Summary
Ensaio de cromatina Transposase-acessível, juntamente com o sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) é um método de todo o genoma para descobrir a cromatina acessível. Este é um protocolo de ATAC-seq passo a passo, de molecular para última análise computacional, otimizada para linfócitos humanos (Th1/Th2). Este protocolo pode ser adotado por pesquisadores sem experiência prévia em métodos de sequenciamento de próxima geração.
Abstract
Ensaio para cromatina Transposase-acessível com arranjar em sequência do elevado-throughput (ATAC-seq) é um método usado para a identificação das regiões (acessíveis) abertas da cromatina. Essas regiões representam DNA elementos reguladores (por exemplo,promotores, melhoradores, regiões de controle de locus, isoladores) ao qual transcrição fatores bind. Mapeamento da paisagem de cromatina acessível é uma poderosa abordagem para descobrir elementos reguladores ativos através do genoma. Esta informação serve como uma abordagem imparcial para descobrir a rede de fatores de transcrição relevantes e mecanismos da estrutura da cromatina que regem os programas de expressão do gene. ATAC-seq é uma alternativa robusta e sensível à DNase eu análise de hipersensibilidade juntamente com a próxima geração sequenciamento (DNase-seq) e formaldeído-assistida isolamento de elementos reguladores (FAIRE-seq) para análise de todo o genoma da cromatina acessibilidade e para o sequenciamento de micrococcal nuclease sensíveis sites (MNase-seq) para determinar o posicionamento do nucleossoma. Apresentamos um protocolo detalhado de ATAC-seq otimizado para humano imune primária células ou seja, CD4 + linfócitos (T helper 1 (Th1) e células Th2). Este protocolo abrangente começa com a colheita da pilha, em seguida, descreve o procedimento molecular da cromatina tagmentation, preparação de amostras para sequenciamento de nova geração e também inclui métodos e considerações para as análises computacionais utilizadas para interprete os resultados. Além disso, para economizar tempo e dinheiro, introduzimos as medidas de controlo de qualidade para avaliar a biblioteca ATAC-seq antes de sequenciamento. Importante, os princípios apresentados neste protocolo permitem sua adaptação ao outro humanas imunes e não imune primária as células e linhas celulares. Estas orientações também será útil para os laboratórios que não são proficientes com métodos de sequenciamento de próxima geração.
Introduction
ATAC-seq1,2 é um método robusto que permite a identificação de regiões de cromatina aberta regulamentar3 e posicionamento nucleossoma. Esta informação é aplicada para inferir a localização, identidade e atividade de fatores de transcrição. Sensibilidade do método para a medição quantitativas variações na estrutura da cromatina permite o estudo da atividade dos fatores de cromatina, incluindo empresas de reestruturação da cromatina e modificadores, bem como a atividade transcricional do RNA polimerase II1. Assim, ATAC-seq fornece uma abordagem poderosa e imparcial para decifrar os mecanismos que regem o Regulamento transcriptional em qualquer tipo de célula de interesse. Descrevemos a adaptação da ATAC-seq para as células Th1 e Th2 humanas primárias.
Na ATAC-seq, hiperativo Tn5 transposase carregado com adaptadores para sequenciamento de próxima geração (NGS) fragmentação de DNA de casais com marcação de DNA com adaptadores (ou seja, o processo de "tagmentation")1. Após amplificação por PCR, as bibliotecas de DNA resultantes estão prontas para a próxima geração sequenciamento (Figura 1). O tagmentation preferencial da cromatina acessível é detectado pela análise de enriquecimento local de leituras de sequenciamento ATAC-seq.
O procedimento experimental curto e exigência de menos matérias-primas, em relação a outros métodos para medir a acessibilidade da cromatina e posicionamento de partícula como de DNase-seq4, FAIRE-seq5e MNase-seq6, tem promoveu o uso de ATAC-seq em vários sistemas biológicos, incluindo células humanas primárias1,7 e amostras clínicas8, bem como organismos unicelulares9, plantas10, moscas de fruta11 e vários mamíferos12.
A identidade da transcrição de fatores que estão ligados a loci acessível podem ser descobertos por analisar o enriquecimento de seus motivos de sequência de ligação ou combinando ATAC-seq com imunoprecipitação da cromatina (ChIP) seguida de alta produtividade (de sequenciamento de DNA ChIP-seq). Essa abordagem permitiu a identificação de fatores de transcrição de linhagem-específicos importantes para hematopoiese em rato13. A natureza global e imparcial da ATAC-seq permite estudar a regulação gênica em organismos para os quais reagentes tais como anticorpos para análise de ChIP não estão disponíveis. Por exemplo, evolutivas variações no cis-regiões reguladoras foram identificadas pelo estudo craniana crista neural células de seres humanos e os chimpanzés14, variações do desenvolvimento em elementos reguladores durante o início do mouse embriogénese15, mudanças na paisagem regulamentar durante um ciclo de vida de unicelulares owzarzaki c.9e a evolução dos promotores e potenciadores em toda espécie de mamífero 2012.
ATAC-seq também tem sido fundamental para medir a acessibilidade de cromatina em células individuais, assim revelando variabilidade dentro das populações de células, que normalmente evita todo o genoma estudos7,16. Além disso, a ATAC-seq pode ser usado para estudar as mudanças que ocorrem em regiões reguladoras de DNA em condições de doença, em que as amostras são raras. Por exemplo, a ATAC-seq pode ser usado para estudar as mudanças na paisagem regulamentar durante o início da leucemia mieloide aguda (LMA)17 ou Ras-conduzido mixomas11.
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Protocol
todos os procedimentos foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional da Universidade Bar Ilan e o protocolo segue as orientações fornecidas pelo Comitê aprova os experimentos.
1. purificação da ingenuidade humana células CD4 + e polarização para T Helper 1 (Th1) e células Th2
Nota: Aqui descrevemos o procedimento a partir de células mononucleares de sangue periférico humano congelado (PBMC). O primeiro passo consiste em isolar as células CD4 + usando microbeads e colunas que normalmente dão-nos mais do que 95% das células CD4 +. No entanto, esta etapa pode variar de acordo com o protocolo preferido em cada laboratório. O protocolo para a ativação de células T e polarização foi modificado de Jenner et al (2009) 18. isolamento de CD4 + células de 10 milhões PBMCs dá origem a 4 milhões de células CD4 +. Eles são divididos em dois balões e cultivados em células Th1 e Th2 polarizador condições rendendo as células Th1 e Th2 3 milhões em apenas uma semana.
Nota: arrefecer o centrifugador a 4 ° C antes de iniciar.
- Descongelar 1 mL de PBMC humano (10 7 células) em um tubo de 50 mL contendo 10 mL de meio RPMI suplementado com 1% penicilina-estreptomicina, 2 mM L-glutamina e 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino. Centrifugar a 500 x g, durante 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células com uma pipeta estéril 25 mL em 15 mL de meio RPMI completado. Transferir as células (com pipeta estéril 25 mL) para um frasco de cultura T75.
- Deixar as células durante a noite em uma incubadora umidificada (37 ° C, 5% CO 2).
- Transferir as células flutuantes com uma pipeta estéril 25 mL para tubo de 50 mL. Determinar o número de telemóvel e viabilidade pela exclusão trypan azul.
- Células isolar CD4 + de 10 milhões vive não-aderente PBMC por selecção positiva usando colunas de acordo com o fabricante e CD4 + microbeads ' recomendações de s (veja a Tabela de materiais e equipamentos) com o seguinte modificações: 10 7 PBMCs são rotulados com 30 µ l de CD4 microbeads em 120 µ l de BSA de 0,5% em PBS.
- Ativar as células T CD4 + para 72 h por rhIL-2 (10 ng/mL), ligados a placa anti-CD3 (5 µ g/mL) e anti-CD28 solúvel (2 µ g/mL). Para a polarização Th1, adicione rhIL-12 (20 ng/mL) e anti-IL-4 (10 µ g/mL). Para a polarização de Th2, adicionar rhIL-4 (40 ng/mL) e anti-IFN-γ (10 µ g/mL).
- Cultura de células para adicionais 7 dias na presença de rhIL-2 (10 ng/mL) e as mesmas citocinas polarizadores (rhIL-12 para Th1 e rhIL-4 para Th2).
2. Isolamento de núcleos
Nota: ATAC-seq é executada com núcleos intactos. Lise tampão contendo 0.05% nonilfenil polietilenoglicol (ver Tabela de materiais e equipamentos) foi calibrado para isolar núcleos de células Th1 e Th2 de humano primários. É recomendável calibrar este passo com os reagentes de laboratório e células. Um excesso de células intactas de insuficiente detergente diminui a eficiência da reação de transposição. Eficiência de lise celular é determinada pelo número de núcleos (células positivas de trypan azul) em relação ao número total de células.
Nota: Prepare o tampão de lise (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM de NaCl, 3 mM MgCl 2). Arrefecer uma centrífuga com um rotor de balanço-balde de 4 ° C. as células em uma centrífuga de balanço-balde em vez de uma centrífuga de ângulo fixo de granulação reduz a perda de células/núcleos. Para evitar núcleos ou perda de celular, pipeta com cuidado ao descartar o sobrenadante.
- Adicionar nonilfenil fresco polietilenoglicol (para obter uma concentração final de 0.05%) e 100 x inibidores de protease (para obter uma concentração final de 1-x) para o frio do lysis imediatamente antes do uso. Mantenha o buffer no gelo
- Células Count T para determinar sua quantidade e viabilidade usando trypan azul método. Viabilidade que seja inferior a 90% de resultados na maior digestão específico.
- Transferência de 0,5 x 10 6 T células (células Th1 ou Th2) para microtubos de 1,5 mL. Girar para baixo a 500 x g por 5 min a 4 ° C.
- Ressuspender as células em 1 mL de tampão fosfato salino (PBS) solução fria. Girar para baixo a 500 x g por 5 min a 4 ° C.
- Ressuspender as células em 1 mL de tampão de Lise fria (contendo nonilfenil polietileno glicol e inibidores da protease). Mantenha o tubo no gelo. Pipeta suavemente para não perturbar os núcleos.
- , Rapidamente, Pegue 10 µ l e conte as células com um contador de célula automatizada enquanto o microtubo com lisados células está no gelo. Esta etapa não deve exceder cinco minutos para não danificar os núcleos. Pelo menos 80% das células deve ser lysed.
- Continuar imediatamente com a reação de transposição. Manter os núcleos preparados sobre o gelo
3. Reação de transposição
Nota: nesta etapa, núcleos isolados são incubados com procarióticas Tn5 transposase (TDE1) carregado com adaptadores para sequenciamento NGS. Tn5 hiperativo, simultaneamente, fragmentos de DNA e ligates adaptadores em acessíveis regiões do genoma (processo tagmentation). A relação entre núcleos e Tn5 transposase é crítica para clivagem preferencial na cromatina acessível. Este protocolo é calibrado para 100.000 núcleos em um volume de reação de 100 μL. No entanto, a reação pode ser escalada para baixo.
- Definir a temperatura em uma coqueteleira térmica a 37 ° C.
- Núcleos de 100.000 transferir para um microtubo de 1,5 mL.
- Centrifugar 500 x g por 10 min a 4 ° C e delicadamente Retire o sobrenadante.
- Adicionar os componentes de reação de transposição para os núcleos especificados no quadro 1.
- Resuspenda pipetando gentil.
- Incubar a reação de transposição em uma coqueteleira térmica a 37 ° C por 30 min com leve agitação (500 rpm).
Nota: A limpeza de DNA é executada por fase sólida reversível imobilização grânulos 19 (ver Tabela de materiais e equipamentos) ou colunas de purificação do PCR. No final da limpeza, eluir os fragmentos de DNA em 20 µ l de 10 mM Tris-HCl, pH 8. Evitar o EDTA no buffer de eluição.
4. Enriquecimento de PCR das bibliotecas ATAC-seq
Nota: esta etapa destina-se a amplificar os ATAC-seq biblioteca ou seja, fragmentos de DNA com adaptadores inseridos. Para permitir a mistura de várias bibliotecas de ATAC-seq na pista mesmo sequenciamento de nova geração (" multiplexação ") uso unindexed Primer 1 (Ad1_noMx) 1 para todas as amostras, e uma diferente indexados (código de barras) 2 Primer (Ad 2.1-2,24) 1 para cada amostra. As sequências de primeira demão são fornecidas no complementado Tabela de materiais e equipamentos.
- Amplificação por PCR inicial
Nota: A concentração de trabalho de Primer 1 (Ad1_noMx) e Primer 2 é de 25 µM. Todos os primers são diluídos do estoque original de 100 µM para 25 µM. Em todas as reações de PCR, use Primer 1 (Ad1_noMx) e apenas um do indexado 2 Primer.- Adicionar os componentes da reação de PCR como especificado na tabela 2, a um tubo estéril de PCR.
- Lugar PCR do tubo em um termociclador e realizar a amplificação por PCR usando as ciclismo condições detalhadas na tabela 3.
- Avaliação do número de ciclos de amplificação adicional
Nota: O número de ciclos PCR adicionais deve produzir quantidade suficiente de biblioteca fragmentos fou um sequenciamento de próxima geração bem sucedido executado, enquanto minimizado para evitar GC e dimensionar o viés 20. A determinação do número de ciclos PCR (N) necessário para amplificação de fragmento de biblioteca ideal é feita por PCR quantitativo (qPCR).- Diluir 1 de Primers (Ad1_noMx) e 2 (usado para a amplificação da biblioteca inicial) de 25 µM a 6,25 µM.
- Adicionar os componentes ópticos da polimerase ou uma placa, como indicado na tabela 4.
- Lugar em um instrumento de qPCR e ciclo como especificado no quadro 5.
- Para estimar o número necessário de ciclos de amplificação adicional (N), lote número de ciclo sobre o eixo x e a fluorescência relativa (RFU) no eixo y. Ciclos de
- o número de amplificação adicional (N) é 1/3 do número de ciclos em que a reação de qPCR alcançado o planalto. a Figura 2 fornece exemplos para três bibliotecas ATAC-seq patamar no ~ 2.350 unidades de fluorescência relativo, RFU (linha grossa verde). O número de ciclos PCR, em que um terço da quantidade máxima (RFU 783, marcado no eixo y) é amplificado corresponde a 8 ciclos por duas das bibliotecas (curvas de amplificação de vermelho e azul) e 9 ciclos PCR para a biblioteca de terceiro (rosa).
- Amplificação por PCR final
- amplificar o restante µ 45 l da reação de PCR. Coloque um tubo PCR contendo a reação de amplificação da etapa 4.1.2 em um termociclador. Execute o programa PCR descrito na tabela 6. Use o número de ciclos de amplificação (N) previamente determinado (etapa 4.2.5).
5. Seleção de ATAC-Seq bibliotecas do tamanho
Nota: na nossa experiência, seleção de tamanho de amplificado ATAC-seq bibliotecas melhora os resultados de sequenciamento de próxima geração porque elimina fragmentos de biblioteca de alto peso molecular da final biblioteca ATAC-seq.
Nota: Permitir que os grânulos magnéticos aquecer a temperatura ambiente 30 min antes do uso.
Prepare-se fresco 70% de etanol em água livre de nuclease.
- Resuspenda os grânulos magnéticos misturando.
- Adicionar água nuclease-livre para as bibliotecas de ATAC-seq (obtidas na etapa 4.3.1.) e levar até 100 µ l. Adicionar 50 µ l de
- (0.5 x) de ressuspensão grânulos magnéticos do DNA-ligando a 100 µ l de bibliotecas amplificadas. Misture pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes. Incube as amostras por 5 min à temperatura ambiente. Se necessário, girar rapidamente para baixo os microtubos.
- Colocar o tubo em um carrinho magnético apropriado por 2 min separar as esferas magnéticas do sobrenadante. Depois de 2 min, transfira o sobrenadante para um microtubo novo.
- Medir o volume do líquido sobrenadante pipetando e adicionar 0,7 x de grânulos magnéticos. Mix pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes.
- Incubar 5 min à temperatura ambiente. Lugar num suporte magnético para 2 min.
- Após o 2 min incubação, desprezar o sobrenadante. Adicionar 200 µ l acabadas etanol a 70% para lavar os grânulos quando os tubos forem depor magnético.
- Manter o microtubo sobre o ímã por 30 s e depois descartar o etanol. Repita a etapa 5.7.for duas lavagens de etanol final.
- Remover completamente o restante do etanol e deixe que os grânulos secar ao ar por 5 min enquanto o tubo é sobre o ímã. Se necessário, gire brevemente o microtubo. Remover os vestígios de álcool etílico com uma ponta de pipeta p10.
- Remover o microtubo de ímã e adicione 22 µ l de 10 mM Tris-HCl, pH 8. Não eluir as ATAC-seq bibliotecas em tampão contendo EDTA.
- Incubar o tubo para 2 min à temperatura ambiente e coloque sobre o suporte magnético.
- Quando a solução é clara, 20 µ l de eluted bibliotecas de transferência para um novo microtubo estéril.
- Loja do tamanho selecionado ATAC-seq bibliotecas em -20 ° C.
6. Análise da qualidade das bibliotecas ATAC-Seq
- validação da qualidade da ATAC-seq bibliotecas por PCR em tempo real
Nota: é importante avaliar a relação sinal / ruído das bibliotecas ATAC-seq antes da próxima geração sequenciamento. Isso é feito, determinando a quantidade relativa de fragmentos de DNA de loci acessível e inacessível usando PCR quantitativo (qPCR). Os loci inacessível (controlo negativo, chr1:48, 137, 860-48,137,934 e chr1:193, 093, 748-193,093,827) são amplificados por pares da primeira demão, 1 e 2. Os loci acessível (controle positivo, chr19:30, 336, 166-30,336,253 e chr19:11546154-11546237) são amplificados por pares da primeira demão, 3 e 4. Positivos e negativos de loci foram definidos a partir de perfis de acessibilidade (DHS-seq) cromatina das células humanas CD4 + (ENCODE adesões ENCSR000EQE e ENCSR000EQG). Primeira demão negativo 1 situa-se em uma grande região intergênica heterocromático (230 kb de TRADB2 e 88 kb de FOXD2). Região de controle negativo, 2 é dentro o primeiro intron do gene CDC73. Positivo par de primer 3 está dentro de uma região de cromatina aberta a jusante do gene E Cyclin (CCNE1) ao par de primer positivo 4 é centralizada dentro do promotor da proteína quinase C substrato 80K-H (PRKCSH). Importante, estes loci de controle mostra um padrão semelhante de acessibilidade em outros tipos de células humanas do ENCODE projeto 3, sugerindo que eles podem ser aplicados para monitorar ATAC-seq bibliotecas de um amplo espectro de tipos de células humanas. Cartilha eficiência e especificidade de todos os pares da primeira demão foi verificado por qPCR em uma diluição serial do DNA genômico (a partir de células humanas de Th) e uma análise de curva derretimento dos obtidos produtos amplificados.- Isolar o DNA genômico, usando um comercialmente disponível kit (veja a Tabela de materiais e equipamentos).
- Diluir o ATAC-seq amplificado biblioteca 01:10 (1 µ l biblioteca + 9 µ l de água livre de nuclease) e o DNA genômico de ~ 5 ng / µ l.
- Preparar a mistura de reacção (tabela 7) para cada par de primer de controlo positivo e negativo, tendo em conta que as reações são realizadas em triplicata.
- Incubar em termociclador qPCR, de acordo com o protocolo recomendado pelo fornecedor de mestre mistura qPCR.
- Analisar os resultados em instrumento de qPCR ' software s (consulte a Tabela de materiais e equipamentos). Escolha o DNA genômico como uma amostra de controle. Os valores obtidos representam um enriquecimento das regiões acessíveis (amplificados pelos iniciadores de controle positivo). Um exemplo é mostrado na tabela 8.
Nota: Estimativa do tamanho médio de biblioteca e concentração: a distribuição de tamanho de fragmentos de DNA de bibliotecas ATAC-seq é determinada por sistemas automatizados electroforese de alta sensibilidade, de acordo com o fabricante ' instruções s. É aconselhável medir a concentração da amostra em um dados usando o kit de alta sensibilidade de dsDNA e pelo menos 2 µ l de cada amostra de DNA.
Nota: Sequenciamento de próxima geração - antes da multiplexação as bibliotecas, calcule a molaridade de cada biblioteca ATAC-seq usando a fórmula: (ng / µ l x 10 6) / (comprimento do fragmento de 660 x biblioteca média). Mire > 30 milhões leituras de cada biblioteca ATAC-seq para avaliar aberta da cromatina regiões de amostras humanas. Se você quiser determinar se a biblioteca é bom o suficiente para o sequenciamento de NGS, inicialmente, Mire lê 10 milhões (5% da faixa de sequenciamento em instrumento de sequenciamento de DNA no modo de execução rápido). Tenha em mente que para inferir nucleossoma posicionamento, sequenciamento emparelhado-final é necessário 1.
7. Análise dos resultados obtidos Next-Generation sequenciamento
- inferir a qualidade do sequenciamento diz inspecionando os arquivos FastQC, separadamente para cada biblioteca.
- Alinhar o lê a referência humana do genoma (conjunto hg19) usando Bowtie 21 software em ambiente Unix/Linux. O comando é ' bowtie -m 1 - q -S genoma diretório reads.fastq output_aligned.sam '. Diretório de genoma representa a pasta onde os índices de genoma de gravata são armazenados. O parâmetro -m 1 é para não permitir o alinhamento de leituras para mais de um locus no genoma, - q é para o arquivo de entrada deve estar no formato fastq, destina-se a saída que está no formato de SAM -S.
- Remover duplicadas leituras usando SAMtools 22 rmdup opção no ambiente Unix/Linux. Os comandos são ' samtools Ver os output_aligned.sam -b -S | samtools classificar -o-output_aligned > output_aligned.bam ',
samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam '. O primeiro comando, vista, altera o formato de SAM em formato BAM, que é então classificado. A opção de rmdup é então aplicada sobre o arquivo BAM classificado. Opcionalmente, um pode ajustar as leituras para o local de inserção do transposon, conforme descrito na ATAC-seq original papel 1. Isso é feito usar BEDtools comandos 23 no ambiente Unix/Linux. Os comandos são ' bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam > output_aligned _rmdup.bed ', ' shiftBed -i output_aligned genoma do _rmdup.bed -p - m-5 - 4G > output_aligned _rmdup_adjusted.bed '. O primeiro comando, bamTobed, altera o formato BAM em formato de cama, que pode ser usado para o comando shiftBed. O arquivo do genoma é um arquivo delimitado por tabulação que contém o comprimento de cada cromossomo no genoma. O arquivo é adicionado geralmente no diretório BEDtools.
Chamada de pico - Executar usando análise baseada em modelo de ChIP-seq (MACS2) 24 software no ambiente Unix/Linux no arquivo deslocado de cama, com os seguintes parâmetros: - nomodel - extsize 75-- shift -30. Esses parâmetros são usados para ajustar as leituras para que o local de inserção do transposon é no meio de cada leitura do sequenciamento.
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Representative Results
O resultado final do presente protocolo é uma biblioteca de ATAC-seq de normalmente 3-20 ng / µ l. Quando executado em um sistema para análise de integridade de DNA (ver Tabela de materiais e equipamentos), eles mostram a escada-como a aparência2 (Figura 3A). O tamanho médio dos fragmentos de DNA é tipicamente ~ 450-530 bp.
Controle de qualidade adequado das bibliotecas ATAC-seq antes de executar a próxima geração sequenciamento é importante para economizar tempo e dinheiro. Consideramos que as bibliotecas apropriado para sequenciamento de próxima geração (NGS) quando o enriquecimento de controlos positivos é mais do que 25 - e 75 vezes (para a primeira demão pares 3 e 4, respectivamente) em relação a controles negativos (Figura 3B), e quando eles mostram a mencionado anteriormente aparência nucleosomal, escada. Ao analisar dados de qPCR, nós também está verificando os valores de Cq para iniciadores de controle negativo e positivo são semelhantes nas reações com o DNA genômico como um modelo e que o Cq valores para as regiões de controle negativo (nas reações com DNA ATAC-seq fragmentos) são constantes entre os experimentos. Por exemplo, no caso de repente mais baixos valores de Cq, suspeitamos que os núcleos eram excesso transpostos e, portanto, fragmentos de DNA provenientes de regiões de heterocromatina estão sobre-representadas. Além disso, se a imagem de gel (obtida por eletroforese em fita de alta sensibilidade) das bibliotecas ATAC-seq indica a presença dos adaptadores de rede (~ 120 bp), excessiva degradação do ADN (a maioria dos fragmentos são ~ 200 bp), ou fragmentos grandes (mais de 1 kb), temos não continuaria a etapa NGS.
Além disso, nós sempre realizar NGS inicial em que visamos leituras 10 milhões por biblioteca. Se os resultados deste sequenciamento são satisfatórios (a amostra passa todos os parâmetros no arquivo de relatório de FastQC e podemos obter picos de 1000-2000 depois de executar a chamada de pico), as bibliotecas são sequenciadas mais profundamente (mais de 30 milhões de leituras/ATAC-seq biblioteca).
Experiências-a na ATAC-seq em células de mamíferos, em qualquer lugar de ~ 30-70% das leituras sequenciais pode vir do mtDNA10. Em contrapartida, nossas bibliotecas continham leituras de 6 a 20%, mapeadas para o genoma mitocondrial. Isto é menor do que o relatado 46% na biblioteca do humano de linfócitos T CD4 +1ATAC-seq. Depois de eliminar estas leituras a contaminar, fomos deixados com 7 milhões leituras exclusivas de mapeamento de genoma humano de referência (58% - 91% de todas as leituras). A partir desses, 0.1 - leituras 2 milhões (6,8% - 12% de todas as leituras) foram em picos ATAC-seq (Figura 4).
Figura 1 . Fluxo de trabalho de etapas experimentais. Representação das principais etapas neste protocolo ATAC-seq. Pontos de paragem são indicados por hexágonos amarelos. Um passo opcional é representado com um hexágono laranja. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Cálculo do número de ciclos PCR, necessária para o enriquecimento final da ATAC-seq bibliotecas adicional. Curvas de amplificação do PCR para três diferentes bibliotecas de seq ATAC são mostradas em vermelho, azul e rosa. As reações de amplificação alcançado um platô em 2.350 RFU (linha verde horizontal superior). O número de ciclos PCR adicionais cruza-se com 783 RFU (2.350/3) sobre a curva de amplificação. Duas bibliotecas (vermelhas e azuis) exigem 8 ciclos de amplificação adicional, enquanto a terceira biblioteca (rosa) requer 9 ciclos. Controle de não-modelo (NTC) é mostrado como a linha verde mais baixa. Eixo x, número de ciclo. Eixo y, unidades RFU. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Análise de controle de qualidade das bibliotecas ATAC-seq. (A) resultados da electroforese automatizado baseado em fita de bibliotecas de ATAC-seq amplificadas. L, escada; A-D, bibliotecas de biológico repete a partir de células Th1 e Th2. (B) qPCR análise de controle de qualidade das bibliotecas ATAC-seq. DNA genômico e quatro bibliotecas ATAC-seq foram amplificadas por pares da primeira demão de controlo negativo (1 e 2) e primers de controlo positivo (3 e 4). Primeiro, os valores obtidos para bibliotecas ATAC-seq (azul) foram normalizados para os níveis de amplificação de DNA genômico (arbitrariamente definida como um valor de 1; vermelho). Posteriormente, os valores para as regiões de controle positivo foram normalizados para as regiões de controle negativo (gráfico inferior). Bibliotecas #1 e #2 foram enviadas para sequenciamento NGS. Os valores representam a média ± SEM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Genoma navegador snapsh ots das regiões de cromatina acessível em células Th1 e Th2. ATAC-seq faixas são mostradas para NFKB1, JUN, CD28, IFNG (expressado apenas em células Th1) e IL4 e loci IL13 (expressado apenas em Th2) em células Th1 e Th2 (biológico duas repetições para cada um). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Buffer de TD | 50 | ΜL |
| Transposase TDE1 | 5 | ΜL |
| Água livre de nuclease | 45 | ΜL |
| Volume total | 100 | ΜL |
Tabela 1: Preparação da mistura de reação de transposição.
| Biblioteca de ATAC-seq | 15 | ΜL |
| Cartilha 1 (Ad1_noMx) * | 2.5 | ΜL |
Tabela 2: Componentes de uma mistura de reação de PCR inicial (etapa 5.1.1.).
| ETAPA DO CICLO | TEMPERATURA | TEMPO | CICLOS DE |
| Extensão * | 72 ° C | 5 min | 1 |
| Desnaturação inicial | 98 ° C | 30 s | |
| Desnaturação | 98 ° C | 10 s | 5 |
| Recozimento | 63 ° C | 30 s | |
| Extensão | 72 ° C | 3 min | |
| Segure | 4 ° C | ∞ | |
| * Este passo é necessário para estender os dois | |||
| extremidades dos primers após reação de transposição. | |||
Tabela 3: Condições de ciclagem do PCR para amplificação de biblioteca inicial (etapa 5.1.2.)
| Alíquota da reação de PCR (etapa 4.1.1) * | 5 | ΜL |
| Cartilha 1 (Ad1_noMx) * * | 1 | ΜL |
| Cartilha 2 | 1 | ΜL |
| 2 mistura de mestre x SYBR * * * | 7.5 | ΜL |
| Água livre de nuclease | 0,5 | ΜL |
| Volume total | 15 | ΜL |
| Para a não-modelo controle em vez do modelo de DNA adicione água ultra-pura. | ||
| * * A concentração final de cada primer é 417 nM. | ||
| Use a mistura de mestre preferencial para qPCR. | ||
| Ele deve conter polimerase, dNTPs, MgCl2e tintura fluorescente. | ||
Tabela 4: Preparação da mistura de reação de qPCR (etapa 5.2.2).
| ETAPA DO CICLO | TEMPERATURA | TEMPO | CICLOS DE |
| Desnaturação inicial | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Desnaturação | 98 ° C | 10 s | 20 |
| Recozimento | 63 ° C | 30 s | |
| Extensão | 72 ° C | 3 min | |
| Segure | 4 ° C | ∞ |
Tabela 5: Ciclismo condições de avaliação baseados em qPCR de número adicional de ciclos de amplificação (N) (etapa 5.2.3.)
| ETAPA DO CICLO | TEMPERATURA | TEMPO | CICLOS DE |
| Desnaturação inicial | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Desnaturação | 98 ° C | 10 s | N |
| Recozimento | 63 ° C | 30 s | |
| Extensão | 72 ° C | 3 min | |
| Segure | 4 ° C | ∞ |
Tabela 6: Ciclismo condições para a etapa de enriquecimento final do PCR (etapa 5.3.).
| Para uma única reação de PCR: | ||
| Diluição da biblioteca de DNA genômico | 2.5 | ΜL |
| 10 μM Primer F (F1 ou F2 ou F3 ou F4) * | 0.3 | ΜL |
| 10 μM Primer R (R1 ou R2 ou R3 ou R4) * * | 0.3 | ΜL |
| 2 mistura de mestre x SYBR * * * | 5 | ΜL |
| Água livre de nuclease | 1.9 | ΜL |
| Volume total | 10 | ΜL |
| Concentração final de cada primer na mistura reacional é 300 nM. | ||
| * * Se usar primer F1 do primer R deveria ser R1 etc. | ||
| Uso preferido 2 x mestre mistura adequada para o instrumento de qPCR em seu laboratório. | ||
Tabela 7: Condições de reação para análise QC (etapa 7.1.3.).
| Alvo | Amostra | Quer dizer Cq | CQ SEM | Quantidade relativa | Normalizado | |
| 1 | Controle negativo | ATAC-seq | 30.39 | 0.11 | 1 | 1.01 |
| gDNA | 30,4 | 0.16 | 0,99 | 1 | ||
| 2 | ATAC-seq | 30.3 | 0.18 | 1 | 1 | |
| gDNA | 30.34 | 0,09 | 0,99 | 1 | ||
| 3 | Controlo positivo | ATAC-seq | 23,27 | 0,03 | 1 | 173.14 |
| gDNA | 30.7 | 0,06 | 0.01 | 1 | ||
| 4 | ATAC-seq | 21.55 | 0,24 | 1 | 750.31 | |
Quadro 8: Cálculo do enriquecimento dos controles positivos sobre os controles negativos (etapa 7.1.5.).
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Discussion
O protocolo de ATAC-seq descrito aqui tem sido empregado com sucesso para a análise da cromatina acessível em células primárias (humano Th1, Th2 pilhas e pilhas de B) bem como as linhas de células cultivadas (células de câncer de mama humano MCF10A e células de glioblastoma U261). Aplicação de ATAC-seq para outros tipos de células pode exigir alguma otimização de protocolo, especialmente na etapa de Lise. Se a concentração de detergente não-iônico é muito alta, pode haver um maior percentual de contaminação de DNA mitocondrial. Isto pode ser reduzido, diminuindo a concentração de detergente no buffer de Lise sem reduzir o rendimento de núcleos. Em nossa experiência, tampão de Lise com 0,05% de detergente deu os resultados mais satisfatórios. Além disso, girando os núcleos em um balanço-balde em vez de rotor de ângulo fixo, permitido a redução da força G para 500, que reduziu as mitocôndrias na pelota. Os pesquisadores também podem testar outros tipos de detergentes, por exemplo, digitonin17. No entanto, mesmo com condições de Lise otimizado, contaminação de DNA mitocondrial é inevitável. Para remover completamente o DNA mitocondrial, o sistema CRISPR/Cas9 pode ser usados15. Neste caso, ATAC-seq bibliotecas são incubadas com sgRNAs alvo mtDNA e Cas9 nuclease para digerir o DNA mitocondrial15.
O número de núcleos necessários para este protocolo ATAC-seq (100.000) pode ser um fator limitante em casos onde o número de telemóvel de amostras clínicas é escassa7. ATAC-seq tem sido com sucesso reduzida para 5.000 e 500 células1,13,17 , reduzindo a reação volume1,13, executar limpeza com grânulos magnéticos em vez de com colunas 13, ou evitar a etapa de limpeza1. Além disso, célula única ATAC-seq (scATAC-seq) pode ser realizada usando um dispositivo microfluidic para separar os núcleos individuais16. Notadamente, outros métodos para medir a acessibilidade de cromatina, tais como a DNase-seq e FAIRE-seq, exigem mais matérias-primas e mais alguns dias para realizar o experimento.
Agora é amplamente apreciado que vieses nos diversos métodos NGS são comuns fenômenos25. Uma das causas das variações de medidas de acessibilidade diferente da cromatina é a clivagem enzimática passo25. Ficou demonstrado que DNase eu mostra decote viés26 e agora é reconhecido que o Tn5 transposase mostra preferência de clivagem, bem27. Felizmente, o viés potencial podem ser identificado computacionalmente usando um pipeline de controle de qualidade como ChiLin28. Outra fonte comum de viés é o passo de amplificação do PCR20,25. Isto manifesta-se frequentemente como um viés para a amplificação de GC-ricos fragmentos de25. Desde que o preconceito aumenta a cada passo de amplificação do PCR, nós não exceda 9 ciclos adicionais (N) no final a amplificação por PCR de bibliotecas ATAC-seq.
A relação apropriada entre Tn5 transposase e núcleos é fundamental para o sucesso ATAC-seq.2. Um excesso de enzima conduziria à "sobre transposição" em loci inacessível e fundo elevado. Isso se reflete na alta amplificação das regiões de controlo negativo na etapa de controle de qualidade de qPCR. Um excesso de núcleos conduziria à "Under transposição". Neste caso, sítios de clivagem muito distante resultará em menos fragmentos amplificados por PCR e biblioteca de baixa complexidade. Para determinar o número de núcleos com precisão, introduzimos uma etapa adicional de contagem, depois da lise celular e antes da reação de transposição.
Acessibilidade de cromatina é uma camada importante de regulação epigenética, como permite a atividade dos reguladores de transcrição em locais específicos do genoma. Assim, a sequência de DNA dentro do perfil de cromatina acessível oferece uma riqueza de informações sobre a identidade e destino loci de dezenas de fatores de transcrição possível. Combinar esta informação (obtida pela ATAC-seq) com um perfil de expressão de RNA permite um foco sobre os factores de transcrição relevantes que podem ser mais analisados pelo ChIP-seq13,22. Além disso, apenas 10% dos polimorfismos associada a doença está na codificação do genoma de30. Assim, aplicando a ATAC-seq para amostras clínicas pode revelar qual das variantes não-codificantes são em elementos reguladores que podem afetar a regulação gênica, no estado de doença (por exemplo, no Lúpus eritematoso sistêmico,8). Esperamos que este protocolo ATAC-seq vai ajudar e incentivar os investigadores interessados a usar este poderoso método para avançar suas pesquisas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pela Fundação de ciência de Israel (grant 748/14), Marie Curie integração conceder (CIG) - FP7-pessoas-20013-CIG-618763 e eu-núcleo programa de planejamento e orçamento do Comité e o Israel Science Foundation concedem n º 41/11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL tubes | Lumitron | LUM-CFT011500-P | Can be from other vendors. |
| Microtubes | Axygen Inc | MCT-175-C | Can be from other vendors. |
| 25 mL serological pipettes | Corning Costar | 4489 | Can be from other vendors. |
| Tissue culture flask | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | Can be from other vendors. |
| Countes Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| NucleoSpin Tissue | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
| Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) | ATCC | PCS800011 | Can be from other vendors. |
| RPMI 1640 Medium | Biological Industries | 01-103-1A | Can be from other vendors. |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Biological Industries | 03-020-1B | Can be from other vendors. |
| Penicillin-Streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | Can be from other vendors. |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade | Biological Industries | 04-127-1 | Can be from other vendors. |
| MACS CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Human CD4 FITC | Biogems | 06121-50 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control FITC | Biogems | 44212-50 | |
| Anti-Human CD3 (OKT3) | Tonbo biosciences | 40-0037 | |
| Anti-Human CD28 SAFIRE Purified | Biogems | 10311-25 | |
| Recombinant Human IL2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL4 | Peprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human IL12 p70 | Peprotech | 200-12 | |
| In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
| LEAF Purified anti-human IFN-γ | BioLegend | 506513 | |
| NaCl, analytical grade | Carlo Erba | 479687 | Can be from other vendors. |
| Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade | Calbiochem | 442611 | Can be from other vendors. |
| EDTA | MP Biomedicals | 800682 | Can be from other vendors. |
| Tris, ultra pure, 99.9% pure | MP Biomedicals | 819620 | Can be from other vendors. |
| NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol) | Calbiochem | 492016 | Can be from other vendors. |
| Protease Inhibitors | Sigma | P2714 | this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water. |
| Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads | Beckman | 63881 | |
| PCR purification kit | HyLabs | EX-GP200 | Can be from other vendors. |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer) | Illumina | FC-121-1030 | |
| NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 185-5200 | Can be from other vendors. |
| CFX Manager Software | Bio-rad | 1845000 | |
| master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5124 | Can be from other vendors. |
| Qubit fluorometer 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| Magnet for eppendorf tubes | Invitrogen | 12321D | Can be from other vendors. |
| Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes | Thermo Scientific | 75004527 | Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes. |
| Thermo-shaker | MRC | Can be from other vendors. | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| 4200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2991AA | Tape-based platform for electrophoresis |
| High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis |
| Primer name and sequence | Company | ||
| Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3' |
IDT | Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3' | |
| Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.1_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.2_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.3_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.4_TCCTGAGC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.4_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.5_GGACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.5_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.6_TAGGCATG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.6_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.7_CTCTCTAC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.7_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.8_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.9_GCTACGCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.9_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.10_CGAGGCTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.10_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.11_AAGAGGCA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.11_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.12_GTAGAGGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.12_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.13_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.14_ACCACTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.14_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.15_TGGATCTG: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.15_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.16_CCGTTTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.16_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.17_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.18_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.19_AGGTTGGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.19_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.20_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.21_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.22_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.23_TTGACCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.23_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.24_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3' | IDT | ||
| R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3' | IDT | ||
| F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3' | IDT | ||
| R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3' | IDT | ||
| F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3' | IDT | ||
| R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3' | IDT | ||
| F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3' | IDT | ||
| R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3' | IDT |
References
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