Summary
높은 처리량 시퀀싱 (ATAC-seq)와 결합 하 여 염색 하는 Transposase 액세스할 수 질에 대 한 분석 결과 액세스할 수 chromatin를 폭로 하는 게놈 넓은 방법입니다. 이 인간의 세포 (Th1/Th2)에 최적화 된 최종 계산 분석, 분자에서 단계별 ATAC seq 프로토콜입니다. 이 프로토콜 차세대 시퀀싱 방법 사전 경험 없이 연구자에 의해 채택 될 수 있다.
Abstract
높은 처리량 시퀀싱 (ATAC-seq) Transposase 액세스할 수 Chromatin에 대 한 분석 결과 chromatin의 오픈 (액세스) 지역의 식별에 사용 되는 방법 이다. 이 지역 규제 DNA 요소를 (예를 들면, 발기인, 증강, 로커 스 제어 영역, 절연체) 요인 바인딩하는 전사를 나타냅니다. 매핑 액세스할 수 chromatin 프리 게놈에서 잠복 활성 규제 요소에 대 한 강력한 접근 이다. 이 정보는 관련 된 녹음 방송 요인의 네트워크 및 유전자 식 프로그램을 제어 하는 chromatin 구조의 메커니즘을 발견에 대 한 편견된 접근 역할을 합니다. ATAC seq는 DNase 강력 하 고 중요 한 대안이 나 과민 증 분석 다음-세대 시퀀싱 (DNase-seq)와 포 름 알 데히드 기반 격리 chromatin의 게놈 넓은 분석에 대 한 규제 요소 (시 키-seq)의 결합 내게 필요한 옵션을 micrococcal nuclease 민감한 사이트 (MNase-seq) nucleosome 위치 결정의 연속. 선물이 상세한 ATAC seq 프로토콜 최적화 된 인간의 기본 면역 세포 즉, CD4 + 세포 (T 도우미 1 (Th1) 및 Th2 세포). 이 포괄적인 프로토콜 셀 수확 시작 chromatin tagmentation, 다음-세대 시퀀싱에 대 한 샘플 준비의 분자 절차에 설명 합니다 그리고 또한 포함 하는 방법 및 전산 분석 하는 데 사용에 대 한 고려 사항 결과 해석 합니다. 또한, 시간과 비용을 절약 하기 위해 우리는 시퀀싱 전에 ATAC seq 라이브러리를 평가 하기 위해 품질 관리 측정을 소개 했다. 중요 한 것은,이 프로토콜에 원리 다른 인간의 면역 및 비 면역 1 차 셀 및 셀 라인에 그것의 적응을 수 있습니다. 이러한 지침은 다음-세대 시퀀싱 방법 숙달 되지 않은 실험실을 위한 또한 유용할 것 이다.
Introduction
ATAC seq1,2 규제3 오픈 chromatin 지역과 nucleosome 포지셔닝의 식별을 가능 하 게 하는 강력한 방법입니다. 이 정보는 위치, id, 및 녹음 방송 요인의 활동을 유추 적용 됩니다. Chromatin 구조 양적 변화를 측정 하기 위한 방법의 감도 chromatin 요인, RNA 중 합 효소 II1의 transcriptional 활동 뿐만 아니라 chromatin remodelers 및 한정자를 포함 하 여 활동의 연구 수 있습니다. 따라서 ATAC seq 모든 세포 유형의 관심에 transcriptional 규칙을 제어 하는 메커니즘을 해독에 대 한 강력 하 고 공평한 접근을 제공 합니다. 우리는 기본 인간의 Th1 및 Th2 세포 ATAC seq의 적응을 설명합니다.
ATAC seq에 활동적인 Tn5 transposase 어댑터 (즉, "tagmentation" 과정)1DNA의 태그와 차세대 시퀀싱 (NGS) 커플 DNA 파편에 대 한 어댑터 로드. PCR 증폭, 다음 결과 DNA 라이브러리는 다음-세대 시퀀싱 (그림 1)에 대 한 준비가 됩니다. 액세스할 수 chromatin의 우선 tagmentation는 ATAC seq 시퀀싱 읽기의 지역 농축의 분석에 의해 검출 된다.
짧은 실험 절차와 chromatin 접근성 및 DNase seq4, 시 키-seq5, MNase-seq6, 등 nucleosomal 위치를 측정 하기 위한 다른 방법에 상대적으로 더 적은 시작 물자에 대 한 요구는 여러 생물 학적 시스템 등 인간의 기본 셀1,7 및 임상 샘플8, 단 세포 유기 체9,10, 식물 과일 파리11에서에서 ATAC seq의 사용을 추진 , 그리고 다양 한 포유류12.
녹음 방송 요인 접근 가능한 loci에 바인딩되는 chromatin immunoprecipitation (칩) 뒤에 높은 처리량 DNA 시퀀싱 (ATAC seq 결합 또는 그들의 바인딩 시퀀스 모티프의 농축을 분석 하 여 발견 될 수 있다의 정체성 ChIP-seq). 이 방법은 마우스13조에 대 한 중요 한 계보 특정 녹음 방송 요인의 식별을 사용할 수 있습니다. ATAC seq의 공평 하 고 글로벌 자연 유기 체는 칩 분석에 대 한 항 체 등 시 약은 사용할 수 없습니다에 있는 유전자 규칙을 공부 하 고 있습니다. Cis진화 변화 예를 들어-두개골 신경 크레스트 셀에서 인간과 침팬지14, 초기 마우스 동안 규제 요소 발달 변화를 공부 하 여 규제 지역 확인 되었습니다 embryogenesis15, 단 세포 C. owzarzaki의 라이프 사이클 동안 규제에 변경9및 발기인 및 20 포유동물 종12에서 강화의 진화.
ATAC seq도 따라서 공개 변화 세포 인구에서 일반적으로 게놈 넓은 연구7,16evades는 단일 셀에 chromatin 접근성을 측정 하기 위한 수단이 되었습니다. 또한, ATAC seq DNA 샘플 드물다 질병 조건에서 규제 지역에서 발생 하는 변화를 공부 하 사용할 수 있습니다. ATAC seq 급성 골수성 백혈병 (AML)17 또는 Ras의 발병 기간 동안 규정에 변화를 공부 하는 예를 들어-발암11을 구동.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 절차의 바 Ilan 대학 기관 검토 위원회에 의해 승인 및 프로토콜 실험 승인 위원회에서 제공 하는 지침을 따릅니다.
1. 정화의 순진한 사람의 CD4 + 세포 및 T 도우미 1 (Th1), Th2 세포 분극
참고: 우리가 냉동된 인간 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)에서 시작 하는 절차를 설명 하는 여기. 첫 번째 단계는 CD4 + 세포 microbeads를 사용 하 여 격리 이루어져 있고 열 일반적으로 CD4 + 세포의 95% 보다 더 우리에 게. 그러나,이 단계는 각 실험실에서 기본 프로토콜에 따라 달라질 수 있습니다. T 세포 활성화와 양극 화에 대 한 프로토콜 Jenner 외에서 수정 된 (2009 년) 18. 절연의 CD4 + 세포 10 백만 PBMCs 제공에서 CD4 + 세포의 4-6 백만에 상승. 두 개의 플라스 크에 분할 Th1 아래 성장와 저조한 3-5 백만 Th1 및 Th2 세포 단지 1 주일 이내 조건 Th2 편광.
참고: 시작 하기 전에 4 ° c 원심 분리기 진정.
- (10 7 세포) 포함 하는 보충 1% 페니실린 스, 2 mM L-글루타민, 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 RPMI 매체의 10 mL 50 mL 튜브에. 500 x g 5 분 제거는 상쾌한에 centrifuge 고 보충된 RPMI 매체의 15 mL의 멸 균 25 mL 피 펫 셀 resuspend. T75 문화 플라스 크 (살 균 25 mL 피 펫)와 셀 전송.
2. 핵 격리
참고: ATAC seq 그대로 핵 하 여 수행 됩니다. 세포의 용 해 버퍼 포함 0.05 %nonylphenyl 폴 리 에틸렌 글리콜 기본 인간 Th1 및 Th2 세포에서 핵을 격리 하기 위한 보정 되었다 (참조 테이블의 재료/장비). 이 단계는 실험실 시 약 및 셀 보정 하는 것이 좋습니다. 부족 한 세제에서 그대로 세포의 과잉 이항 반응의 효율성을 줄인다. 세포 세포의 용 해 효율 셀의 총 수를 기준으로 핵 (trypan 블루 긍정적인 세포)의 수에 의해 결정 됩니다.
참고: 세포의 용 해 버퍼 (10 mM Tris HCl, pH 7.5, 10 m m NaCl, 3 m m MgCl 2)를 준비 합니다. 4 스윙 물통 회전자는 원심 분리기에 진정 ° C. 판 고정된 각도 원심 분리기 대신 스윙 양동이 원심 분리기에 셀 셀/핵 손실을 감소. 핵 또는 셀 손실, 삭제는 상쾌한 때에 신중 하 게 피펫으로 피하려고.
- 신선한 nonylphenyl 폴 리 에틸렌 글리콜 (0.05%의 최종 농도) 하 고 protease 억제제 (1 x의 최종 농도)을 사용 하기 전에 즉시 차가운 세포의 용 해 버퍼를 x 100. 얼음에 버퍼를 유지
3. 이항 반응
참고:이 단계에서 격리 된 핵은 알을 품을 간결한 Tn5 transposase (TDE1) 로드 NGS 시퀀싱에 대 한 어댑터와 함께. 활동적인 Tn5는 동시에 DNA를 조각 하 고 게놈 (tagmentation 프로세스)의 접근 가능한 지역으로 어댑터를 ligates. 핵 및 Tn5 transposase 사이의 비율은 액세스할 수 chromatin에서 우선 분열에 대 한 중요 합니다. 이 프로토콜은 100 μ 반응 볼륨에 100000 핵에 대 한 보정 됩니다. 그러나, 반응 확장할 수 있습니다.
- 37 열 통에 온도 설정 ° c.
- 1.5 mL microtube 전송 100000 핵.
- 부드럽게와 4 ° C에서 10 분 동안 500 x g에서 원심 분리기는 상쾌한 제거.
- 에 지정 된 표 1 핵 전위 반응 구성 요소를 추가.
- 부드러운 pipetting으로 resuspend.
- 부드러운 떨고 (500 rpm)와 함께 30 분 동안 37 ° C에서 열 통에 이항 반응을 품 어.
참고: DNA 정리 고체 상 가역 immobilization 구슬 19에 의해 수행 됩니다 (참조 테이블의 재료/장비) 또는 PCR 정화 열. 정리의 끝에, 10 mM Tris HCl, pH 8의 20 µ L에 DNA 파편을 elute. 차입 버퍼에 EDTA를 방지.
4. ATAC seq 라이브러리의 PCR 농축
참고:이 단계 삽입 어댑터 ATAC seq 라이브러리 즉, DNA 파편을 증폭 하는 목적 이다. 같은 차세대 시퀀싱 레인에서 여러 ATAC seq 라이브러리의 혼합 수 있도록 (" 멀티플렉싱 ") 사용 unindexed 모든 샘플에 대 한 입문서 1 (Ad1_noMx) 1와 다른 색인 (바코드) 뇌관 2 (광고 2.1-2.24) 각 샘플에 대 한 1. 뇌관 시퀀스 테이블의 재료/장비 보충된 제공 됩니다.
- 초기 PCR 증폭
참고: 뇌관 1 (Ad1_noMx) 및 뇌관 2 작업 농도 25 µ M. 모든 프라이 머는 25 µ m에서 100 µ M의 원래 재고 희석. PCR 반응의 모든, 뇌관 1 (Ad1_noMx) 및 인덱싱된 뇌관 2 중 하나만 사용 합니다.- 추가할 PCR 반응의 구성 요소에 지정 된 표 2로 살 균 PCR 튜브.
- 장소 PCR 열 cycler에 튜브와 표 3에 사이클링 조건을 사용 하 여 PCR 증폭을 수행.
- 추가 확대 주기의 수의 평가
참고: 추가 PCR 주기 수 도서관 조각 f의 충분 한 금액을 산출 해야 한다또는 성공적인 차세대 시퀀싱 실행, GC를 방지 하 고 바이어스 20 크기를 최소화 하는 동안. 최적의 라이브러리 단편 증폭에 필요한 PCR 주기 (N)의 수의 결심 정량 PCR (정량)에 의해 이루어집니다.- 희석 뇌관 1 (Ad1_noMx)과 2 (초기 라이브러리 증폭에 사용) 25 µ M에서 6.25 µ m.
- 표 4에서 제시 된 대로 광학 PCR 튜브 또는 접시에 구성 요소 추가.
- 정량 악기과 사이클에 지정 된 테이블 5.
- 추가 확대 주기 (N)의 필요한 수를 예상 하려면 x 축 및 y 축에 상대 형광 (RFU)에 주기 수 플롯.
- 추가 확대의 수 주기 (N)를 정량 반응에 고원에 도달 하는 사이클의 수의 1/3 이다. 그림 2는 RFU (두꺼운 녹색 선) ~ 2,350 상대 형광 단위, 정점에 도달 하는 3 개의 ATAC seq 라이브러리에 대 한 예제를 제공 합니다. 최대 금액 (783 RFU, y 축에 표시 된)의 1/3은 증폭 된다 PCR 주기 수 8 사이클 라이브러리 (빨간색과 파란색 증폭 곡선)의 두 및 9 PCR 주기 세 번째 라이브러리 (분홍색)에 해당.
- 최종 PCR 증폭
- PCR 반응의 나머지 45 µ L를 증폭. 증폭 반응 단계 4.1.2 열 cycler에서에서를 포함 하는 PCR 튜브를 놓습니다. 표 6에 설명 된 PCR 프로그램을 실행 합니다. 증폭 사이클 (N)의 이전 결정된 (단계 4.2.5) 번호를 사용 하 여.
5. ATAC Seq 라이브러리 선택 크기
참고: 우리의 경험, 증폭된 ATAC seq 라이브러리의 크기 선택 향상 차세대 시퀀싱 결과 그것에서 높은 분자량 도서관 파편을 제거 하기 때문에 최종 ATAC seq 라이브러리.
참고: 실 온 사용 하기 전에 30 분 따뜻한 자석 구슬 수.
신선한 70% 에탄올 nuclease 무료 물에 준비.
- 혼합 하 여 자석 구슬 resuspend.
- Nuclease 무료 물 ATAC seq 라이브러리 (단계 4.3.1에서에서 얻은)에 추가 하 고 최대 100 µ L를가지고.
- 추가 50 µ L (0.5 x) resuspended DNA 바인딩 자석 구슬 증폭된 라이브러리의 100 µ L의. 적어도 10 배를 위아래로 pipetting으로 혼합. 실 온에서 5 분에 대 한 샘플을 품 어. 필요한 경우, 신속 하 게는 microtubes 아래로 회전.
- 는 상쾌한 자석 구슬 구분 2 분에 대 한 적절 한 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓습니다. 2 분 후에 상쾌한 새로운 microtube 전송.
- Pipetting는 상쾌한의 볼륨을 측정 하 고 자석 구슬의 0.7 x를 추가 합니다. 10 번 이상 아래로 pipetting으로 믹스.
- 실 온에서 5 분을 품 어. 2 분에 대 한 마그네틱 스탠드에
- 후 2 분 외피는 상쾌한을 삭제 합니다. 추가 200 µ L 갓 만든 70% 에탄올 튜브 마그네틱 스탠드에 있는 동안 구슬 씻어.
- 계속 30에 대 한 자석에 microtube s 고 삭제 에탄올. 반복 단계 5.7.for 2 개의 최종 에탄올 세척.
- 완전히 제거 나머지 에탄올 튜브 자석에은 구슬 5 분 동안 건조 하자. 필요한 경우, 짧게는 microtube 스핀. P10 피 펫 팁과 에탄올의 흔적 제거.
- 자석에서는 microtube를 제거 하 고 22 µ L 10 mM Tris HCl, pH 8의 추가. EDTA를 포함 하는 버퍼에서 ATAC seq 라이브러리 elute 하지 마십시오.
- 실 온에서 2 분 동안 튜브를 품 어 그리고 마그네틱 스탠드에 장소.
- 솔루션은 분명 때 새로운 살 균 microtube eluted 라이브러리의 20 µ L 전송.
- 저장소 크기 선택 ATAC seq 라이브러리-20에 ° c.
6. ATAC Seq 라이브러리의 품질 분석
- 실시간 PCR에 의해 ATAC seq 라이브러리의 품질의 유효성 검사
참고: 신호 대 소음 비의 다음-세대 이전 ATAC seq 라이브러리를 평가 하는 것이 중요 하다 시퀀싱. 이렇게 양이 많은 PCR (정량)를 사용 하 여 접근 가능 하 고 액세스할 수 loci에서 DNA 파편의 상대적인 양을 결정 합니다. 액세스할 수 없는 loci (부정적인 제어, chr1:48, 137, 860-48,137,934 및 chr1:193, 093, 748-193,093,827) 뇌관 쌍 1와 2에 의해 증폭 됩니다. 액세스 가능한 loci (긍정적인 제어, chr19:30, 336, 166-30,336,253와 chr19:11546154-11546237) 뇌관 쌍 3와 4에 의해 증폭 됩니다. 긍정적이 고 부정적인 loci 인간의 CD4 + 세포 (인코딩 accessions ENCSR000EQE 및 ENCSR000EQG)의 chromatin 접근성 (국토 안보 부-seq) 프로필에서 정의 되었다. 네거티브 뇌관 1 큰 heterochromatic intergenic 지역 (230 kb TRADB2와 FOXD2에서 88 킬로바이트)에 위치 해 있습니다. 부정적인 통제 지역 2 CDC73 유전자의 첫 번째 intron 이내입니다. 뇌관 쌍 3는 오픈 chromatin 지역 내 긍정적인 긍정적인 뇌관 쌍 4 동안 E (CCNE1) 유전자의 하류 중심 이다 단백질 키 니 아 제 C 기판 80 K-H (PRKCSH)의 발기인 내. 중요 한 것은, 이러한 제어 loci 인코딩 프로젝트 3에서 그들은 광범위 한 종류의 인간 세포에서에서 ATAC seq 라이브러리 모니터링에 적용할 수 있는 제안 다른 인간 세포 종류에 접근의 유사한 패턴을 표시 합니다. 뇌관 효율성과 모든 뇌관 쌍의 특이성은 정량 (인간의 Th 세포)에서 게놈 DNA의 직렬 희석 및 획득된 증폭된 제품의 녹는 곡선 분석에 의해 확인 했습니다.- 게놈 DNA를 상업적으로 사용할 수를 사용 하 여 격리 (참조 테이블의 재료/장비) 키트.
- 증폭된 ATAC seq 희석 도서관 1:10 (1 µ L 도서관 + nuclease 무료 물 9 µ L)와 ~ 5 ng / µ L을 genomic DNA.
- 반응 혼합물 (표 7) 3 중에서 반응을 수행 하는 계정으로 각 긍정적이 고 부정적인 제어 뇌관 쌍에 대 한 준비.
- 정량 마스터 혼합 공급 업체에서 권장 하는 프로토콜에 따라 정량 Pcr 열 cycler에서 품.
- 분석 정량 악기에 결과 ' s 소프트웨어 (테이블의 재료/장비 참조). 컨트롤 샘플으로 게놈 DNA를 선택 합니다. 얻은 값 액세스할 수 영역 (긍정적인 제어 뇌관에 의해 증폭)의 농축을 나타냅니다. 예를 들어 표 8에 표시 됩니다.
참고: 평균 라이브러리 크기와 농도의 추정: ATAC seq 라이브러리에서 DNA 파편의 크기 분포는 제조 업체에 따라 높은 감도 자동된 전기 영동 시스템에 의해 결정 됩니다 ' s 지시. 그것은 dsDNA 고감도 키트 및 각 DNA 샘플의 2 µ L를 사용 하 여 fluorometer에 샘플 농도 측정 하는 것이 좋습니다.
참고: 다음-세대 시퀀싱-수식을 사용 하 여 각 ATAC seq 라이브러리의 몰 라이브러리 멀티플렉싱, 이전 계산: (ng / µ L x 10 6) / (평균 라이브러리 x 660 조각 길이). 목표로 > 오픈 chromatin를 평가 하기 위해 각 ATAC seq 라이브러리의 30 백만 읽기 인간의 샘플의 영역입니다. 라이브러리 NGS 시퀀싱을 위해 충분히 좋은 인지 확인 하려는 경우 처음 10 백만 ~ 읽기 (빠른 실행된 모드에서 DNA 시퀀싱 장비에서 시퀀싱 레인의 5%)을 목표로 합니다. 유추 nucleosome 위치, 쌍-엔드 시퀀싱은 필요 1.
7. 얻은 다음-세대 시퀀싱 결과 분석
- 별도로 모든 라이브러리에 대 한 FastQC 파일을 검사 하 여 시퀀싱 읽기의 품질을 유추할.
- 는 Bowtie 21 소프트웨어를 사용 하 여 유닉스/리눅스 환경에서 인간의 참조 게놈 (hg19 어셈블리)을 읽기를 맞춥니다. 명령은 ' bowtie-m 1-q-S 게놈 디렉터리 reads.fastq output_aligned.sam '. 게놈 디렉터리 Bowtie의 게놈 인덱스 저장 되는 폴더에 대 한 의미 합니다. 매개 변수-m 1의 게놈에 있는 하나 이상의 장소에 맞춤을 허용 하지입니다-q fastq 형식 이어야 하는 입력된 파일에 대 한,-S는 샘 형식 출력.
- 중복 읽기 SAMtools 22 rmdup 옵션을 사용 하 여 유닉스/리눅스 환경에서 제거 합니다. 명령은 ' samtools 볼-S output_aligned.sam b | samtools 정렬-o-output_aligned > output_aligned.bam ',
samtools rmdup-s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam '. 첫 번째 명령은, 보기, 정렬 다음 BAM 형식으로 샘 포맷을 변경 합니다. Rmdup 옵션이 정렬 된 BAM 파일에 적용 됩니다. 원래 ATAC seq 종이 1에 설명 된 대로 필요에 따라 하나 transposon 삽입 사이트에 대 한 읽기를 조정할 수 있습니다. 이렇게 BEDtools를 사용 하 여 명령 유닉스/리눅스 환경에서 23. 명령은 ' bamToBed-i output_aligned _rmdup.bam > output_aligned _rmdup.bed ', ' shiftBed-i output_aligned _rmdup.bed-p 4 m-5-g 게놈 > output_aligned _rmdup_adjusted.bed '. 첫 번째 명령은, bamTobed, shiftBed 명령에 대 한 사용할 수 있는 침대 형식으로 BAM 포맷을 변경 합니다. 게놈 파일은 게놈에 있는 각 염색체의 길이 포함 하는 탭 구분된 파일이입니다. 파일은 일반적으로 BEDtools 디렉터리에 추가 됩니다. - 수행 피크 전화 칩 seq (MACS2) 24 소프트웨어의 모델 기반 분석을 사용 하 여 다음 매개 변수는 이동된 침대 파일에 유닉스/리눅스 환경에서:-nomodel-extsize-75-30을 이동. 이러한 매개 변수는 transposon 삽입 사이트는 각 연속 읽기는 읽기를 조정 하는 데 사용 됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 프로토콜의 최종 결과 일반적으로 3 ~ 20 ng / µ L의 ATAC seq 라이브러리입니다. DNA 무결성 분석 시스템에서 실행할 때 (참조 테이블의 재료/장비), 그들은 쇼 사다리 같은 모습2 (그림 3A). DNA 파편의 평균 크기는 일반적으로 ~ 450 530 혈압.
차세대 시퀀싱을 수행 하기 전에 ATAC seq 라이브러리의 적절 한 품질 관리는 시간과 돈을 절약 해야 합니다. 우리 때는 라이브러리 차세대 시퀀싱 (NGS)에 대 한 적합 한 긍정적인 컨트롤의 농축은 이상 25-그리고 75 배 (뇌관을 위한 쌍 3, 4, 각각) 부정적인 컨트롤 (그림 3B)을 기준으로 하 고 표시 하는 경우는 이전에 nucleosomal, 사다리 모양의 외관 언급. 정량 데이터를 분석할 때 우리 또한 확인 하는 부정적이 고 긍정적인 제어 뇌관의 Cq 값은 템플릿으로 genomic DNA와 반응에 유사 하는 Cq (ATAC seq DNA와 반응에에서 부정적인 제어 영역에 대 한 값 조각)는 실험. 사이 일정 예를 들어 갑자기 낮은 Cq 값의 경우 우리는 핵-전치 이었고 따라서 섬으로 지역에서 발생 하는 DNA 파편-대표 용의자. 또한, ATAC seq 라이브러리 (고감도 테이프 기반 전기 이동 법에 의해 얻은) 젤 이미지는 어댑터의 존재를 표시 하는 경우 (~ 120 bp), 과도 한 DNA 저하 (파편의 대부분은 ~ 200 bp), 또는 큰 조각 (1kb 이상), 우리 NGS 단계에 계속할 것입니다.
또한, 우리는 항상 초기 NGS는 우리가 라이브러리 당 10 백만 읽기에 대 한 목표를 수행 합니다. 라이브러리는 더 깊이 시퀀싱이 시퀀싱 결과 만족 (샘플 FastQC 보고서 파일에서 모든 매개 변수를 전달 하 고 우리가 피크 호출을 수행한 후 1000-2000 봉우리를 얻을 수 있다) 인 경우 (30 백만 이상 읽기/ATAC-seq 도서관).
ATAC seq에 실험 포유류 세포에 어디에서 ~ 시퀀스 읽기의 30-70%는 mtDNA10에서 올 수 있다. 반면, 우리의 라이브러리 포함 6-20% 읽기 미토 콘 드리 아 게놈에 매핑됩니다. 이 인간의 CD4 + T 림프 톨1에서 ATAC seq 라이브러리에 46%를 보고 보다 낮습니다. 이러한 읽기 오염 제거, 후 우리 백만 ~ 7-32 독특한 읽기 참조 인간 게놈 (58-91%의 모든 읽기)에 남았다. 이 0.1-2 백만 읽기 (6.8%-12%의 모든 읽기) ATAC seq 봉우리 (그림 4)에 있었다.
그림 1 . 실험 단계 워크플로입니다. 주요 표현이 ATAC seq 프로토콜 단계. 중지 포인트는 노란색 육각형으로 표시 됩니다. 옵션 단계는 오렌지 육각형으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . PCR 주기 ATAC seq 라이브러리의 최종 농축에 필요한 추가 수의 계산. 3 다른 ATAC seq 라이브러리에 대 한 PCR 증폭 곡선 레드, 블루와 핑크에 표시 됩니다. 증폭 반응 2,350 RFU (위 녹색 가로줄)에 고원에 도달. 추가 PCR 주기 수 증폭 곡선에 783 RFU (2,350/3)와 교차합니다. 세 번째 라이브러리 (핑크) 9 주기를 요구 하는 동안 두 개의 라이브러리 (빨간색과 파란색) 8 추가 확대 사이클 필요 합니다. 비-템플릿 컨트롤 (NTC)는 낮은 녹색 선으로 표시 됩니다. X 축, 주기 수 Y-축, RFU 단위 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . ATAC seq 라이브러리의 품질 관리 분석. 테이프 기반 자동화 된 전기 이동 법의 증폭된 ATAC seq 라이브러리의 (A) 결과. L, 사다리; A-D, 생물의 라이브러리는 Th1 및 Th2 세포에서 반복 됩니다. (B) 정량 품질 관리 분석 ATAC seq 라이브러리. 게놈 DNA 및 4 개의 ATAC seq 라이브러리 부정적인 제어 뇌관 쌍 (1 및 2) 및 (3, 4) 긍정적인 제어 뇌관에 의해 증폭 되었다. ATAC seq 라이브러리 (블루)에 대 한 획득된 값 했다 게놈 DNA의 증폭 수준으로 정규화 처음 (1;의 값으로 임의로 설정 빨간색). 그 후, 긍정적인 통제 지역에 대 한 값 했다 부정적인 제어 영역 (낮은 차트)로 정규화 됩니다. # 1과 #2 라이브러리 NGS 시퀀싱에 보내졌다. 값은 평균 ± SEM. 나타냅니다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 게놈 브라우저 snapsh Th1 및 Th2 세포에서 액세스할 수 있는 염색 질 영역의 ots. ATAC seq 트랙, NFKB1, 6 월, CD28, IL4 IFNG (Th1만 표현) 및 IL13 (Th2만 표현) loci Th1 및 Th2 세포 (두 생물 각 반복)에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| TD 버퍼 | 50 | Μ |
| TDE1 transposase | 5 | Μ |
| Nuclease 무료 물 | 45 | Μ |
| 총 볼륨 | 100 | Μ |
표 1: 전위 반응 혼합물의 준비.
| ATAC seq 라이브러리 | 15 | Μ |
| 뇌관 1 (Ad1_noMx) * | 2.5 | Μ |
표 2: 초기 PCR 반응 혼합 (단계 5.1.1.)의 구성 요소.
| 사이클 단계 | 온도 | 시간 | 사이클 |
| 확장 * | 72 ° C | 5 분 | 1 |
| 초기 변성 | 98 ° C | 30 s | |
| 변성 | 98 ° C | 10 s | 5 |
| 어 닐 링 | 63 ° C | 30 s | |
| 확장 | 72 ° C | 3 분 | |
| 보류 | 4 ° C | ∞ | |
| *이 단계 둘 다 확장 하는 데 필요한 | |||
| 이항 반응 후 뇌관의 끝입니다. | |||
표 3: 초기 라이브러리 증폭 (단계 5.1.2)에 대 한 PCR 순환 조건
| PCR 반응 (단계 4.1.1)의 aliquot * | 5 | Μ |
| 뇌관 1 (Ad1_noMx) * * | 1 | Μ |
| 뇌관 2 | 1 | Μ |
| 2 x SYBR 마스터 믹스 * * * | 7.5 | Μ |
| Nuclease 무료 물 | 0.5 | Μ |
| 총 볼륨 | 15 | Μ |
| * DNA 서식 파일 대신 서식 파일 비 제어를 위한 매우 순수한 물을 추가 합니다. | ||
| * * 각 뇌관의 최종 농도 417 nM. | ||
| 기본 마스터 믹스를 사용 하 여 정량에 대 한. | ||
| 그것은 중 합 효소, dNTPs, MgCl2및 형광 염료를 포함 해야 합니다. | ||
표 4: 정량 Pcr 반응 혼합물 (5.2.2 단계) 준비 합니다.
| 사이클 단계 | 온도 | 시간 | 사이클 |
| 초기 변성 | 98 ° C | 30 s | 1 |
| 변성 | 98 ° C | 10 s | 20 |
| 어 닐 링 | 63 ° C | 30 s | |
| 확장 | 72 ° C | 3 분 | |
| 보류 | 4 ° C | ∞ |
표 5: 사이클링 증폭 주기의 (N) (단계 5.2.3.) 추가 수의 정량 기반 평가 대 한 조건
| 사이클 단계 | 온도 | 시간 | 사이클 |
| 초기 변성 | 98 ° C | 30 s | 1 |
| 변성 | 98 ° C | 10 s | N |
| 어 닐 링 | 63 ° C | 30 s | |
| 확장 | 72 ° C | 3 분 | |
| 보류 | 4 ° C | ∞ |
표 6: 사이클링 최종 PCR 농축 단계 (단계 5.3.)에 대 한 조건.
| 단일 PCR 반응: | ||
| 게놈 DNA의 라이브러리의 희석 | 2.5 | Μ |
| 10 μ M 뇌관 F (F1 또는 F2 또는 F3 또는 F4) * | 0.3 | Μ |
| 10 μ M 뇌관 R (R1 R2 또는 r 3 또는 r 4) * * | 0.3 | Μ |
| 2 x SYBR 마스터 믹스 * * * | 5 | Μ |
| Nuclease 무료 물 | 1.9 | Μ |
| 총 볼륨 | 10 | Μ |
| * 반응 혼합물에서 각 뇌관의 최종 농도 300 nM. | ||
| * * 사용 하 경우 뇌관 F1 보다 R 뇌관 r 1 등 이어야 한다. | ||
| 사용 선호 마스터 믹스 x 2 실험실에서 정량 악기에 적합. | ||
표 7: QC 분석 (단계 7.1.3.)에 대 한 반응 조건.
| 대상 | 샘플 | Cq를 의미 | Cq SEM | 상대 수량 | 정규화 | |
| 1 | 음의 제어 | ATAC seq | 30.39 | 0.11 | 1 | 1.01 |
| gDNA | 30.4 | 0.16 | 0.99 | 1 | ||
| 2 | ATAC seq | 30.3 | 0.18 | 1 | 1 | |
| gDNA | 30.34 | 0.09 | 0.99 | 1 | ||
| 3 | 긍정적인 통제 | ATAC seq | 23.27 | 0.03 | 1 | 173.14 |
| gDNA | 30.7 | 0.06 | 0.01 | 1 | ||
| 4 | ATAC seq | 21.55 | 0.24 | 1 | 750.31 | |
표 8: 긍정적인 통제 부정적인 컨트롤 (단계 7.1.5.)의 농축의 계산.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기에 설명 된 ATAC seq 프로토콜은 성공적으로 고용 되었다 액세스할 수 chromatin의 분석에 대 한 1 차 셀에서 (인간의 Th1, Th2 세포와 B 세포) 교양된 셀 라인 (MCF10A 인간의 유방암 세포와 U261 세포종 세포) 뿐만 아니라. 다른 세포 유형 ATAC seq 적용 일부 프로토콜 최적화, 특히 세포 단계에서에서 필요할 수 있습니다. 비 이온 세제의 농도가 너무 높은 경우에, 높은 비율의 미토 콘 드리 아 DNA 오염 수 있습니다. 이 핵 수확량을 감소 하지 않고 세포의 용 해 버퍼에 세제 농도 감소 하 여 줄일 수 있습니다. 우리의 경험에서는, 세포의 용 해 버퍼 세제의 0.05%를 가장 만족 스러운 결과 주었다. 또한, 고정된 각으로 터 펠 릿에 미토 콘 드리 아 감소 500 G 힘을 감소 허용 대신 스윙 양동이에 핵 회전. 연구원은 또한 세제, 예를 들어 digitonin17의 다른 종류를 테스트할 수 있습니다. 그러나, 최적화 된 세포의 용 해 조건, 함께 mtDNA 오염 불가피 하다. mtDNA를 완전히 제거 하려면 CRISPR/Cas9 시스템 사용된15수 있습니다. 이 경우에, ATAC seq 라이브러리 대상 mtDNA 및 mtDNA15소화 Cas9 nuclease sgRNAs와 알을 품는.
핵이 ATAC seq 프로토콜 (100000)에 필요한 수 임상 견본에서 휴대폰 번호 부족7경우에 제한 될 수 있습니다. ATAC seq는 성공적으로 조절 되었을 5000와 500 셀1,,1317 반응 볼륨1,13, 줄여 열 대신 자석 구슬 정리 수행 13또는 정리 단계1을 방지. 또한, 단일 셀 ATAC-seq (scATAC-seq) 개별 핵16분리 미세 장치를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 특히, DNase seq 등 시 키-seq, chromatin 접근성을 측정 하기 위한 다른 방법 시작 더 많은 자료와 실험을 수행 하기 위해 몇 일 필요로 합니다.
널리 다양 한 NGS 방법으로 바이어스는 일반적인 현상25감사 지금 된다. 다른 chromatin 접근성 대책에 변화에 대 한 원인 중 하나는 효소 분열 단계25입니다. 그것은 분열 바이어스26 를 보여줍니다 DNase 그리고 지금 그것은 Tn5 transposase 분열 특혜 뿐만 아니라27표시 인식 표시 되었습니다. 다행히도, 잠재적인 바이어스 ChiLin28등 품질 관리 파이프라인을 사용 하 여 계산을 통해 확인할 수 있습니다. 또 다른 일반적인 소스 바이어스의 PCR 증폭 단계20,25입니다. 이 자주 GC-리치의 증폭에 대 한 편견25조각으로 명시 한다. 바이어스 모든 PCR 증폭 단계 증가, 이후 우리 ATAC seq 라이브러리의 최종 PCR 증폭에 9 추가 사이클 (N)을 초과 하지 마십시오.
Tn5 transposase와 핵 사이의 적절 한 비율은 성공적 ATAC seq2중요 합니다. 효소의 과잉 "이항" 통해 액세스할 loci에 높은 백그라운드 이어질 것 이다. 이 높은 증폭 정량 품질 관리 단계에서 부정적인 제어 영역에에서 반영 됩니다. 핵의 초과 "아래 이항"으로 이어질 것 이다. 이 경우에, 너무 먼 분열 사이트 적은 PCR 증폭 조각과 복잡 한 낮은 라이브러리 발생 합니다. 핵의 수를 정확 하 게 확인 하려면 우리 추가 세 단계를 도입 하는 세포 세포의 용 해 후와 이항 반응 전에.
Chromatin 접근성은 그것 게놈의 특정 위치에 전사 레 귤 레이 터의 활동을 허락 한 중요 한 후 규제 계층입니다. 따라서, 접근 chromatin 프로필 내에서 DNA 시퀀스 풍부한을 가능한 녹음 방송 요인의 수만의 정체성과 대상 loci에 대 한 정보를 제공합니다. 이 정보는 RNA 식 프로필 (ATAC seq에 의해 얻은) 결합 칩 seq13,22에 의해 더 분석 될 수 있는 관련 된 녹음 방송 요인에 초점을 수 있습니다. 또한, 동 질 다 상 질병에 연결의 10%만 코딩 게놈30에 있습니다. 따라서 임상 샘플 ATAC seq를 적용 비 코딩 변종의 규제 요소는 질병 상태 (예를 들어 반성 루 푸8) 유전자 규칙에 영향을 미칠 수 있습니다 하는 것을 밝힐 수 있다. 하겠습니다이 ATAC seq 프로토콜 도움이 되며 관심이 수 사관이 강력한 메서드를 사용 하 여 그들의 연구를 하는 것이 좋습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 이스라엘 과학 재단 (그랜트 748/14) 지원, 마리 퀴리 통합 부여 (CIG)-FP7 명 20013 CIG 618763와 난 코어 프로그램의 계획 및 예산 위원회와 이스라엘 과학 재단 부여 번호 41/11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL tubes | Lumitron | LUM-CFT011500-P | Can be from other vendors. |
| Microtubes | Axygen Inc | MCT-175-C | Can be from other vendors. |
| 25 mL serological pipettes | Corning Costar | 4489 | Can be from other vendors. |
| Tissue culture flask | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | Can be from other vendors. |
| Countes Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| NucleoSpin Tissue | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
| Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) | ATCC | PCS800011 | Can be from other vendors. |
| RPMI 1640 Medium | Biological Industries | 01-103-1A | Can be from other vendors. |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Biological Industries | 03-020-1B | Can be from other vendors. |
| Penicillin-Streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | Can be from other vendors. |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade | Biological Industries | 04-127-1 | Can be from other vendors. |
| MACS CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Human CD4 FITC | Biogems | 06121-50 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control FITC | Biogems | 44212-50 | |
| Anti-Human CD3 (OKT3) | Tonbo biosciences | 40-0037 | |
| Anti-Human CD28 SAFIRE Purified | Biogems | 10311-25 | |
| Recombinant Human IL2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL4 | Peprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human IL12 p70 | Peprotech | 200-12 | |
| In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
| LEAF Purified anti-human IFN-γ | BioLegend | 506513 | |
| NaCl, analytical grade | Carlo Erba | 479687 | Can be from other vendors. |
| Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade | Calbiochem | 442611 | Can be from other vendors. |
| EDTA | MP Biomedicals | 800682 | Can be from other vendors. |
| Tris, ultra pure, 99.9% pure | MP Biomedicals | 819620 | Can be from other vendors. |
| NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol) | Calbiochem | 492016 | Can be from other vendors. |
| Protease Inhibitors | Sigma | P2714 | this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water. |
| Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads | Beckman | 63881 | |
| PCR purification kit | HyLabs | EX-GP200 | Can be from other vendors. |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer) | Illumina | FC-121-1030 | |
| NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 185-5200 | Can be from other vendors. |
| CFX Manager Software | Bio-rad | 1845000 | |
| master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5124 | Can be from other vendors. |
| Qubit fluorometer 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| Magnet for eppendorf tubes | Invitrogen | 12321D | Can be from other vendors. |
| Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes | Thermo Scientific | 75004527 | Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes. |
| Thermo-shaker | MRC | Can be from other vendors. | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| 4200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2991AA | Tape-based platform for electrophoresis |
| High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis |
| Primer name and sequence | Company | ||
| Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3' |
IDT | Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3' | |
| Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.1_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.2_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.3_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.4_TCCTGAGC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.4_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.5_GGACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.5_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.6_TAGGCATG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.6_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.7_CTCTCTAC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.7_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.8_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.9_GCTACGCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.9_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.10_CGAGGCTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.10_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.11_AAGAGGCA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.11_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.12_GTAGAGGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.12_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.13_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.14_ACCACTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.14_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.15_TGGATCTG: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.15_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.16_CCGTTTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.16_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.17_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.18_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.19_AGGTTGGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.19_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.20_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.21_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.22_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.23_TTGACCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.23_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.24_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3' | IDT | ||
| R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3' | IDT | ||
| F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3' | IDT | ||
| R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3' | IDT | ||
| F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3' | IDT | ||
| R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3' | IDT | ||
| F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3' | IDT | ||
| R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3' | IDT |
References
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Curr Protoc Mol Biol. , 21.29.1-21.29.9 (2015).
- Thurman, R. E., Rynes, E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
- Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2010).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
- Cui, K., Zhao, K. Genome-Wide Approaches to Determining Nucleosome Occupancy in Metazoans Using MNase-Seq. Methods Mol Biol. 833, 413-419 (2012).
- Qu, K., et al. Individuality and Variation of Personal Regulomes in Primary Human T Cells. Cell Syst. 1 (1), 51-61 (2015).
- Scharer, C. D., et al. ATAC-seq on biobanked specimens defines a unique chromatin accessibility structure in naïve SLE B cells. Sci Rep. 6, 27030 (2016).
- Sebé-Pedrós, A., et al. The Dynamic Regulatory Genome of Capsaspora and the Origin of Animal Multicellularity. Cell. 165 (5), 1224-1237 (2016).
- Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Res. 45 (6), e41 (2016).
- Davie, K., et al. Discovery of Transcription Factors and Regulatory Regions Driving In Vivo Tumor Development by ATAC-seq and FAIRE-seq Open Chromatin Profiling. PLOS Genet. 11 (2), (2015).
- Villar, D., et al. Enhancer Evolution across 20 Mammalian Species. Cell. 160 (3), 554-566 (2015).
- Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
- Prescott, S. L., et al. Enhancer Divergence and cis-Regulatory Evolution in the Human and Chimp Neural Crest. Cell. 163 (1), 68-83 (2015).
- Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nat Genet. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Jenner, R. G., et al. The transcription factors T-bet and GATA-3 control alternative pathways of T-cell differentiation through a shared set of target genes. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 17876-17881 (2009).
- DeAngelis, M. M., Wang, D. G., Hawkins, T. L. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Res. 23 (22), 4742-4743 (1995).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Biol. 12 (2), R18 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Meyer, C. A., Shirley Liu, X. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat Rev Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
- He, H. H., et al. Refined DNase-seq protocol and data analysis reveals intrinsic bias in transcription factor footprint identification. Nat Methods. 11 (1), 73-78 (2013).
- Madrigal, P. On Accounting for Sequence-Specific Bias in Genome-Wide Chromatin Accessibility Experiments: Recent Advances and Contradictions. Front Bioeng Biotechnol. 3, 1-4 (2015).
- Qin, Q., et al. ChiLin: a comprehensive ChIP-seq and DNase-seq quality control and analysis pipeline. BMC Bioinformatics. 17 (1), (2016).
- Bao, X., et al. A novel ATAC-seq approach reveals lineage-specific reinforcement of the open chromatin landscape via cooperation between BAF and p63. Genome Biol. 16 (1), 284 (2015).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
