유체역학 신장 골반 주입은 신장에서 단백질의 비 바이러스 성 표현에 대 한
Summary
이 프로토콜에는 신장에 특히 transgene 식 생산 하 신 골반을 통해 마우스 신장에 플라스 미드 DNA를 주입 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
유체역학 주입 transfect 다양 한 조직 플라스 미드 DNA와 다른 물질을 지역, 고압 환경을 만듭니다. 유체역학 꼬리 정 맥 주입, 예를 들어 간 페 될 수 있는 잘 설립 방법입니다. 이 원고는 신장 관련 유전자 발현에 대 한 플라스 미드 DNA와 직접 마우스 신장의 주입에 의해 유체역학 원리의 응용을 프로그램을 설명합니다. 쥐 취 고 신장 신장 골반에 직접 플라스 미드 DNA를 포함 하는 솔루션의 빠른 주입 다음 측면 절 개 하 여 노출 됩니다. 바늘은 10 초에 대 한 장소에 보관 하 고 절 개 사이트 봉합. 다음 날, 라이브 동물 영상, 서쪽 오 점 또는 immunohistochemistry 유전자 발현 분석 결과를 사용할 수 있습니다 또는 관심사의 단백질의 검출에 사용 되는 선택의 transgene에 적합 한 다른 분석 실험. 유전자 발현을 연장 하기 위해 게시 방법은 transgene 면역 반응을 억제 하 중재 하는 transposon transgene 통합과 cyclophosphamide 치료를 포함 합니다.
Introduction
유체역학 꼬리 정 맥 주입 기술은 마우스 간1,2유전자 발현의 높은 수준을 달성 하기 위해 일반적으로 사용 되는 되고있다. 신장은 또한 훨씬 더 낮은 수준, 약 100 적은3에서이 기술에 의해 페. 여기에 설명 된 유체역학 신장 골반 사출 간4,5 이전 설립 되었습니다 동일한 유체역학 원리를 사용 하 여 물리적 수단을 통해 장기 식의 특이성을 제어 하는 간단한 방법 제공 ,6, 근육 및 다른 기관7,8. 이 메서드는 압력을 사용 하 여 셀 vivo에서 동물에 transfects와 동시에 신속 하 게 기관에 손상을 유발 셀에 액체 포함 DNA를 강제로 속도 해결9. 인슐린 주사기에 의해 단일 주사 함께 측면 절 개10 통해 신장 시각화 확고 외과 기술을 사용 하 여, 우리는 다양 한 종류의 신장 세포, 주로 간 질 성 섬유 아 세포의 성공적인 transfection 발견 tubules, 그리고 모으는 덕트11. 이러한 쥐의 해 부 다른 장기 luciferase 이미징 기법11여 시각화 충분히 높은 수준에서 페 하지는 보이고 있다. 기술은 아닌 바이러스 이기 때문에, transfection에 대 한 플라스 미드 DNA의 사용 사출에 필요한 시 약의 빠르고 쉬운 준비를 허용 합니다.
우리 항 산화 glutathione S-전이 효소 A4, 인슐린 같은 성장 인자 1 수용 체 모두 예상된 생물학적 효과11, 와 함께 신장에서 호르몬 리스로 표현 하는 지역화 된 유체역학 주사를 사용 12 , 13. 경로 관리, 주입 량, DNA 복용량, 및 발기인 선택의 상세한 평가 수행된11되었습니다. 또한, 두 piggyBac transposon 시스템 또는 cyclophosphamide 치료는 transgene 면역 반응 억제를 장기 진 식 결과11을 개선 하기 위해 표시 되었습니다. 다른 조사 성공, 한 달14보다 큰 시간 동안 높은 transfection 효율을 달성 쥐에서 신장 정 맥 접근을 사용 했습니다. 그러나, 인간의 질병을 흉내 낸 고기의 유전 수정 일반적으로 수행 됩니다 마우스 처음 개념 증명으로 이후 가장 포유류 유전자 모델은 마우스 모델. 우리 신장 골반 주입에 신장 정 맥 주입을 비교 하 고 신장 골반에 주입 (약 10 배 더 높은) 유전자 발현 및 생존11신장 정 맥에 우수한 발견. 신장 골반 신장에 항목의 이상적인 경로 때문에 용납 소변 생산에 변동에 유연 이며 종종 hydronephrosis 동안 넓힐 경우에 그것의 구조적 무결성을 유지할 수 있습니다. 또한, 신장 골반에 주입 주입된 유체 가시 intraparenchymal 주입 보다는 더 나은 신장에 의해 유지 될 수 있도록 신장 캡슐을 관통 하지 않고 신장에 대 한 액세스를 허용 합니다. 다른 마우스 장기 맥 관 구조, 다른 항목의 경로 필요가 없습니다 하지만 신장 비뇨 기 공간 이상적인 사출 사이트입니다. 또한, 신장 정 맥에 주사는 복 부 구멍으로 혈액의 누설에 결과. 야생-타입 마우스 신장의 총 신장 볼륨 단일 신장의 볼륨은 약 신장 골반 유체에 의해 주입 액체의 양을에 약 0.2 c m3를 자기 공명 영상으로 추정 되었다 주입 (100 µ L)15. 여기, 우리는 가능 신장 재현할 transfection를 달성 하기 위해 유체역학 신장 골반 주입 프로토콜의 자세한 뉘앙스의 모든.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서 신장에 특히 재현 유전자 발현을 달성 하기 위한 강력한 메서드를 설명 합니다. 적당히 경험 있는 외과 의사의 손에 우리 쥐 마우스 나이 따라 50-100%의 범위와는 transgene의 판독의 감도에이 기술에 의해 페의 비율을 발견 했다. Luciferase 유전자 발현의 수준 배경 위에서 마우스 piggyBac transposons 수신에 몇 달 동안 되었고 완전히 immunocompromised 쥐 같은 transposons11</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
경력 개발 수상에서의 재향 군인 담당 부서 [BX002797] L.E.W. 및 건강의 국가 학회 [R01-DK095867] 및 미국 심 혼 협회 [15GRNT25700209] 제 지원 건강의 국가 학회 [DK093660], 재향 군인 담당 부서 [BX002190], 및 신장 질환에 대 한 밴 더 빌 트 센터 지원 M.H.W. 이 물자 자원 및 버지니아 테네시 밸리 의료 시스템 시설의 사용 지원 작업의 결과 이다.
Materials
| AnaSed Xylazine | Patterson Veterinary | 07-808-1947 | Anesthetic – Not controlled substance |
| BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch | Cardinal Health | 309306 | Required syringes |
| Buprenex | Pharmacist/Veterinarian | Analgesia – Controlled Substance | |
| Dynarex Disposable Towel Drape | Thermo Fisher Scientific | 19-310-671 | Place over heat pad |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Use only endotoxin-free plasmid DNA |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control | Charles River | PC200 | Positive control for endotoxin test |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial | Charles River | R13500 | Endotoxin test |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5882 | Surgical tool |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouch – 9" | Thermo Fisher Scientific | 01-812-51 | For autoclaving surgical tools |
| Gaymar Heat Pump | Paragon Medical | TP-700 | Water-circulating heat pump |
| Germinator 500 | Roboz Surgical Instrument | DS-401 | To reuse surgical tools during surgery |
| Graefe Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5136 | Surgical tool |
| Graefe Tissue Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5153 | Surgical tool |
| Halsey Needle Holder, 5" Length | Roboz Surgical Instrument | RS-7841 | Surgical tool |
| Heat pads – 15" x 21" – need at least 3 | Paragon Medical | TP22G | For use with Gaymar Heat Pump |
| IsoFlo (Isoflurane, USP) | Abbott Animal Health | 5260-04-05 | For imaging and euthanasia |
| Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor | Smiths Medical | VCT3K2 | For imaging and euthanasia |
| Ketamine | Pharmacist/Veterinarian | Anesthetic – Controlled Substance | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Laboratory tissues |
| Living Image software | Caliper Life Sciences | For live animal imaging | |
| Luciferin | Perkin Elmer | 122796 | For live animal imaging |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000-US-CAN | Spectrophotometer for DNA measurement |
| Prevantics Swabs | Thermo Fisher Scientific | 23-100-110 | For skin surgery prep |
| Prolene 5-0 sutures Taper 30" | Thermo Fisher Scientific | NC0256891 | Non-absorbable sutures for skin |
| Puralube Brand Opthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | To keep eyes moist during surgery |
| Trans IT – QR Hydrodynamic Delivery Solution | Mirus Bio | MIR-5240 | Hydrodynamic delivery buffer for diluting DNA |
| Vicryl 5-0 Sutures J303H | Thermo Fisher Scientific | NC9816710 | Absorbable sutures for muscle layer |
| Wahl Mini Arco Clipper | Med-Vet International | 8787-1550 | Shaver for skin prep |
| Xenogen IVIS 200 | Caliper Life Sciences | For live animal imaging |
References
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