Bu iletişim kuralı yoluyla renal pelvis transgene özellikle böbrek ifadede üretmek için fare böbrek içine plazmid DNA enjekte yöntemi açıklanır.
Hidrodinamik enjeksiyon plazmid DNA ve diğer maddeler ile çeşitli dokularda transfect için yerel, yüksek basınçlı bir ortam oluşturur. Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon, örneğin, hangi karaciğer transfected iyi kurulmuş bir yöntemdir. Bu el yazması plazmid DNA için böbrek özel gen ekspresyonu ile doğrudan fare böbrek iğne ile bir uygulama hidrodinamik ilkeleri açıklar. Fareler anestezi ve böbrek renal pelvis doğrudan bir plazmid DNA içeren çözüm hızlı bir iğne ile takip bir kanat kesi tarafından yararlanılır. İğneyi yerinde on saniye tutulur ve kesi sitesi dikmiş. Ertesi gün, hayvan görüntüleme live, Western blot veya immünhistokimya gen ekspresyonu tahlil için kullanılabilir veya diğer deneyleri seçim transgene için uygun faiz protein tespiti için kullanılır. Gen ifadesinin uzatmak için yayımlanmış yöntemleri transgene için bağışıklık yanıtını inhibe transposon-aracılı transgene entegrasyon ve siklofosfamid tedavisi içerir.
Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon tekniği gen ekspresyonu fare karaciğer1,2yüksek düzeylerine ulaşmak için yaygın olarak kullanılan bir yol haline gelmiştir. Böbrekler de bu tekniği çok daha alt bir düzeyde, yaklaşık 100-fold daha az3ile transfected. Burada açıklanan hidrodinamik renal pelvis enjeksiyon organ ifade daha önce karaciğer4‘ te,5 kurulmuş aynı hidrodinamik ilkeleri kullanarak fiziksel yollarla özgüllük denetlemek için basit bir yol sağlar , kas6ve diğer organları7,8. Basınç kullanarak canlı hayvan vivo içinde hücrelerde bu yöntem transfects ve aynı anda hızlı bir şekilde organ hasar inducing sıvı içeren DNA hücre zorlamak için hız9çözüldü. Tarafından insülin şırınga ile birlikte tek bir enjeksiyon kanat kesi10 üzerinden böbrek görselleştirmek için köklü cerrahi teknikleri kullanarak, çeşitli böbrek hücre, interstisyel fibroblastlar esas olarak başarılı transfection bulduk, tübüllerin ve toplama kanal11. Bu fareler diseksiyon diğer organ görüntüleme teknikleri11luciferase tarafından görselleştirmek için yüksek düzeyde transfected değil göstermiştir. Teknik olmayan viral olduğu için plazmid DNA kullanımına transfection için enjeksiyon için gerekli reaktifler hızlı ve kolay hazırlanması izin verir.
Antioksidan glutatyon S-transferaz A4, insülin benzeri büyüme faktörü-1 reseptör ve böbrek beklenen biyolojik etkileri11, ile tüm hormon Eritropoetin ifade için yerelleştirilmiş hidrodinamik iğneleri kullandık 12 , 13. yönetim, enjeksiyon hacmi, DNA dozaj ve organizatörü seçim rotanın ayrıntılı değerlendirme gerçekleştirilen11oldu. Ayrıca, bağışıklık reaksiyonu transgene için bastırmak için her iki piggyBac transposon sistemi ve/veya siklofosfamid tedavisi gösterilmiştir uzun vadeli gen ifadesi sonuçlar11geliştirmek için. Diğer araştırmacılar renal ven yaklaşım saat bir ay14daha büyük bir süre için yüksek transfection verimliliği elde başarı, fareyle kullanmışlardır. Ancak, genetik insan hastalığı taklit fenotipleri düzeltilmesi genellikle yapılma farelerde ilk kanıtı-of-concept olarak en memeli genetik modellerini fare modelleri olduğundan. Renal ven enjeksiyon renal pelvis enjeksiyon için karşılaştırıldığında ve renal pelvis içine enjeksiyon renal ven gen ekspresyonu (yaklaşık on daha yüksek) ve hayatta kalma11için daha üstün olduğunu ortaya koymuştur. Renal pelvis idrar üretim dalgalanmalar tolere esnek olduğu için böbrek girdiği ideal bir yoldur ve sık sık ne zaman bile hydronephrosis sırasında genişlemiş, yapısal bütünlüğünü korumak yapabiliyor. Ayrıca, renal pelvis içine enjeksiyon böbrek böbrek kapsülü enjekte sıvı gözle görülür tarafından böbrek intraparenchymal enjeksiyon iyi korunabilmesi izin, piercing olmadan erişebileceğini. Diğer fare organlara girişinin damarlara dışında bir yol var mı ama bir ideal enjeksiyon izi böbrek idrar alanıdır. Ayrıca, renal ven içine enjeksiyon karın boşluğuna kan sızıntı sonuçlandı. Vahşi tipi fare böbrekler toplam böbrek hacmi yaklaşık 0.2 cm3, tek böbrek hacmi yaklaşık renal pelvis tarafından hidrodinamik enjekte sıvı miktarı eşittir olmak manyetik rezonans görüntüleme tarafından tahmin edilmektedir enjeksiyon (100 µL)15. Burada, tüm böbrek tekrarlanabilir transfection elde etmek için hidrodinamik renal pelvis enjeksiyon protokolünün detaylı nüanslar mevcut yaptık.
Bu protokol için tekrarlanabilir gen ekspresyonu özellikle böbrek de ulaşmak için sağlam bir yöntemi açıklanmıştır. Orta derecede deneyimli bir cerrah elinde transgene okuma duyarlılığını ve 50-%100, fare yaş bağlı olarak çeşitli olması için bu tekniği tarafından transfected fareler yüzdesi bulduk. Luciferase gen ekspresyonu düzeyini arka plan üstüne piggyBac Transpozonlar alma farelerde birkaç ay oldu ve tamamen aynı Transpozonlar11alma immün farelerde bi…
The authors have nothing to disclose.
Bir kariyer geliştirme Ödülü gelen Department of Veterans Affairs [BX002797] L.E.W. ve ulusal sağlık Enstitüleri [R01-DK095867] desteklenen ve Amerikan Kalp Derneği [15GRNT25700209] J.C. desteklenen Ulusal Sağlık Enstitüleri [DK093660], Department of Veterans Affairs [BX002190] ve böbrek hastalığı Vanderbilt Merkezi M.H.W. desteklenen Bu malzeme kaynakları ve VA Tennessee Vadisi sağlık sistemine tesislerinin kullanımı ile desteklenen iş sonucudur.
AnaSed Xylazine | Patterson Veterinary | 07-808-1947 | Anesthetic – Not controlled substance |
BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch | Cardinal Health | 309306 | Required syringes |
Buprenex | Pharmacist/Veterinarian | Analgesia – Controlled Substance | |
Dynarex Disposable Towel Drape | Thermo Fisher Scientific | 19-310-671 | Place over heat pad |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Use only endotoxin-free plasmid DNA |
Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control | Charles River | PC200 | Positive control for endotoxin test |
Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial | Charles River | R13500 | Endotoxin test |
Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5882 | Surgical tool |
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouch – 9" | Thermo Fisher Scientific | 01-812-51 | For autoclaving surgical tools |
Gaymar Heat Pump | Paragon Medical | TP-700 | Water-circulating heat pump |
Germinator 500 | Roboz Surgical Instrument | DS-401 | To reuse surgical tools during surgery |
Graefe Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5136 | Surgical tool |
Graefe Tissue Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5153 | Surgical tool |
Halsey Needle Holder, 5" Length | Roboz Surgical Instrument | RS-7841 | Surgical tool |
Heat pads – 15" x 21" – need at least 3 | Paragon Medical | TP22G | For use with Gaymar Heat Pump |
IsoFlo (Isoflurane, USP) | Abbott Animal Health | 5260-04-05 | For imaging and euthanasia |
Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor | Smiths Medical | VCT3K2 | For imaging and euthanasia |
Ketamine | Pharmacist/Veterinarian | Anesthetic – Controlled Substance | |
Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Laboratory tissues |
Living Image software | Caliper Life Sciences | For live animal imaging | |
Luciferin | Perkin Elmer | 122796 | For live animal imaging |
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000-US-CAN | Spectrophotometer for DNA measurement |
Prevantics Swabs | Thermo Fisher Scientific | 23-100-110 | For skin surgery prep |
Prolene 5-0 sutures Taper 30" | Thermo Fisher Scientific | NC0256891 | Non-absorbable sutures for skin |
Puralube Brand Opthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | To keep eyes moist during surgery |
Trans IT – QR Hydrodynamic Delivery Solution | Mirus Bio | MIR-5240 | Hydrodynamic delivery buffer for diluting DNA |
Vicryl 5-0 Sutures J303H | Thermo Fisher Scientific | NC9816710 | Absorbable sutures for muscle layer |
Wahl Mini Arco Clipper | Med-Vet International | 8787-1550 | Shaver for skin prep |
Xenogen IVIS 200 | Caliper Life Sciences | For live animal imaging |