Summary

गुर्दे में प्रोटीन के गैर वायरल अभिव्यक्ति के लिए Hydrodynamic गुर्दे श्रोणि इंजेक्शन

Published: January 08, 2018
doi:

Summary

इस प्रोटोकॉल एक विधि का वर्णन करने के लिए गुर्दे के माध्यम से माउस गुर्दे में प्लाज्मिड डीएनए सुई श्रोणि के लिए विशेष रूप से गुर्दे में transgene अभिव्यक्ति का उत्पादन ।

Abstract

Hydrodynamic इंजेक्शन प्लाज्मिड डीएनए और अन्य पदार्थों के साथ विभिन्न ऊतकों को transfect करने के लिए एक स्थानीय, उच्च दबाव वातावरण बनाता है । Hydrodynamic पूंछ नस इंजेक्शन, उदाहरण के लिए, एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है जिसके द्वारा जिगर transfected किया जा सकता है । इस पांडुलिपि का वर्णन एक आवेदन माउस गुर्दे के इंजेक्शन द्वारा hydrodynamic सिद्धांतों सीधे गुर्दे के लिए प्लाज्मिड डीएनए विशेष जीन अभिव्यक्ति के साथ । चूहों anesthetized रहे हैं और गुर्दे एक पार्श्व चीरा द्वारा एक प्लाज्मिड डीएनए के एक तेजी से इंजेक्शन के बाद से उजागर होता है-सीधे गुर्दे श्रोणि में समाधान युक्त. सुई दस सेकंड के लिए जगह में रखा जाता है और चीरा साइट टांका है । अगले दिन, जीना पशु इमेजिंग, पश्चिमी दाग, या immunohistochemistry के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है परख जीन अभिव्यक्ति, या अंय पसंद की transgene के लिए उपयुक्त परख ब्याज की प्रोटीन का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है । प्रकाशित तरीकों को लंबा जीन अभिव्यक्ति transposon-मध्यस्थता transgene एकीकरण और cyclophosphamide उपचार transgene को प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बाधित शामिल हैं ।

Introduction

hydrodynamic पूंछ नस इंजेक्शन तकनीक माउस जिगर में जीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को प्राप्त करने के लिए एक सामान्य रूप से इस्तेमाल किया तरीका बन गया है1,2. गुर्दे भी इस तकनीक से काफी निचले स्तर पर transfected हैं, लगभग १००-गुना कम3. hydrodynamic गुर्दे श्रोणि इंजेक्शन यहाँ वर्णित एक सरल तरीके से शारीरिक अर्थ के माध्यम से अंग अभिव्यक्ति की विशिष्टता को नियंत्रित करने के लिए एक ही hydrodynamic सिद्धांतों है कि पहले जिगर में स्थापित किया गया है का उपयोग कर प्रदान करता है4,5 , मांसपेशी6, और अन्य अंगों7,8. इस विधि vivo में जीवित पशुओं में कोशिकाओं transfects दबाव और गति का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं में तरल पदार्थ युक्त डीएनए बल, एक साथ अंग है कि जल्दी से हल है9को नुकसान उत्प्रेरण द्वारा । अच्छी तरह से स्थापित सर्जिकल तकनीक का उपयोग एक पार्श्व के माध्यम से गुर्दे की कल्पना करने के लिए10 साथ ही इंसुलिन सिरिंज द्वारा एक इंजेक्शन के साथ, हम गुर्दे की कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के सफल अभिकर्मक पाया है, मुख्यतः मध्यवर्ती fibroblasts, नलिकाओं, और वाहिनी11इकट्ठा । इन चूहों के विच्छेदन से पता चला है कि अंय अंगों के स्तर पर पर्याप्त उच्च luciferase इमेजिंग तकनीक द्वारा कल्पना को transfected नहीं कर रहे है11। के बाद से तकनीक गैर वायरल है, अभिकर्मक के लिए प्लाज्मिड डीएनए का उपयोग तेजी से और इंजेक्शन के लिए आवश्यक एजेंट की आसान तैयारी परमिट ।

हम स्थानीयकृत hydrodynamic इंजेक्शन का इस्तेमाल किया है एंटीऑक्सीडेंट glutathione एस-ट्रांस्फ़्रेज़ A4 व्यक्त करने के लिए, इंसुलिन जैसे विकास कारक-1 रिसेप्टर, और गुर्दे में हार्मोन erythropoietin, सभी की उम्मीद जैविक प्रभाव के साथ11, 12 , 13. प्रशासन के मार्ग का विस्तृत मूल्यांकन, इंजेक्शन की मात्रा, डीएनए खुराक, और प्रमोटर च्वाइस11प्रदर्शन किया गया है । इसके अतिरिक्त, दोनों piggyBac transposon प्रणाली और/या cyclophosphamide उपचार transgene को प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को दबाने के लिए लंबी अवधि के जीन अभिव्यक्ति परिणाम11सुधार दिखाया गया है । अंय जांचकर्ताओं चूहे में सफलता के साथ एक गुर्दे की नस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है, एक से अधिक की समय अवधि के लिए उच्च अभिकर्मक दक्षता प्राप्त करने के14महीने । हालांकि, phenotypes नकल उतार मानव रोग के आनुवंशिक सुधार आमतौर पर सबसे स्तनधारी आनुवंशिक मॉडल माउस मॉडल है के बाद से एक सबूत की अवधारणा के रूप में पहले चूहों में प्रदर्शन कर रहे हैं । हम गुर्दे श्रोणि इंजेक्शन के लिए गुर्दा नस इंजेक्शन की तुलना में और पाया कि इंजेक्शन गुर्दे श्रोणि में जीन अभिव्यक्ति के लिए गुर्दे की नस के लिए बेहतर था (लगभग दस गुना अधिक) और अस्तित्व11। गुर्दे श्रोणि में प्रवेश का एक आदर्श मार्ग है क्योंकि यह पर्याप्त लचीला मूत्र उत्पादन में उतार चढ़ाव बर्दाश्त है और अक्सर अपनी संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने में सक्षम है, जब भी hydronephrosis के दौरान फैली हुई है । इसके अतिरिक्त, गुर्दे श्रोणि में इंजेक्शन गुर्दा कैप्सूल भेदी बिना गुर्दे के लिए उपयोग की अनुमति दी, इंजेक्शन द्रव दिख intraparenchymal इंजेक्शन से बेहतर गुर्दे द्वारा बनाए रखा जा करने के लिए अनुमति देता है । अंय माउस अंगों vasculature के अलावा अंय प्रवेश का एक मार्ग नहीं है, लेकिन गुर्दे के मूत्र अंतरिक्ष एक आदर्श इंजेक्शन साइट है । इसके अतिरिक्त, गुर्दे की नस में इंजेक्शन उदर गुहा में रक्त के रिसाव के परिणामस्वरूप । जंगली प्रकार के माउस गुर्दे की कुल गुर्दे की मात्रा लगभग ०.२ सेमी3होने के लिए चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग द्वारा अनुमान लगाया गया है, तो एक ही गुर्दा की मात्रा तरल गुर्दे श्रोणि द्वारा इंजेक्शन की मात्रा के लगभग बराबर है hydrodynamic इंजेक्शन (१०० µ l)15. इस के साथ साथ, हम hydrodynamic गुर्दे श्रोणि इंजेक्शन प्रोटोकॉल की विस्तृत बारीकियों के सभी उपलब्ध कराई है गुर्दे के प्रतिलिपि अभिकर्मक प्राप्त करने के लिए ।

Protocol

सभी विधियां यहां वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों (IACUCs) Baylor कॉलेज ऑफ मेडिसिन और वेंडरबिल्ट विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र द्वारा अनुमोदित किया गया है । 1. इंजेक्शन के लिए डीएनए समाध…

Representative Results

सर्जरी और इंजेक्शन तकनीक एक बार में महारत हासिल करने के लिए सरल कर रहे हैं, कोई प्रमुख उपकरण या महंगी सामग्री की आवश्यकता होती है । यदि पार्श्व करने के लिए नई-चीरा गुर्दे की सर्जरी, कई इच्छाम…

Discussion

इस प्रोटोकॉल में विशेष रूप से गुर्दे में प्रतिलिपि जीन अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए एक मजबूत तरीका बताया गया है । एक मामूली अनुभवी सर्जन के हाथ में हम इस तकनीक से transfected चूहों के प्रतिशत को 50-100% की सीमा म?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

दिग्गजों मामलों के विभाग से एक कैरियर विकास पुरस्कार [BX002797] समर्थित L.E.W. और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों [R01-DK095867] और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन [15GRNT25700209] समर्थित J.C. राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान [DK093660], दिग्गजों मामलों के विभाग [BX002190], और गुर्दे की बीमारी के लिए वेंडरबिल्ट केंद्र समर्थित M.H.W. इस सामग्री के संसाधनों और VA टेनेसी घाटी स्वास्थ्य सेवा प्रणाली में सुविधाओं के उपयोग के साथ समर्थित काम का परिणाम है ।

Materials

AnaSed Xylazine Patterson Veterinary 07-808-1947 Anesthetic – Not controlled substance
BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch Cardinal Health 309306 Required syringes
Buprenex Pharmacist/Veterinarian Analgesia – Controlled Substance
Dynarex Disposable Towel Drape Thermo Fisher Scientific 19-310-671 Place over heat pad
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Use only endotoxin-free plasmid DNA
Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control Charles River PC200 Positive control for endotoxin test
Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial Charles River R13500 Endotoxin test
Extra Fine Micro Dissecting Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5882 Surgical tool
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouch – 9" Thermo Fisher Scientific 01-812-51 For autoclaving surgical tools
Gaymar Heat Pump Paragon Medical TP-700 Water-circulating heat pump
Germinator 500 Roboz Surgical Instrument DS-401 To reuse surgical tools during surgery
Graefe Forceps Roboz Surgical Instrument RS-5136 Surgical tool
Graefe Tissue Forceps Roboz Surgical Instrument RS-5153 Surgical tool
Halsey Needle Holder, 5" Length Roboz Surgical Instrument RS-7841 Surgical tool
Heat pads – 15" x 21" – need at least 3 Paragon Medical TP22G For use with Gaymar Heat Pump
IsoFlo (Isoflurane, USP) Abbott Animal Health 5260-04-05 For imaging and euthanasia
Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor Smiths Medical VCT3K2 For imaging and euthanasia
Ketamine Pharmacist/Veterinarian Anesthetic – Controlled Substance
Kimwipes Kimberly-Clark Professional 34120 Laboratory tissues
Living Image software Caliper Life Sciences For live animal imaging
Luciferin Perkin Elmer 122796 For live animal imaging
Nanodrop 2000 Thermo Scientific ND-2000-US-CAN Spectrophotometer for DNA measurement
Prevantics Swabs Thermo Fisher Scientific 23-100-110 For skin surgery prep
Prolene 5-0 sutures Taper 30" Thermo Fisher Scientific NC0256891 Non-absorbable sutures for skin
Puralube Brand Opthalmic Ointment Patterson Veterinary 07-888-2572 To keep eyes moist during surgery
Trans IT – QR Hydrodynamic Delivery Solution Mirus Bio MIR-5240 Hydrodynamic delivery buffer for diluting DNA
Vicryl 5-0 Sutures J303H Thermo Fisher Scientific NC9816710 Absorbable sutures for muscle layer
Wahl Mini Arco Clipper Med-Vet International 8787-1550 Shaver for skin prep
Xenogen IVIS 200 Caliper Life Sciences For live animal imaging

References

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Cite This Article
Woodard, L. E., Welch, R. C., Williams, F. M., Luo, W., Cheng, J., Wilson, M. H. Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney. J. Vis. Exp. (131), e56324, doi:10.3791/56324 (2018).

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