenesis från ett urval av perifert blod som samlats in från friska donatorer. Perifera mononukleära blodceller (PBMC) först skildes genom täthet lutning centrifugering, seedade på en hög densitet och inducerad att skilja genom att lägga till två tillväxtfaktorer (GFs): receptor activator av nuclear factor-κB ligand (RANKL) och makrofag granulocytkolonistimulerande faktor (MCSF). Cellerna var kvar i kultur i 14 dagar och sedan fasta och analyseras av efterföljande analys. En av effekterna av cancer cell ankomst i ben är osteolytiska metastaser, induktion av osteoclastogenesis. Vi utmanas således vår modell med samtidig kulturer av bröstcancer cancerceller att studera differentiering kraften i cancerceller med avseende på GFs. Ett enkelt sätt att studera cancer cell-osteoclast interaktion är att utföra indirekta samtidig kulturer baserat på användningen av luftkonditionering medium samlas in från breast cancer cellkulturer och blandas med färskt medium. Denna blandning används sedan för att inducera osteoclast differentiering. Vi har också optimerat en metod för direkt samarbete kultur i vilken cancer celler och monocyter som genomgår differentiering dela medium och utbyta utsöndrade faktorer. Detta är en betydande förbättring över den ursprungliga indirekta samtidig kultur-metoden som forskare kan iaktta ömsesidiga växelverkan mellan de två celltyper och utföra efterföljande analyser för både cancerceller och osteoklaster. Denna metod gör det möjligt för oss att studera effekten av läkemedel på den benmetastaser närmiljön och utsäde cellinjer än de som härrör från bröstcancer. Modellen kan också användas för att studera andra sjukdomar såsom osteoporos eller andra ben villkor.
Introduction
Ben är en vanlig plats för metastaser för olika typer av primära tumörer såsom prostata-, lung- och bröstcancer cancer, med 20-25% av patienterna utveckla skelettmetastaser under sjukdom1,2,3. 70% av patienter med bröstcancer bär särskilt bevis för skelettmetastaser vid död4. Tumör- och stromal interaktion är viktig för cancer progression i både primär cancer och sekundära lesioner. I den ben mikromiljö beror osteolytiska skelettmetastaser från bröstcancer på etableringen av en patologisk ond cirkel uppstår mellan cancerceller, benceller och den ben mikromiljö. Cancerceller störa ben balans, öka benresorption5,6,7.
I normala och patologiska förhållanden är osteoklaster cellerna som är ansvariga för benresorption, osteoblaster, i sätta in ny matris, är ansvariga för nytt Ben bildas8. Aktiviteten hos osteoklasterna regleras av osteoblaster genom uttrycket av RANKL, som binder till sin receptor RANK på före osteoclast ytan, förmå före osteoclast fusion, en nödvändig process för differentiering in mogna osteoklaster. Induktion av osteoclastogenesis ökar benresorption. Ett stort antal in-vivo studier har avsevärt förbättrat vår förståelse av ben metastaser bildning9,10,11. Bröstcancerceller från den primära tumören och i de ben mikromiljö stör ben homeostas, främja osteoclastogenesis och ben resorption8. I det här fallet är alla molekylära interaktioner som sker mellan cancerceller och osteoklaster av avgörande betydelse. Som redan nämnts, har mekanismen av metastaser benbildning klargjorts i i vivo möss-modeller. Förutom behovet för godkännande av alla i vivo våra djurförsök av etikkommitté finns det dock flera andra nackdelar att utföra i vivo experiment inklusive höga kostnader och tidskrävande metoder. Flera författare har kombinerat prekliniska i vivo och in vitro- modeller av osteoclastogenesis med hjälp av en murin före osteoklaster kallas RAW246.79,10,11. Nackdelarna med denna modell härrör från det faktum att cellerna har redan åtagit sig att bli pre osteoklaster inte och av mänskligt ursprung. Av dessa skäl kunde translationell forskning stor nytta tillgängligheten av in vitro- fullt mänskliga prekliniska modeller att studera ben cancer cell interaktioner.
Vi har optimerat en metod av osteoclastogenesis in vitro- som start från perifert blod prover12,13. Osteoklaster är framgår av monocyter, som är närvarande, om än i liten utsträckning, i perifert blodprover. Mononukleära celler separeras först från erytrocyter och granulocyter i helblod av Ficoll täthetlutning; de väljs sedan tack vare sin förmåga att hålla sig till plast substrat, till skillnad från lymfocyter. Efter sådd, odlas celler i 14 dagar. MCSF och RANKL är GF krävs av monocyter att skilja först i makrofager och sedan till osteoklaster14,15. MCSF behövs för hela analysen, medan RANKL används för att framkalla differentiering processen i sena stadier av osteoclastogenesis. I den tidiga fasen av differentiering hjälper MCSF monocyter föröka sig och överleva14,15. Under den andra delen av osteoclastogenesis, celler smälter samman och mogna som osteoklasterna, visar karakteristiska fördelningen av aktin F i ringar och uttrycker specifika markörer såsom tartrat-resistenta syra fosfatas (TRAP) och kalcitonin receptor (CTR) 14 , 15. vår metod består i att lägga till MCSF till monocyt kulturen under de första 7 dagarna av experimentet och en kombination av MCSF och RANKL från dag 7 till 14. Vid slutet av experimentet analyseras osteoclastogenesis genom att räkna de differentierade cellerna, enligt nedan.
Monocyt kulturerna inducerad att skilja av GFs utgör grunden för vår preklinisk modell. Vi har optimerat en samtidig kultur system utan GFs att bättre förstå osteoclastogenic kraften av bröstcancerceller. Vi först utvecklades en modell av indirekta samtidig kulturer genom att lägga till ett medium (80% α-väsentliga minimalmedium (α-MEM) och 20% luftkonditionerade medium samlas in från en kultur av bröstcancer cancerceller att var ca 90% konfluenta celler genomgår differentiering12 . Konditionerat medium (inte samlas in serum deprivation villkor) samlades efter 24 timmar och blandas med färskt medium på en andel av 1:4. Det luftkonditionerade mediet inducerad betydande osteoclast differentiering med avseende på den negativa kontrollen. Dock som informationen på det ömsesidiga samspelet mellan cancerceller och benceller bryts när använda indirekta samtidig kulturer, förbättrat vi vårt system genom att utföra direkt samtidig kulturer. Vi seedade cancerceller i 0,4 µM infogar och placerade dem i brunnar där mononukleära celler var klädd. Med den här metoden celler dela samma medium och utbyta utsöndrade proteiner. Vi har därför skapat en helt human preklinisk modell av osteoclastogenesis framkallas genom cancer celler13.
Detta system är extremt mångsidig och kan användas för olika forskningsändamål, t.ex., i farmakologiska studier som undersöker rollen av droger i skelettmetastaser. Vår modell gör det möjligt att studera effekt och verkningsmekanismer av ben-riktade terapier eller antitumöreffekt droger i den ben närmiljön i närvaro av cancer celler13. Utformar experimenten med rätt kontroller, gör dvs, cancerceller och osteoklaster odlade individuellt, det lättare att förstå effekterna av samtidig kultur på drogen aktivitet. Detta tillvägagångssätt blir ännu mer intressant när drogen studeras mål både cancer celler och osteoklaster, t.ex., everolimus16. Denna modell kan också användas för att identifiera nya vägar av samspelet mellan cancerceller och benceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Preklinisk in vitro- modeller studerar mekanismer för överhörning mellan cancerceller och benceller behövs för att identifiera verkningsmekanismer skelettmetastaser som kan användas för att skapa nya terapeutiska strategier. Vi utvecklat en helt human in vitro- modell av osteoclastogenesis från perifert blod (figur 3). Under optimering av metodiken, var ett antal kritiska punkter identifieras och lösas. Först gäller kvantiteten av mononukleära celler till utsäd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Yibin Kang för att tillhandahålla den SCP2 cellen fodrar och Cristiano Verna för redaktionellt stöd.
Materials
| αMEM | Euroclone | BE12-169F | |
| Glutamine | Life-technologies | ECB3000D | |
| Fetal bovine serum | Life-technologies | ECS0180DPR | |
| hMCSF | Peprotech | 300-25 | Storage indications must be respected |
| hRANKL | Peprotech | 310-01 | Storage indications must be respected |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma Aldrich | 387 A | |
| Lymphocyte separation media | Biowest | L0560-100 | |
| Red Blood cell lysing buffer | SIgma | 11814389001 ROCHE |
|
| Trypsin | EuroClone | COD. ECB3052D | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | CRM-HTB-267 | |
| MCF7 | ATCC | HTB-22 | |
| Transwell | Corning | 3470-Clear | These inserts are for 24-well plates; 6.5 mm, 0.4 μM; pore size |
References
- Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. Bone and cancer: the osteoncology. Clin Cases Miner Bone Metab. 10 (2), 121-123 (2013).
- Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. Br J Cancer. 55 (1), 61-66 (1987).
- Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. A new emergency in oncology: bone metastases in breast cancer patients. Oncol Lett. 6 (2), 306-310 (2013).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Cancer Res. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Roodman, G. D. Mechanisms of bone metastasis. N Eng J Med. 350 (12), 1655-1664 (2004).
- Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7 (11), 1285-1297 (2011).
- Chen, Y. C., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. Breast cancer metastasis to the bone: mechanisms of bone loss. Breast Cancer Res. 12 (6), 215 (2010).
- Guise, T. A. Breast cancer bone metastases: it’s all about the neighborhood. Cell. 154 (5), 957-959 (2013).
- Ell, B., et al. Tumor-induced osteoclast miRNA changes as regulators and biomarkers of osteolytic bonemetastasis. Cancer Cell. 24 (4), 542-556 (2013).
- Lu, X., et al. VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging α4β1-positive osteoclast progenitors. Cancer Cell. 20 (6), 701-714 (2011).
- Wang, H., et al. The osteogenic niche promotes early-stage bone colonization of disseminated breast cancer cells. Cancer Cell. 27 (2), 193-210 (2015).
- Liverani, C., et al. CSF-1 blockade impairs breast cancer osteoclastogenic potential in co-culture systems. Bone. 66, 214-222 (2014).
- Mercatali, L., et al. The effect of everolimus in an in vitro model of triple negative breast cancer and osteoclasts. Int J Mol Sci. 1 (11), e1827 (2016).
- Glantschnig, H., Fisher, J. E., Wesolowski, G., Rodan, G. A., Reszka, A. A. M-CSF, TNFalpha and RANK ligand promote osteoclast survival by signaling through mTOR/S6 kinase. Cell DeathDiffer. 10 (10), 1165-1177 (2003).
- Sugatani, T., Hruska, K. A. Akt1/Akt2 and mammalian target of rapamycin/Bim play critical roles in osteoclast differentiation and survival, respectively, whereas Akt is dispensable for cell survival in isolated osteoclast precursors. J Biol Chem. 280 (5), 3583-3589 (2005).
- Bertoldo, F., et al. Targeting bone metastatic cancer: role of the mTOR pathway. Biochim Biophys Acta. 1845 (2), 248-254 (2014).
- Kang, Y., Siegel, P. M., Shu, W., Drobnjak, M., Kakonen, S. M., Cordón-Cardo, C., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
- Simone, V., Ciavarella, S., Brunetti, O., Savonarola, A., Cives, M., Tucci, M. Everolimus restrains the paracrine pro-osteoclast activity of breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (15), 692 (2015).
