ATAC Seq에 의해 기본 인간 T 림프 톨에 게놈 넓은 접근 Chromatin 매핑
Summary
높은 처리량 시퀀싱 (ATAC-seq)와 결합 하 여 염색 하는 Transposase 액세스할 수 질에 대 한 분석 결과 액세스할 수 chromatin를 폭로 하는 게놈 넓은 방법입니다. 이 인간의 세포 (Th1/Th2)에 최적화 된 최종 계산 분석, 분자에서 단계별 ATAC seq 프로토콜입니다. 이 프로토콜 차세대 시퀀싱 방법 사전 경험 없이 연구자에 의해 채택 될 수 있다.
Abstract
높은 처리량 시퀀싱 (ATAC-seq) Transposase 액세스할 수 Chromatin에 대 한 분석 결과 chromatin의 오픈 (액세스) 지역의 식별에 사용 되는 방법 이다. 이 지역 규제 DNA 요소를 (예를 들면, 발기인, 증강, 로커 스 제어 영역, 절연체) 요인 바인딩하는 전사를 나타냅니다. 매핑 액세스할 수 chromatin 프리 게놈에서 잠복 활성 규제 요소에 대 한 강력한 접근 이다. 이 정보는 관련 된 녹음 방송 요인의 네트워크 및 유전자 식 프로그램을 제어 하는 chromatin 구조의 메커니즘을 발견에 대 한 편견된 접근 역할을 합니다. ATAC seq는 DNase 강력 하 고 중요 한 대안이 나 과민 증 분석 다음-세대 시퀀싱 (DNase-seq)와 포 름 알 데히드 기반 격리 chromatin의 게놈 넓은 분석에 대 한 규제 요소 (시 키-seq)의 결합 내게 필요한 옵션을 micrococcal nuclease 민감한 사이트 (MNase-seq) nucleosome 위치 결정의 연속. 선물이 상세한 ATAC seq 프로토콜 최적화 된 인간의 기본 면역 세포 즉, CD4 + 세포 (T 도우미 1 (Th1) 및 Th2 세포). 이 포괄적인 프로토콜 셀 수확 시작 chromatin tagmentation, 다음-세대 시퀀싱에 대 한 샘플 준비의 분자 절차에 설명 합니다 그리고 또한 포함 하는 방법 및 전산 분석 하는 데 사용에 대 한 고려 사항 결과 해석 합니다. 또한, 시간과 비용을 절약 하기 위해 우리는 시퀀싱 전에 ATAC seq 라이브러리를 평가 하기 위해 품질 관리 측정을 소개 했다. 중요 한 것은,이 프로토콜에 원리 다른 인간의 면역 및 비 면역 1 차 셀 및 셀 라인에 그것의 적응을 수 있습니다. 이러한 지침은 다음-세대 시퀀싱 방법 숙달 되지 않은 실험실을 위한 또한 유용할 것 이다.
Introduction
ATAC seq1,2 규제3 오픈 chromatin 지역과 nucleosome 포지셔닝의 식별을 가능 하 게 하는 강력한 방법입니다. 이 정보는 위치, id, 및 녹음 방송 요인의 활동을 유추 적용 됩니다. Chromatin 구조 양적 변화를 측정 하기 위한 방법의 감도 chromatin 요인, RNA 중 합 효소 II1의 transcriptional 활동 뿐만 아니라 chromatin remodelers 및 한정자를 포함 하 여 활동의 연구 수 있습니다. 따라서 ATAC seq 모든 세포 유형의 관심에 transcriptional 규칙을 제어 하는 메커니즘을 해독에 대 한 강력 하 고 공평한 접근을 제공 합니다. 우리는 기본 인간의 Th1 및 Th2 세포 ATAC seq의 적응을 설명합니다.
ATAC seq에 활동적인 Tn5 transposase 어댑터 (즉, “tagmentation” 과정)1DNA의 태그와 차세대 시퀀싱 (NGS) 커플 DNA 파편에 대 한 어댑터 로드. PCR 증폭, 다음 결과 DNA 라이브러리는 다음-세대 시퀀싱 (그림 1)에 대 한 준비가 됩니다. 액세스할 수 chromatin의 우선 tagmentation는 ATAC seq 시퀀싱 읽기의 지역 농축의 분석에 의해 검출 된다.
짧은 실험 절차와 chromatin 접근성 및 DNase seq4, 시 키-seq5, MNase-seq6, 등 nucleosomal 위치를 측정 하기 위한 다른 방법에 상대적으로 더 적은 시작 물자에 대 한 요구는 여러 생물 학적 시스템 등 인간의 기본 셀1,7 및 임상 샘플8, 단 세포 유기 체9,10, 식물 과일 파리11에서에서 ATAC seq의 사용을 추진 , 그리고 다양 한 포유류12.
녹음 방송 요인 접근 가능한 loci에 바인딩되는 chromatin immunoprecipitation (칩) 뒤에 높은 처리량 DNA 시퀀싱 (ATAC seq 결합 또는 그들의 바인딩 시퀀스 모티프의 농축을 분석 하 여 발견 될 수 있다의 정체성 ChIP-seq). 이 방법은 마우스13조에 대 한 중요 한 계보 특정 녹음 방송 요인의 식별을 사용할 수 있습니다. ATAC seq의 공평 하 고 글로벌 자연 유기 체는 칩 분석에 대 한 항 체 등 시 약은 사용할 수 없습니다에 있는 유전자 규칙을 공부 하 고 있습니다. Cis진화 변화 예를 들어-두개골 신경 크레스트 셀에서 인간과 침팬지14, 초기 마우스 동안 규제 요소 발달 변화를 공부 하 여 규제 지역 확인 되었습니다 embryogenesis15, 단 세포 C. owzarzaki의 라이프 사이클 동안 규제에 변경9및 발기인 및 20 포유동물 종12에서 강화의 진화.
ATAC seq도 따라서 공개 변화 세포 인구에서 일반적으로 게놈 넓은 연구7,16evades는 단일 셀에 chromatin 접근성을 측정 하기 위한 수단이 되었습니다. 또한, ATAC seq DNA 샘플 드물다 질병 조건에서 규제 지역에서 발생 하는 변화를 공부 하 사용할 수 있습니다. ATAC seq 급성 골수성 백혈병 (AML)17 또는 Ras의 발병 기간 동안 규정에 변화를 공부 하는 예를 들어-발암11을 구동.
Protocol
모든 절차의 바 Ilan 대학 기관 검토 위원회에 의해 승인 및 프로토콜 실험 승인 위원회에서 제공 하는 지침을 따릅니다. 1. 정화의 순진한 사람의 CD4 + 세포 및 T 도우미 1 (Th1), Th2 세포 분극 참고: 우리가 냉동된 인간 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)에서 시작 하는 절차를 설명 하는 여기. 첫 번째 단계는 CD4 + 세포 microbeads를 사용 하 여 격리 이루어져 있고 열 일반?…
Representative Results
이 프로토콜의 최종 결과 일반적으로 3 ~ 20 ng / µ L의 ATAC seq 라이브러리입니다. DNA 무결성 분석 시스템에서 실행할 때 (참조 테이블의 재료/장비), 그들은 쇼 사다리 같은 모습2 (그림 3A). DNA 파편의 평균 크기는 일반적으로 ~ 450 530 혈압. 차세대 시퀀싱을 수행 하기 전에 ATAC se…
Discussion
여기에 설명 된 ATAC seq 프로토콜은 성공적으로 고용 되었다 액세스할 수 chromatin의 분석에 대 한 1 차 셀에서 (인간의 Th1, Th2 세포와 B 세포) 교양된 셀 라인 (MCF10A 인간의 유방암 세포와 U261 세포종 세포) 뿐만 아니라. 다른 세포 유형 ATAC seq 적용 일부 프로토콜 최적화, 특히 세포 단계에서에서 필요할 수 있습니다. 비 이온 세제의 농도가 너무 높은 경우에, 높은 비율의 미토 콘 드리 아 DNA 오염 수 있?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 이스라엘 과학 재단 (그랜트 748/14) 지원, 마리 퀴리 통합 부여 (CIG)-FP7 명 20013 CIG 618763와 난 코어 프로그램의 계획 및 예산 위원회와 이스라엘 과학 재단 부여 번호 41/11.
Materials
| 50 mL tubes | Lumitron | LUM-CFT011500-P | Can be from other vendors. |
| Microtubes | Axygen Inc | MCT-175-C | Can be from other vendors. |
| 25 mL serological pipettes | Corning Costar | 4489 | Can be from other vendors. |
| Tissue culture flask | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | Can be from other vendors. |
| Countes Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| NucleoSpin Tissue | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
| Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) | ATCC | PCS800011 | Can be from other vendors. |
| RPMI 1640 Medium | Biological Industries | 01-103-1A | Can be from other vendors. |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Biological Industries | 03-020-1B | Can be from other vendors. |
| Penicillin-Streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | Can be from other vendors. |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade | Biological Industries | 04-127-1 | Can be from other vendors. |
| MACS CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Human CD4 FITC | Biogems | 06121-50 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control FITC | Biogems | 44212-50 | |
| Anti-Human CD3 (OKT3) | Tonbo biosciences | 40-0037 | |
| Anti-Human CD28 SAFIRE Purified | Biogems | 10311-25 | |
| Recombinant Human IL2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL4 | Peprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human IL12 p70 | Peprotech | 200-12 | |
| In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
| LEAF Purified anti-human IFN-γ | BioLegend | 506513 | |
| NaCl, analytical grade | Carlo Erba | 479687 | Can be from other vendors. |
| Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade | Calbiochem | 442611 | Can be from other vendors. |
| EDTA | MP Biomedicals | 800682 | Can be from other vendors. |
| Tris, ultra pure, 99.9% pure | MP Biomedicals | 819620 | Can be from other vendors. |
| NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol) | Calbiochem | 492016 | Can be from other vendors. |
| Protease Inhibitors | Sigma | P2714 | this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water. |
| Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads | Beckman | 63881 | |
| PCR purification kit | HyLabs | EX-GP200 | Can be from other vendors. |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer) | Illumina | FC-121-1030 | |
| NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 185-5200 | Can be from other vendors. |
| CFX Manager Software | Bio-rad | 1845000 | |
| master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5124 | Can be from other vendors. |
| Qubit fluorometer 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| Magnet for eppendorf tubes | Invitrogen | 12321D | Can be from other vendors. |
| Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes | Thermo Scientific | 75004527 | Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes. |
| Thermo-shaker | MRC | Can be from other vendors. | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| 4200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2991AA | Tape-based platform for electrophoresis |
| High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis |
| Primer name and sequence | Company | ||
| Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3' |
IDT | Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3' | |
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| Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGCT CGGAGATGT-3' |
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| Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGGCT CGGAGATGT-3' |
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| F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3' | IDT | ||
| R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3' | IDT | ||
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| R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3' | IDT | ||
| F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3' | IDT | ||
| R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3' | IDT |
References
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Cite This Article
Grbesa, I., Tannenbaum, M., Sarusi-Portuguez, A., Schwartz, M., Hakim, O. Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq. J. Vis. Exp. (129), e56313, doi:10.3791/56313 (2017).