गुर्दे में प्रोटीन के गैर वायरल अभिव्यक्ति के लिए Hydrodynamic गुर्दे श्रोणि इंजेक्शन
Summary
इस प्रोटोकॉल एक विधि का वर्णन करने के लिए गुर्दे के माध्यम से माउस गुर्दे में प्लाज्मिड डीएनए सुई श्रोणि के लिए विशेष रूप से गुर्दे में transgene अभिव्यक्ति का उत्पादन ।
Abstract
Hydrodynamic इंजेक्शन प्लाज्मिड डीएनए और अन्य पदार्थों के साथ विभिन्न ऊतकों को transfect करने के लिए एक स्थानीय, उच्च दबाव वातावरण बनाता है । Hydrodynamic पूंछ नस इंजेक्शन, उदाहरण के लिए, एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है जिसके द्वारा जिगर transfected किया जा सकता है । इस पांडुलिपि का वर्णन एक आवेदन माउस गुर्दे के इंजेक्शन द्वारा hydrodynamic सिद्धांतों सीधे गुर्दे के लिए प्लाज्मिड डीएनए विशेष जीन अभिव्यक्ति के साथ । चूहों anesthetized रहे हैं और गुर्दे एक पार्श्व चीरा द्वारा एक प्लाज्मिड डीएनए के एक तेजी से इंजेक्शन के बाद से उजागर होता है-सीधे गुर्दे श्रोणि में समाधान युक्त. सुई दस सेकंड के लिए जगह में रखा जाता है और चीरा साइट टांका है । अगले दिन, जीना पशु इमेजिंग, पश्चिमी दाग, या immunohistochemistry के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है परख जीन अभिव्यक्ति, या अंय पसंद की transgene के लिए उपयुक्त परख ब्याज की प्रोटीन का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है । प्रकाशित तरीकों को लंबा जीन अभिव्यक्ति transposon-मध्यस्थता transgene एकीकरण और cyclophosphamide उपचार transgene को प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बाधित शामिल हैं ।
Introduction
hydrodynamic पूंछ नस इंजेक्शन तकनीक माउस जिगर में जीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को प्राप्त करने के लिए एक सामान्य रूप से इस्तेमाल किया तरीका बन गया है1,2. गुर्दे भी इस तकनीक से काफी निचले स्तर पर transfected हैं, लगभग १००-गुना कम3. hydrodynamic गुर्दे श्रोणि इंजेक्शन यहाँ वर्णित एक सरल तरीके से शारीरिक अर्थ के माध्यम से अंग अभिव्यक्ति की विशिष्टता को नियंत्रित करने के लिए एक ही hydrodynamic सिद्धांतों है कि पहले जिगर में स्थापित किया गया है का उपयोग कर प्रदान करता है4,5 , मांसपेशी6, और अन्य अंगों7,8. इस विधि vivo में जीवित पशुओं में कोशिकाओं transfects दबाव और गति का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं में तरल पदार्थ युक्त डीएनए बल, एक साथ अंग है कि जल्दी से हल है9को नुकसान उत्प्रेरण द्वारा । अच्छी तरह से स्थापित सर्जिकल तकनीक का उपयोग एक पार्श्व के माध्यम से गुर्दे की कल्पना करने के लिए10 साथ ही इंसुलिन सिरिंज द्वारा एक इंजेक्शन के साथ, हम गुर्दे की कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के सफल अभिकर्मक पाया है, मुख्यतः मध्यवर्ती fibroblasts, नलिकाओं, और वाहिनी11इकट्ठा । इन चूहों के विच्छेदन से पता चला है कि अंय अंगों के स्तर पर पर्याप्त उच्च luciferase इमेजिंग तकनीक द्वारा कल्पना को transfected नहीं कर रहे है11। के बाद से तकनीक गैर वायरल है, अभिकर्मक के लिए प्लाज्मिड डीएनए का उपयोग तेजी से और इंजेक्शन के लिए आवश्यक एजेंट की आसान तैयारी परमिट ।
हम स्थानीयकृत hydrodynamic इंजेक्शन का इस्तेमाल किया है एंटीऑक्सीडेंट glutathione एस-ट्रांस्फ़्रेज़ A4 व्यक्त करने के लिए, इंसुलिन जैसे विकास कारक-1 रिसेप्टर, और गुर्दे में हार्मोन erythropoietin, सभी की उम्मीद जैविक प्रभाव के साथ11, 12 , 13. प्रशासन के मार्ग का विस्तृत मूल्यांकन, इंजेक्शन की मात्रा, डीएनए खुराक, और प्रमोटर च्वाइस11प्रदर्शन किया गया है । इसके अतिरिक्त, दोनों piggyBac transposon प्रणाली और/या cyclophosphamide उपचार transgene को प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को दबाने के लिए लंबी अवधि के जीन अभिव्यक्ति परिणाम11सुधार दिखाया गया है । अंय जांचकर्ताओं चूहे में सफलता के साथ एक गुर्दे की नस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है, एक से अधिक की समय अवधि के लिए उच्च अभिकर्मक दक्षता प्राप्त करने के14महीने । हालांकि, phenotypes नकल उतार मानव रोग के आनुवंशिक सुधार आमतौर पर सबसे स्तनधारी आनुवंशिक मॉडल माउस मॉडल है के बाद से एक सबूत की अवधारणा के रूप में पहले चूहों में प्रदर्शन कर रहे हैं । हम गुर्दे श्रोणि इंजेक्शन के लिए गुर्दा नस इंजेक्शन की तुलना में और पाया कि इंजेक्शन गुर्दे श्रोणि में जीन अभिव्यक्ति के लिए गुर्दे की नस के लिए बेहतर था (लगभग दस गुना अधिक) और अस्तित्व11। गुर्दे श्रोणि में प्रवेश का एक आदर्श मार्ग है क्योंकि यह पर्याप्त लचीला मूत्र उत्पादन में उतार चढ़ाव बर्दाश्त है और अक्सर अपनी संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने में सक्षम है, जब भी hydronephrosis के दौरान फैली हुई है । इसके अतिरिक्त, गुर्दे श्रोणि में इंजेक्शन गुर्दा कैप्सूल भेदी बिना गुर्दे के लिए उपयोग की अनुमति दी, इंजेक्शन द्रव दिख intraparenchymal इंजेक्शन से बेहतर गुर्दे द्वारा बनाए रखा जा करने के लिए अनुमति देता है । अंय माउस अंगों vasculature के अलावा अंय प्रवेश का एक मार्ग नहीं है, लेकिन गुर्दे के मूत्र अंतरिक्ष एक आदर्श इंजेक्शन साइट है । इसके अतिरिक्त, गुर्दे की नस में इंजेक्शन उदर गुहा में रक्त के रिसाव के परिणामस्वरूप । जंगली प्रकार के माउस गुर्दे की कुल गुर्दे की मात्रा लगभग ०.२ सेमी3होने के लिए चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग द्वारा अनुमान लगाया गया है, तो एक ही गुर्दा की मात्रा तरल गुर्दे श्रोणि द्वारा इंजेक्शन की मात्रा के लगभग बराबर है hydrodynamic इंजेक्शन (१०० µ l)15. इस के साथ साथ, हम hydrodynamic गुर्दे श्रोणि इंजेक्शन प्रोटोकॉल की विस्तृत बारीकियों के सभी उपलब्ध कराई है गुर्दे के प्रतिलिपि अभिकर्मक प्राप्त करने के लिए ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में विशेष रूप से गुर्दे में प्रतिलिपि जीन अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए एक मजबूत तरीका बताया गया है । एक मामूली अनुभवी सर्जन के हाथ में हम इस तकनीक से transfected चूहों के प्रतिशत को 50-100% की सीमा म?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
दिग्गजों मामलों के विभाग से एक कैरियर विकास पुरस्कार [BX002797] समर्थित L.E.W. और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों [R01-DK095867] और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन [15GRNT25700209] समर्थित J.C. राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान [DK093660], दिग्गजों मामलों के विभाग [BX002190], और गुर्दे की बीमारी के लिए वेंडरबिल्ट केंद्र समर्थित M.H.W. इस सामग्री के संसाधनों और VA टेनेसी घाटी स्वास्थ्य सेवा प्रणाली में सुविधाओं के उपयोग के साथ समर्थित काम का परिणाम है ।
Materials
| AnaSed Xylazine | Patterson Veterinary | 07-808-1947 | Anesthetic – Not controlled substance |
| BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch | Cardinal Health | 309306 | Required syringes |
| Buprenex | Pharmacist/Veterinarian | Analgesia – Controlled Substance | |
| Dynarex Disposable Towel Drape | Thermo Fisher Scientific | 19-310-671 | Place over heat pad |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Use only endotoxin-free plasmid DNA |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control | Charles River | PC200 | Positive control for endotoxin test |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial | Charles River | R13500 | Endotoxin test |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5882 | Surgical tool |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouch – 9" | Thermo Fisher Scientific | 01-812-51 | For autoclaving surgical tools |
| Gaymar Heat Pump | Paragon Medical | TP-700 | Water-circulating heat pump |
| Germinator 500 | Roboz Surgical Instrument | DS-401 | To reuse surgical tools during surgery |
| Graefe Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5136 | Surgical tool |
| Graefe Tissue Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5153 | Surgical tool |
| Halsey Needle Holder, 5" Length | Roboz Surgical Instrument | RS-7841 | Surgical tool |
| Heat pads – 15" x 21" – need at least 3 | Paragon Medical | TP22G | For use with Gaymar Heat Pump |
| IsoFlo (Isoflurane, USP) | Abbott Animal Health | 5260-04-05 | For imaging and euthanasia |
| Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor | Smiths Medical | VCT3K2 | For imaging and euthanasia |
| Ketamine | Pharmacist/Veterinarian | Anesthetic – Controlled Substance | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Laboratory tissues |
| Living Image software | Caliper Life Sciences | For live animal imaging | |
| Luciferin | Perkin Elmer | 122796 | For live animal imaging |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000-US-CAN | Spectrophotometer for DNA measurement |
| Prevantics Swabs | Thermo Fisher Scientific | 23-100-110 | For skin surgery prep |
| Prolene 5-0 sutures Taper 30" | Thermo Fisher Scientific | NC0256891 | Non-absorbable sutures for skin |
| Puralube Brand Opthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | To keep eyes moist during surgery |
| Trans IT – QR Hydrodynamic Delivery Solution | Mirus Bio | MIR-5240 | Hydrodynamic delivery buffer for diluting DNA |
| Vicryl 5-0 Sutures J303H | Thermo Fisher Scientific | NC9816710 | Absorbable sutures for muscle layer |
| Wahl Mini Arco Clipper | Med-Vet International | 8787-1550 | Shaver for skin prep |
| Xenogen IVIS 200 | Caliper Life Sciences | For live animal imaging |
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