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Cancer Research

Développement d’un humain modèle préclinique de Osteoclastogenesis de Monocytes du sang périphérique conjointement mis en culture avec des lignées cellulaires de Cancer du sein

Published: September 13, 2017 doi: 10.3791/56311
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Osteoncology and Rare Tumors Center, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST), IRCCS

Summary

Ce protocole décrit le développement d’un in vitro humain modèle préclinique d’osteoclastogenesis de monocytes du sang périphérique, cultivées avec des lignées de cellules cancéreuses du sein pour imiter l’interaction cellule-ostéoclastes de cancer. Le modèle pourrait être utilisé pour approfondir nos connaissances de la formation de métastases osseuse et améliorer les options thérapeutiques.

Abstract

La diaphonie entre les cellules tumorales et des cellules osseuses dans le microenvironnement osseux est essentielle pour comprendre le mécanisme de la formation de métastases osseuse. Nous avons développé un in vitro entièrement humain modèle préclinique d’une co-culture de cellules cancéreuses du sein et les monocytes en cours de différenciation vers les ostéoclastes. Nous avons optimisé un modèle d’osteoclastogenesis à partir d’un échantillon de sang périphérique provenant de donneurs sains. Les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) ont d’abord séparés par centrifugation en gradient de densité, injectées à une densité élevée et induites à se différencier en ajoutant deux facteurs de croissance (GFs) : activateur du récepteur du facteur nucléaire-κB ligand (RANKL) et macrophages facteur stimulant les colonies (MCSF). Les cellules ont été laissés dans la culture pendant 14 jours puis fixe et analysés par l’analyse en aval. Dans les métastases osseuses ostéolytiques, l’un des effets de l’arrivée de cellules du cancer dans l’OS est l’induction d’osteoclastogenesis. Ainsi, nous avons attaqué notre modèle avec co-cultures de cellules cancéreuses du sein afin d’étudier le pouvoir de différenciation des cellules cancéreuses à l’égard de GFs. Un moyen simple d’étudier l’interaction cellule-ostéoclastes cancer consiste à effectuer des co-cultures indirectes basées sur l’utilisation du milieu conditionné provenant de cultures de cellules de cancer du sein et mélangé avec un milieu frais. Ce mélange est ensuite utilisé pour induire la différenciation des ostéoclastes. Nous avons optimisé également une méthode de co-culture directe dans laquelle le cancer des cellules et des monocytes en cours de différenciation partagent le milieu et d’échangent des facteurs sécrétés. C’est une amélioration significative sur la méthode originale de co-culture indirecte car les chercheurs peuvent observer les interactions réciproques entre les deux types cellulaires et effectuer des analyses en aval pour les cellules cancéreuses et les ostéoclastes. Cette méthode nous permet d’étudier l’effet des drogues sur le microenvironnement osseux métastatique et aux lignées de cellules de semence autres que ceux provenant d’un cancer du sein. Le modèle peut également servir à étudier d’autres maladies comme l’ostéoporose ou d’autres maladies osseuses.

Introduction

L’OS est un site commun de métastase pour différents types de tumeurs primaires telles que le cancer de la prostate, du poumon et du sein, avec 20 à 25 % des patients présentant des métastases osseuses au cours de la maladie1,2,3. En particulier, 70 % des patientes atteintes de cancer portent témoignage de métastase osseuse à mort4. Tumeur et les cellules stromales interaction est essentielle pour la progression du cancer en cancer primitif et lésions secondaires. Dans le microenvironnement osseux, métastases osseuses ostéolytiques du cancer dépendent de la mise en place d’un cercle vicieux pathologique survenant entre cellules cancéreuses, les cellules osseuses et le microenvironnement osseux. Cellules cancéreuses perturbent l’équilibre osseuse, augmentation osseuse résorption5,6,7.

Dans des conditions normales et pathologiques, les ostéoclastes sont les cellules responsables de la résorption osseuse, tandis que les ostéoblastes, en déposant la nouvelle matrice, sont responsables de la formation8de l’OS nouveau. L’activité ostéoclastique est réglementée par les ostéoblastes à travers l’expression de RANKL, qui se lie à son récepteur RANK sur la surface des ostéoclaste, induisant des ostéoclaste avant la fusion, un processus nécessaire pour une différenciation des ostéoclastes matures. L’induction d’osteoclastogenesis augmente la résorption osseuse. Un grand nombre d’études in vivo ont considérablement amélioré notre compréhension des os métastase formation9,10,11. Cellules cancéreuses de la tumeur primaire et dans le microenvironnement osseux perturbent l’homéostasie osseuse, promotion osteoclastogenesis et8de la résorption des os. Dans ce scénario, toutes les interactions moléculaires qui se produisent entre les cellules cancéreuses et les ostéoclastes sont d’une importance cruciale. Comme nous l’avons déjà mentionné, le mécanisme de la formation de métastases osseuse a été élucidé dans les modèles de souris in vivo . Cependant, outre le fait que l’approbation de tous les in vivo l’expérimentation animale par le Comité d’éthique, il y a plusieurs autres inconvénients lorsque vous exécutez des expériences in vivo notamment les coûts élevés et des méthodes fastidieuses. Plusieurs auteurs ont combiné des modèles précliniques in vivo et in vitro d’osteoclastogenesis en utilisant une ligne murine des ostéoclastes pré appelé RAW246.79,10,11. Les inconvénients de ce modèle proviennent du fait que les cellules se sont déjà engagés à devenir des ostéoclastes et ne sont pas d’origine humaine. Pour ces raisons, la recherche translationnelle pourrait grandement bénéficier de la disponibilité de in vitro entièrement humain modèles précliniques pour étudier les interactions entre cellules de cancer osseux.

Nous avons optimisé une méthode d’osteoclastogenesis in vitro à partir des échantillons de sang périphérique humain12,13. Les ostéoclastes dérivent des monocytes, qui sont présents, bien que dans une faible mesure, dans des échantillons de sang périphérique. Les cellules mononucléaires sont d’abord séparés des érythrocytes et granulocytes présents dans le sang total par gradient de densité de gradient de Ficoll ; ils sont ensuite sélectionnés grâce à leur capacité à adhérer à un substrat en plastique, à la différence des lymphocytes. Après l’ensemencement, les cellules sont cultivées pendant 14 jours. MCSF et RANKL sont le GFs requis par les monocytes de différencier tout d’abord en macrophages, puis en ostéoclastes14,15. MCSF est nécessaire pendant toute la durée de l’essai, tandis que RANKL est utilisé pour induire le processus de différenciation dans les derniers stades d’osteoclastogenesis. Dans la phase précoce de la différenciation, MCSF aide monocytes proliférer et à survivre14,15. Au cours de la deuxième partie d’osteoclastogenesis, cellules fusionnent et matures comme les ostéoclastes, montrant la répartition caractéristique de l’actine F dans les anneaux et expriment des marqueurs spécifiques tels que les phosphatases acides tartrate-résistantes (TRAP) et récepteur calcitonine (CTR) 14 , 15. notre méthode consiste à ajouter le MCSF à la culture de monocyte pour les 7 premiers jours de l’expérience et une combinaison de MCSF et RANKL de jours 7 à 14. À la fin de l’expérience, osteoclastogenesis est analysée en comptant les cellules différenciées, comme détaillé ci-dessous.

Les cultures de monocyte induites à se différencier par GFs forment la base de notre modèle préclinique. Nous avons optimisé un système de co-culture sans GFs pour mieux comprendre le pouvoir d’osteoclastogenic des cellules cancéreuses du sein. Nous avons développé tout d’abord un modèle des co-cultures indirectes en ajoutant un support (80 % α-milieu essentiel Minimal (α-MEM) et 20 % conditionnée moyen prélevé une culture de cellules cancéreuses du sein qu’environ 90 % anastomosé aux cellules subissent la différenciation12 . Le milieu conditionné (non prélevé dans des conditions de privation de sérum) a été capturé après 24 heures et mélangé avec un milieu frais à une proportion de 1:4. Le milieu conditionné induite par différenciation ostéoclastique significative en ce qui concerne le contrôle négatif. Cependant, comme les informations sur l’interaction réciproque entre cellules cancéreuses et les cellules osseuses sont perdues lors de l’utilisation indirectes co-cultures, nous avons amélioré notre système en effectuant des co-cultures directs. Nous avons ensemencé des cellules cancéreuses à 0,4 µM insère et placés dans le puits où les cellules mononucléaires sont plaqués. En utilisant cette méthode, les cellules partagent le même milieu et échangent des protéines sécrétées. Ainsi, nous avons créé un modèle préclinique pleinement humain d’osteoclastogenesis induite par le cancer des cellules13.

Ce système est extrêmement souple et peut être utilisé à des fins de recherche différentes, par exemple, dans des études pharmacologiques sur le rôle des médicaments dans les métastases osseuses. Notre modèle permet d’étudier l’efficacité et les mécanismes d’action des thérapies ciblées OS et/ou médicaments antitumoraux dans le microenvironnement osseux en présence de cellules de cancer du13. Concevez les expériences avec les réglages corrects, c'est-à-dire, les cellules cancéreuses et les ostéoclastes cultivés individuellement, rend plus facile à comprendre l’impact de la co-culture sur drogues est très actif. Cette approche devient encore plus intéressante lorsque le médicament à l’étude vise les deux cancer des cellules et des ostéoclastes, par exemple, évérolimus16. Ce modèle peut également être utilisé pour identifier de nouvelles voies d’interaction entre les cellules cancéreuses et les cellules osseuses.

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Protocol

humains ostéoclastes étaient différenciés de PBMC de donneurs sains qui ont donné le consentement éclairé pour participer à l’étude. Le protocole de l’étude a été approuvé par le Comité d’éthique local, conformément aux normes éthiques fixés dans la déclaration d’Helsinki de 1964.

1. différenciation des ostéoclastes

Remarque : recueillir du sang périphérique ou manteaux buffy de donneurs humains sains à l’EDTA. N’utilisez pas de moins de 20 mL de sang périphérique. Buffy manteaux est préférables car ils ont une plus grande abondance de cellules mononucléaires. Effectuer toutes les étapes suivantes dans une hotte stérile vitroplants.

  1. Sang total EDTA dilué 1:1 avec 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Remettre en suspension bien.
  2. Couche sur les médias de séparation de lymphocytes (PBS de sang : médias de séparation de lymphocytes, 2:1) dans des tubes de 50 mL.
    1. Pipette de 30 mL de sang dilué dans du PBS dans un tube de 50 mL.
    2. Doucement assise 15 mL de médias de séparation de lymphocytes dans le bas du tube de 50 mL.
  3. Centrifugeuse à 757 × g pendant 10 min à température ambiante (sans frein).
  4. Le prélèvement de cellules mononucléaires :
    1. recueillir la couche de cellules mononucléaires avec une pipette de 5 mL blanche sans agitation et placez-le dans un nouveau tube de 50 mL.
    2. Diluer les PBMC collectées avec 20 mL de PBS.
  5. Laver les PBMC :
    1. centrifugeuse à 225 x g pendant 5 min à température ambiante.
    2. Jeter le surnageant en renversant le tube. Répéter une fois.
  6. Lyse RBC :
    Remarque : si le culot cellulaire est rouge, traiter des cellules avec des globules rouges, solution tampon de lyse (voir Table des matières).
    1. Mettre le tube de 50 mL sur glace.
    2. Ajouter 5 mL de tampon de lyse de globules rouges.
    3. Attendre 3-5 min pour terminer la lyse des érythrocytes. Le temps varie selon le degré de contamination érythrocytaire.
    4. Arrêter la réaction en ajoutant 20 mL de PBS.
    5. Centrifugeuse à 225 x g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant en renversant le tube.
      Remarque : En option : si la lyse de la RBC est effectuée, laver les PBMC tel que décrit ci-dessous.
  7. Lavage PBMC :
    1. Ajouter 20 mL de PBS et centrifuger à 225 x g pendant 5 min à température ambiante.
    2. Jeter le surnageant en renversant le tube.
  8. Remettre en suspension les cellules complète α-MEM (additionné de 1 % de glutamine (concentration initiale 100 X) et 10 % sérum de veau fœtal).
  9. Compter les cellules avec une chambre de Neubauer.
    1. Diluer l’échantillon 1/100 dans l’acide acétique glacial et 10 µL de la dilution permet de compter les cellules.
    2. Compter au moins deux fois et calculer la moyenne des répétitions pour obtenir le nombre moyen de cellules recueillies.
  10. Plaque de cellules :
    1. plaque de cellules à une concentration de 750 000 PBMC par cm 2.
    2. Stocker plaqué de cellules dans un incubateur à 37 ° C en atmosphère 5 % CO 2.
      NOTE : Conception de l’expérience pour inclure les contrôles négatifs, qui sont des cellules qui sont traités avec normal complet α-MEM sans MCSF ni RANKL GFs. n’oubliez pas d’effectuer chaque condition au moins 3 techniques réplique. Effectuer au moins 3 réplicats biologiques.
  11. Changer le milieu supplémenté avec GFs :
    1. attendre environ 3 h après l’ensemencement de la cellule, puis enlever le milieu en pipette (200-1 000 µL) de se défaire des débris, seules les cellules et les érythrocytes.
      Remarque : Soyez prudent lorsque vous modifiez le milieu pour éviter le détachement cellulaire.
    2. Ajouter nouveau complet α-MEM additionné de 20 ng/mL de MCSF (500 µL/puits).
      Remarque : Lorsque co-culture avec les cellules cancéreuses, les cellules semences le cancer le jour après l’ensemencement de PBMC.
  12. Changer les médias tous les 2-3 jours (α-MEM additionné de 20 ng/mL de MCSF) :
    1. jeter le milieu par une pipette de 200-1 000 µL.
    2. Ajouter nouveau milieu frais par une pipette de 200-1 000 µL.
  13. 6-7 jours après l’ensemencement de cellule, ajouter 20 ng/mL de RANKL complet α-MEM + MCSF.
  14. Changer le milieu (α complète-MEM + MCSF + RANKL) tous les 2-3 jours :
    1. jeter le milieu avec une pipette de 200-1 000 µL.
    2. Ajouter nouveau média avec une pipette de 200-1 000 µL. Induction de la différenciation du arrêter 14 jours après l’ensemencement de la cellule.
    3. Écart moyen et laver deux fois avec du PBS.
  15. Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde :
    1. cellules demeurent sécher.
    2. Ajouter paraformaldéhyde à 4 % (voir la Table des matières).
    3. Laisser incuber pendant 20 min à température ambiante.
  16. Jeter paraformaldéhyde et laver deux fois avec 500 µL de PBS.
    ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique ; Veuillez porter des gants, masque et lunettes.
  17. Permettre aux cellules sécher.
  18. Piège à effectuer la coloration selon le fabricant ' s directives (voir Table des matières).
  19. Compter cellules ostéoclastiques manuellement sous le microscope à grossissement 10 X ; NA 0.30.
    NOTE : Cellules semblables à des ostéoclastes sont définis comme polycarion cellules de piège + au moins 4 noyaux.

2. Les Cultures de cellules de cancer

Remarque : les expériences peuvent être effectuées avec différents types de lignées de cellules adénocarcinome du sein tels que sep2 17, une lignée de cellules d’osteotropic provenant de l’homme triple négatif lignée cellulaire de cancer du sein (MDA-MB-231) et la lignée de cellules de récepteurs hormonaux MCF7.

  1. La culture des cellules comme une monocouche dans des flacons de 75 cm 2.
    1. Cellules cancéreuses seed 1 000 000 dans une fiole de 75 cm, 2.
    2. Stocker les cellules à 37 ° C dans un milieu additionné de 1 % glutamine et 10 % de sérum de veau fœtal dans une atmosphère de 2 CO 5 % complet α-MEM.
  2. Détacher les cellules à une confluence d’environ 90 % :
    1. jeter le milieu, laver avec du PBS et ajouter 2 à 3 mL de trypsine 1 X dans du PBS.
    2. Incuber les cellules pendant 3 à 5 min à 37 ° C.
    3. Recueillir les cellules individuelles de la fiole de 75 cm 2 par une pipette 10 mL, 8 ml de milieu complet pour arrêter la réaction enzymatique.
    4. Centrifuger à 225 x g pendant 5 min.
  3. Laver les cellules cancéreuses :
    1. Ajouter 10 mL de PBS.
    2. Centrifuger à 600 x g pendant 5 min.
  4. Compter les cellules cancéreuses avec une chambre de Neubauer.
    1. Compter au moins deux fois par les cellules cancéreuses et de calculer la moyenne des répétitions pour obtenir le nombre moyen de cellules recueillies.

3. Direct des co-cultures de cellules cancéreuses une nd Monocytes en cours de différenciation vers les ostéoclastes

  1. les cellules cancéreuses sur plaquettes (pore diamètre 0,4 µm) de semences :
    1. graines les cellules cancéreuses à une concentration de 4 000 cellules / cm 2.
    2. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO 2.
      NOTE : Semences le cancer des cellules au lendemain de PBMC semis pour l’expérience de co-culture de 0,4 µm insertions.
  2. Attendre 24 heures afin de permettre aux cellules d’adhérer.
  3. Place la tête de série insérer la culture sur les cultures mononucléaires pour démarrer la co-culture (voir la section 1.10 du protocole).
  4. Changement des médias tous les 2-3 jours avec bain α-MEM.
    1. Jeter le milieu avec une pipette de 200-1 000 µL.
    2. Ajouter 500 µL de frais moyen.
      Remarque : L’objectif principal de la co-culture doit comprendre le pouvoir d’osteoclastogenic des cellules cancéreuses, par conséquent, le GFs ne sont pas ajouté au α-MEM. Pour chaque expérience de co-culture, inclure negative contrôles (voir la note à l’étape 1.10 du protocole) et des témoins positifs des ostéoclastes différenciés par RANKL et MCSF (pas de cellules cancéreuses). Cellules cancéreuses ensemencées dans les encarts ne pas placées au-dessus des cellules mononucléaires sont utilisés comme contrôle négatif de la co-culture.
  5. Arrêter la co-culture et utiliser des cellules cancéreuses pour analyse en aval :
    1. 13 jours après le semis de PBMC et 12 jours après l’ensemencement de cellules du cancer, placer l’insert sur une nouvelle assiette.
    2. Arrêter la culture de cellules de cancer sur la base desquels les analyses en aval sont à effectuer (voir Discussion).
  6. Le 14e jour, arrêter la différenciation ostéoclastique et fixer les cellules, comme indiqué dans l’étape 1.15.
  7. Piège à effectuer la coloration immédiatement ou dans les 14-30 jours.
    NOTE : La coloration facultatif : pour vérifier que les cellules de polycarion piège + sont les ostéoclastes, chercheurs peuvent effectuer taches supplémentaires pour détecter les CTR, un marqueur d’ostéoclastes spécifique. La détection des anneaux d’actine-F est un autre ostéoclastiques spécifiques coloration test 12 , 13 , 14.

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Representative Results

Une méthode a été optimisée pour différencier facilement les ostéoclastes de monocytes du sang périphérique humain. La culture de monocyte a été cultivée avec les cellules cancéreuses, confirmant (comme décrit dans la littérature18) que les cellules cancéreuses sont capables de supporter des osteoclastogenesis dans les métastases osseuses. Les ostéoclastes différencient de cellules cancéreuses et GFs sont indiquées à la Figure 1. Une cellule de type ostéoclastique est une cellule avec des noyaux de 4 ou plus et est positive pour piège coloration (cellules pourpres). Le seuil accepté pour le nombre de noyaux utilisés pour définir un ostéoclaste est 318, mais nous avons décidé d’utiliser 4 pour réduire le risque de faux positifs au minimum.

Le modèle montre que breast cancer cellules soutenue osteoclastogenesis parce que le nombre des ostéoclastes dans les puits induites par les cellules cancéreuses était similaire à celle obtenue dans le contrôle positif (Figure 2). Comme le montre la Figure 2 a, un certain nombre de cellules se différencie également spontanément en ostéoclastes dans le contrôle négatif. Afin de confirmer l’utilité du modèle, le système a été contesté avec une drogue antitumorale12,13. Nombre d’ostéoclastes était plus élevées dans des conditions de culture mixte et des échantillons de contrôle positif (CTR +) que dans des échantillons de contrôle négatif (CTR-). Numéros de l’ostéoclaste est significativement diminuée en présence de la drogue (évérolimus) dans les conditions de culture co tant de témoins positifs (CTR +). Le t-test a été utilisé pour des analyses statistiques. Cellules ont été comptées dans chaque puits. La surface Airede l’ostéoclaste est une caractéristique de la maturation et peut être analysée à l’aide de logiciels open source comme ImageJ. Les ostéoclastes dérivées de GFs étaient plus grandes que celles induites par les cellules cancéreuses (Figure 2 b). Traitement avec un médicament antitumoral (évérolimus) désactivé les effets de GFs. Le modèle a fourni des informations utiles sur le rôle du médicament dans l’inhibition de l’osteoclastogenesis. La figure 2 montre qu’osteoclastogenesis diminue en présence de la drogue. Ces résultats ont été obtenus par osteoclastogenesis co-culture-induite. Comme expliqué dans la section protocole, un certain nombre d’autres analyses en aval peut être effectué pour étudier les mécanismes de la diaphonie et/ou des médicaments analysés. Le modèle Résumé à la Figure 3 est hautement versatileand peut être utilisé pour étudier l’effet des médicaments sur les cellules cancéreuses, en particulier, les ostéoclastes.

Figure 1
Figure 1. Dosage de osteoclastogenesis. Les cellules colorées après 14 jours de culture. CTR-monocytes cultivés en l’absence de facteurs de croissance ; CTR + monocytes cultivées avec RANKL et MCSF, facteurs de croissance ; COCO, ostéoclastes obtenus par co-culture globules avec les cellules cancéreuses. Grossissement de 10 X. Cellules semblables à des ostéoclastes sont des cellules au moins 4 noyaux qui se sont révélés positifs au siphon (cellules pourpres). Les cellules ont été quantifiés en comptant les cellules dans chaque puits ; 4 répétitions pour chaque condition ont été réalisées et la moyenne a été calculée. La barre d’échelle est 400 µm. Le zoom de l’image dans le panneau inférieur (100 X) illustre la surface des 2 ostéoclastes (cercles rouges). Les flèches indiquent les noyaux des ostéoclastes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Effet de l’évérolimus sur traitement d’osteoclastogenesis. (A) nombre d’ostéoclastes selon la présence ou l’absence d’un médicament ; 4 répétitions pour chaque condition ont été effectuées. CTR-monocytes cultivés en l’absence de facteurs de croissance ; CTR + monocytes cultivées avec RANKL et MCSF, facteurs de croissance ; COCO, ostéoclastes obtenus par co-culture globules avec les cellules cancéreuses. Données sont exprimées en moyenne ± écart type. Signification a été évaluée par le test t ; * p < 0,05. Ostéoclastes (B) superficie a été calculée par ImageJ logiciel open source. Au moins 50 ostéoclastes par condition ont été mesurés. CTR-monocytes cultivés en l’absence de facteurs de croissance ; CTR + monocytes cultivées avec RANKL et MCSF, facteurs de croissance ; COCO, ostéoclastes obtenus par co-culture globules avec les cellules cancéreuses. (C) les Images des cellules après 14 jours de culture en absence ou en présence d’une drogue antitumorale (évérolimus). Grossissement de 10 X ; barre d’échelle est 400 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Modèle de co-culture. Schéma du modèle et de ses analyses en aval possibles et les futures applications. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Des modèles précliniques in vitro étudie les mécanismes de la diaphonie entre les cellules cancéreuses et les cellules osseuses sont nécessaires pour identifier les mécanismes de la métastase osseuse qui peut être utilisé pour créer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nous avons développé un modèle entièrement humain in vitro d’osteoclastogenesis de sang périphérique humain (Figure 3). Lors de l’optimisation de la méthodologie, un certain nombre de points critiques ont été identifié et résolu. La première concerne la quantité de cellules mononucléaires aux semences. Le nombre de cellules obtenues par le comte de microscope est seulement une quantification approximative, car il est difficile d’établir une distinction entre les lymphocytes et les monocytes, ces derniers étant les cellules cibles aux semences pour l’expérience osteoclastogenesis. Nous avons pu identifier les monocytes car les lymphocytes n’adhèrent pas au substrat en plastique et donc la majorité a été éliminée au premier changement de milieu. Les cellules ont été injectées à une densité élevée, comme il est essentiel pour les cellules pouvoir interagir avec eux à la différenciation, surtout dans la deuxième phase du osteoclastogenesis dans lequel les ostéoclastes doivent être rapprochés afin de fusionner et de devenir ostéoclastes matures. Un autre problème se pose lorsqu’il y a plusieurs conditions expérimentales car celles-ci nécessitent un nombre élevé de cellules et une grande quantité de sang. Une solution possible est d’utiliser des manteaux buffy qui ont une forte concentration de PBMC, par exemple, 4 x 10,5-6 x 106 cellules mononucléaires sont normalement collectées auprès d’un échantillon de couche leuco-plaquettaire de 50 mL par rapport à moins de 1 x 105 PBMC prélevés dans un échantillon de 20 mL de sang.

Comme les échantillons de sang ont été prélevés à différents bénévoles, il y avait une certaine variabilité dans l’essai d’osteoclastogenesis. Il était donc important d’effectuer chaque dosage avec au moins 3-4 répétitions techniques. Réplicats biologiques étaient aussi nécessaires, et que différents donneurs sains ont été utilisés, on n’a pas normalement calculé la moyenne des valeurs obtenues par les différentes expériences. Nous nous sommes assurés que les tendances des différents tests sont équivalents et ensuite choisi une expérience parmi les donneurs sains à inclure dans le manuscrit.

Notre modèle préclinique implique la co-culture de monocytes subissant la différenciation avec les cellules cancéreuses. Comme nous l’a montré précédemment, les cellules cancéreuses peuvent soutenir également in vitro osteoclastogenesis12,,13. Ce système peut être utilisé pour tester des médicaments ou pour étudier les mécanismes d’interaction, tel qu’il est possible d’effectuer plusieurs analyses en aval sur les cellules cancéreuses et les ostéoclastes. En fait, il est possible d’effectuer des tests de prolifération sur les cellules cancéreuses et gene expression analyses/Western blot des essais sur les deux cellules et ostéoclastes de cancer13. Il serait intéressant de comprendre comment sécrètent des protéines diffèrent dans les différentes conditions. Notre modèle a un certain nombre d’avantages, par exemple, c’est un modèle entièrement humain qui ne repose pas sur des lignées de cellules murines, contrairement à plusieurs modèles rapportées dans la littérature. Le modèle est également assez robustes et reproductibles et peut être utilisé à d’autres fins. Par exemple, les autres lignées de cellules cancéreuses peuvent être co cultivées avec les ostéoclastes et la différence de leur pouvoir osteoclastogenic a étudié. En outre, ce système permet d’évaluer d’autres mécanismes physiologiques ou pathologiques pour améliorer notre compréhension de la biologie osseuse et maladies médiée par les ostéoclastes, comme l’ostéoporose. Autres types de cytokines et de cellules peuvent également être cultivés conjointement avec les ostéoclastes selon le but de l’expérience.

Plusieurs analyses en aval sont possibles avec ce modèle. Il est important de décider au cours de la phase de conception de l’étude des analyses seront réalisées afin qu’un nombre suffisant de puits peut être semé.

Dosages en aval avec les ostéoclastes :

(i) analyses d’expression génique. Plan des puits supplémentaires des ostéoclastes pour extraire l’ARN total, comme les puits colorés pour évaluation piège ne sont pas disponibles pour l’extraction de l’ARN. (ii) Western blot des analyses. (iii) quantification de la surface d’ostéoclastes. Taille des ostéoclastes est un paramètre pour la maturation des ostéoclastes et peut être quantifiée à l’aide de logiciels open source comme ImageJ.

Dosages en aval avec les cellules cancéreuses :

(i) des tests de prolifération comme les 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide MTT. (ii) analyses d’expression génique. (iii) Western blot des analyses.

Dosages en aval avec les ostéoclastes et les cellules cancéreuses (co-culture) :

Les ostéoclastes et les cellules cancéreuses partageant le même milieu de culture, leur interaction peut être étudiée avec le test ELISA sécrétée de laquelle analyzesthe la sécrétion de cytokines spécifiques, GFs et d’autres protéines.

Le développement de ce modèle a été crucial pour notre projet et nous avons l’intention d’améliorer dans un avenir proche. Une avancée majeure consisterait à différencier les monocytes en échafaudages 3D minéralisées collagène de la matrice osseuse mimic. Il serait alors possible d’évaluer directement l’activité avec un dosage de la résorption osseuse ostéoclastique. Alors que nous continuons à en savoir plus sur les divers rôles joués par les ostéoclastes en traitement physiologique et pathologique allant de remodelage osseux pour réglementer les métastases osseuses, notre modèle permettra aux chercheurs d’isoler et d’étudier les ostéoclastes in vitro .

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Yibin Kang pour la fourniture de la lignée cellulaire de sep2 et Cristiano Verna pour aide à la rédaction.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
αMEM Euroclone BE12-169F
Glutamine Life-technologies ECB3000D
Fetal bovine serum Life-technologies ECS0180DPR
hMCSF Peprotech 300-25 Storage indications must be respected
hRANKL Peprotech 310-01 Storage indications must be respected
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit Sigma Aldrich 387 A
Lymphocyte separation media Biowest L0560-100
Red Blood cell lysing buffer SIgma 11814389001
ROCHE
Trypsin EuroClone COD.
ECB3052D
Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade Electron Microscopy Sciences 157-4-100
MDA-MB-231 cell line ATCC CRM-HTB-267
MCF7 ATCC HTB-22
Transwell Corning 3470-Clear These inserts are for 24-well plates;
6.5 mm, 0.4 μM;
pore size

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References

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Recherche sur le cancer question 127 osteoclastogenesis cellules cancéreuses co-cultures RANKL MCSF OS métastase in vitro modèle préclinique humain
Développement d’un humain modèle préclinique de Osteoclastogenesis de Monocytes du sang périphérique conjointement mis en culture avec des lignées cellulaires de Cancer du sein
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Mercatali, L., Spadazzi, C.,… More

Mercatali, L., Spadazzi, C., Miserocchi, G., Liverani, C., De Vita, A., Bongiovanni, A., Recine, F., Amadori, D., Ibrahim, T. Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (127), e56311, doi:10.3791/56311 (2017).

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