Mapeamento de genoma-larga acessível cromatina em linfócitos T humana primária pela ATAC-Seq

Ivana Grbesa; Miriam Tannenbaum; Avital Sarusi-Portuguez; Michal Schwartz; Ofir Hakim

doi:10.3791/56313

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Artigo de método

Mapeamento de genoma-larga acessível cromatina em linfócitos T humana primária pela ATAC-Seq

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DOI:

10.3791/56313

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13 de novembro de 2017

Ivana Grbesa¹ , Miriam Tannenbaum¹ , Avital Sarusi-Portuguez¹ , Michal Schwartz¹ , Ofir Hakim¹

¹The Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University

Neste artigo

Resumo

Ensaio de cromatina Transposase-acessível, juntamente com o sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) é um método de todo o genoma para descobrir a cromatina acessível. Este é um protocolo de ATAC-seq passo a passo, de molecular para última análise computacional, otimizada para linfócitos humanos (Th1/Th2). Este protocolo pode ser adotado por pesquisadores sem experiência prévia em métodos de sequenciamento de próxima geração.

Resumo

Ensaio para cromatina Transposase-acessível com arranjar em sequência do elevado-throughput (ATAC-seq) é um método usado para a identificação das regiões (acessíveis) abertas da cromatina. Essas regiões representam DNA elementos reguladores (por exemplo,promotores, melhoradores, regiões de controle de locus, isoladores) ao qual transcrição fatores bind. Mapeamento da paisagem de cromatina acessível é uma poderosa abordagem para descobrir elementos reguladores ativos através do genoma. Esta informação serve como uma abordagem imparcial para descobrir a rede de fatores de transcrição relevantes e mecanismos da estrutura da cromatina que regem os programas de expressão do gene. ATAC-seq é uma alternativa robusta e sensível à DNase eu análise de hipersensibilidade juntamente com a próxima geração sequenciamento (DNase-seq) e formaldeído-assistida isolamento de elementos reguladores (FAIRE-seq) para análise de todo o genoma da cromatina acessibilidade e para o sequenciamento de micrococcal nuclease sensíveis sites (MNase-seq) para determinar o posicionamento do nucleossoma. Apresentamos um protocolo detalhado de ATAC-seq otimizado para humano imune primária células ou seja, CD4 + linfócitos (T helper 1 (Th1) e células Th2). Este protocolo abrangente começa com a colheita da pilha, em seguida, descreve o procedimento molecular da cromatina tagmentation, preparação de amostras para sequenciamento de nova geração e também inclui métodos e considerações para as análises computacionais utilizadas para interprete os resultados. Além disso, para economizar tempo e dinheiro, introduzimos as medidas de controlo de qualidade para avaliar a biblioteca ATAC-seq antes de sequenciamento. Importante, os princípios apresentados neste protocolo permitem sua adaptação ao outro humanas imunes e não imune primária as células e linhas celulares. Estas orientações também será útil para os laboratórios que não são proficientes com métodos de sequenciamento de próxima geração.

Introdução

ATAC-seq¹^,² é um método robusto que permite a identificação de regiões de cromatina aberta regulamentar³ e posicionamento nucleossoma. Esta informação é aplicada para inferir a localização, identidade e atividade de fatores de transcrição. Sensibilidade do método para a medição quantitativas variações na estrutura da cromatina permite o estudo da atividade dos fatores de cromatina, incluindo empresas de reestruturação da cromatina e modificadores, bem como a atividade transcricional do RNA polimerase II¹. Assim, ATAC-seq fornece uma abordagem poderosa e imparcial....