Mapeamento de genoma-larga acessível cromatina em linfócitos T humana primária pela ATAC-Seq
Summary
Ensaio de cromatina Transposase-acessível, juntamente com o sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) é um método de todo o genoma para descobrir a cromatina acessível. Este é um protocolo de ATAC-seq passo a passo, de molecular para última análise computacional, otimizada para linfócitos humanos (Th1/Th2). Este protocolo pode ser adotado por pesquisadores sem experiência prévia em métodos de sequenciamento de próxima geração.
Abstract
Ensaio para cromatina Transposase-acessível com arranjar em sequência do elevado-throughput (ATAC-seq) é um método usado para a identificação das regiões (acessíveis) abertas da cromatina. Essas regiões representam DNA elementos reguladores (por exemplo,promotores, melhoradores, regiões de controle de locus, isoladores) ao qual transcrição fatores bind. Mapeamento da paisagem de cromatina acessível é uma poderosa abordagem para descobrir elementos reguladores ativos através do genoma. Esta informação serve como uma abordagem imparcial para descobrir a rede de fatores de transcrição relevantes e mecanismos da estrutura da cromatina que regem os programas de expressão do gene. ATAC-seq é uma alternativa robusta e sensível à DNase eu análise de hipersensibilidade juntamente com a próxima geração sequenciamento (DNase-seq) e formaldeído-assistida isolamento de elementos reguladores (FAIRE-seq) para análise de todo o genoma da cromatina acessibilidade e para o sequenciamento de micrococcal nuclease sensíveis sites (MNase-seq) para determinar o posicionamento do nucleossoma. Apresentamos um protocolo detalhado de ATAC-seq otimizado para humano imune primária células ou seja, CD4 + linfócitos (T helper 1 (Th1) e células Th2). Este protocolo abrangente começa com a colheita da pilha, em seguida, descreve o procedimento molecular da cromatina tagmentation, preparação de amostras para sequenciamento de nova geração e também inclui métodos e considerações para as análises computacionais utilizadas para interprete os resultados. Além disso, para economizar tempo e dinheiro, introduzimos as medidas de controlo de qualidade para avaliar a biblioteca ATAC-seq antes de sequenciamento. Importante, os princípios apresentados neste protocolo permitem sua adaptação ao outro humanas imunes e não imune primária as células e linhas celulares. Estas orientações também será útil para os laboratórios que não são proficientes com métodos de sequenciamento de próxima geração.
Introduction
ATAC-seq1,2 é um método robusto que permite a identificação de regiões de cromatina aberta regulamentar3 e posicionamento nucleossoma. Esta informação é aplicada para inferir a localização, identidade e atividade de fatores de transcrição. Sensibilidade do método para a medição quantitativas variações na estrutura da cromatina permite o estudo da atividade dos fatores de cromatina, incluindo empresas de reestruturação da cromatina e modificadores, bem como a atividade transcricional do RNA polimerase II1. Assim, ATAC-seq fornece uma abordagem poderosa e imparcial para decifrar os mecanismos que regem o Regulamento transcriptional em qualquer tipo de célula de interesse. Descrevemos a adaptação da ATAC-seq para as células Th1 e Th2 humanas primárias.
Na ATAC-seq, hiperativo Tn5 transposase carregado com adaptadores para sequenciamento de próxima geração (NGS) fragmentação de DNA de casais com marcação de DNA com adaptadores (ou seja, o processo de “tagmentation”)1. Após amplificação por PCR, as bibliotecas de DNA resultantes estão prontas para a próxima geração sequenciamento (Figura 1). O tagmentation preferencial da cromatina acessível é detectado pela análise de enriquecimento local de leituras de sequenciamento ATAC-seq.
O procedimento experimental curto e exigência de menos matérias-primas, em relação a outros métodos para medir a acessibilidade da cromatina e posicionamento de partícula como de DNase-seq4, FAIRE-seq5e MNase-seq6, tem promoveu o uso de ATAC-seq em vários sistemas biológicos, incluindo células humanas primárias1,7 e amostras clínicas8, bem como organismos unicelulares9, plantas10, moscas de fruta11 e vários mamíferos12.
A identidade da transcrição de fatores que estão ligados a loci acessível podem ser descobertos por analisar o enriquecimento de seus motivos de sequência de ligação ou combinando ATAC-seq com imunoprecipitação da cromatina (ChIP) seguida de alta produtividade (de sequenciamento de DNA ChIP-seq). Essa abordagem permitiu a identificação de fatores de transcrição de linhagem-específicos importantes para hematopoiese em rato13. A natureza global e imparcial da ATAC-seq permite estudar a regulação gênica em organismos para os quais reagentes tais como anticorpos para análise de ChIP não estão disponíveis. Por exemplo, evolutivas variações no cis-regiões reguladoras foram identificadas pelo estudo craniana crista neural células de seres humanos e os chimpanzés14, variações do desenvolvimento em elementos reguladores durante o início do mouse embriogénese15, mudanças na paisagem regulamentar durante um ciclo de vida de unicelulares owzarzaki c.9e a evolução dos promotores e potenciadores em toda espécie de mamífero 2012.
ATAC-seq também tem sido fundamental para medir a acessibilidade de cromatina em células individuais, assim revelando variabilidade dentro das populações de células, que normalmente evita todo o genoma estudos7,16. Além disso, a ATAC-seq pode ser usado para estudar as mudanças que ocorrem em regiões reguladoras de DNA em condições de doença, em que as amostras são raras. Por exemplo, a ATAC-seq pode ser usado para estudar as mudanças na paisagem regulamentar durante o início da leucemia mieloide aguda (LMA)17 ou Ras-conduzido mixomas11.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo de ATAC-seq descrito aqui tem sido empregado com sucesso para a análise da cromatina acessível em células primárias (humano Th1, Th2 pilhas e pilhas de B) bem como as linhas de células cultivadas (células de câncer de mama humano MCF10A e células de glioblastoma U261). Aplicação de ATAC-seq para outros tipos de células pode exigir alguma otimização de protocolo, especialmente na etapa de Lise. Se a concentração de detergente não-iônico é muito alta, pode haver um maior percentual de contamin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pela Fundação de ciência de Israel (grant 748/14), Marie Curie integração conceder (CIG) – FP7-pessoas-20013-CIG-618763 e eu-núcleo programa de planejamento e orçamento do Comité e o Israel Science Foundation concedem n º 41/11.
Materials
| 50 mL tubes | Lumitron | LUM-CFT011500-P | Can be from other vendors. |
| Microtubes | Axygen Inc | MCT-175-C | Can be from other vendors. |
| 25 mL serological pipettes | Corning Costar | 4489 | Can be from other vendors. |
| Tissue culture flask | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | Can be from other vendors. |
| Countes Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| NucleoSpin Tissue | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
| Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) | ATCC | PCS800011 | Can be from other vendors. |
| RPMI 1640 Medium | Biological Industries | 01-103-1A | Can be from other vendors. |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Biological Industries | 03-020-1B | Can be from other vendors. |
| Penicillin-Streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | Can be from other vendors. |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade | Biological Industries | 04-127-1 | Can be from other vendors. |
| MACS CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Human CD4 FITC | Biogems | 06121-50 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control FITC | Biogems | 44212-50 | |
| Anti-Human CD3 (OKT3) | Tonbo biosciences | 40-0037 | |
| Anti-Human CD28 SAFIRE Purified | Biogems | 10311-25 | |
| Recombinant Human IL2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL4 | Peprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human IL12 p70 | Peprotech | 200-12 | |
| In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
| LEAF Purified anti-human IFN-γ | BioLegend | 506513 | |
| NaCl, analytical grade | Carlo Erba | 479687 | Can be from other vendors. |
| Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade | Calbiochem | 442611 | Can be from other vendors. |
| EDTA | MP Biomedicals | 800682 | Can be from other vendors. |
| Tris, ultra pure, 99.9% pure | MP Biomedicals | 819620 | Can be from other vendors. |
| NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol) | Calbiochem | 492016 | Can be from other vendors. |
| Protease Inhibitors | Sigma | P2714 | this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water. |
| Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads | Beckman | 63881 | |
| PCR purification kit | HyLabs | EX-GP200 | Can be from other vendors. |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer) | Illumina | FC-121-1030 | |
| NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 185-5200 | Can be from other vendors. |
| CFX Manager Software | Bio-rad | 1845000 | |
| master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5124 | Can be from other vendors. |
| Qubit fluorometer 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| Magnet for eppendorf tubes | Invitrogen | 12321D | Can be from other vendors. |
| Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes | Thermo Scientific | 75004527 | Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes. |
| Thermo-shaker | MRC | Can be from other vendors. | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| 4200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2991AA | Tape-based platform for electrophoresis |
| High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis |
| Primer name and sequence | Company | ||
| Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3' |
IDT | Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3' | |
| Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.1_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
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| Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
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| Ad2.4_TCCTGAGC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
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| Ad2.5_GGACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
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| Ad2.6_TAGGCATG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
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| Ad2.7_CTCTCTAC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
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| Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
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IDT | Ad2.19_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
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IDT | Ad2.21_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGCT CGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.22_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.23_TTGACCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGCT CGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.23_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGGCT CGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.24_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3' | IDT | ||
| R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3' | IDT | ||
| F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3' | IDT | ||
| R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3' | IDT | ||
| F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3' | IDT | ||
| R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3' | IDT | ||
| F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3' | IDT | ||
| R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3' | IDT |
References
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