Inyección hidrodinámica la Pelvis Renal para la no expresión de proteínas en el riñón
Summary
Este protocolo describe un método para inyectar ADN plásmido en el riñón de ratón a través de la pelvis renal para producir la expresión del transgen específicamente en el riñón.
Abstract
Inyección hidrodinámica crea un ambiente local, alta presión para transfectar varios tejidos con ADN plasmídico y otras sustancias. Inyección en la vena hidrodinámica cola, por ejemplo, es un método bien establecido de que el hígado puede ser transfectado. Este manuscrito describe una aplicación de los principios hidrodinámicos por inyección del riñón de ratón directamente con ADN de plásmido de expresión génica específicos de riñón. Ratones son anestesiados y se expone el riñón por una incisión flanco seguida de una inyección rápida de un plásmido que contiene el ADN de la solución directamente en la pelvis renal. La aguja se mantiene en el lugar durante diez segundos y el sitio de la incisión es suturado. Al día siguiente, en vivo la proyección de imagen animal, Western blot o inmunohistoquímica puede utilizarse para análisis de expresión génica, u otros ensayos para el transgén de la opción se utilizan para la detección de la proteína de interés. Métodos publicados para prolongar la expresión de genes incluyen el transgén mediada por transposones integración y ciclofosfamida tratamiento para inhibir la respuesta inmune a la transgénica.
Introduction
La técnica de inyección hidrodinámica cola vena se ha convertido en una forma comúnmente usada para alcanzar altos niveles de expresión génica en mouse de hígado1,2. Los riñones también son transfectados por esta técnica en un nivel mucho más bajo, aproximadamente 100-fold menos3. La inyección hidrodinámica renal pelvis descrita aquí proporciona una manera simple para controlar la especificidad de la expresión del órgano a través de medios físicos, utilizando los mismos principios hidrodinámicos que se han establecido previamente en el hígado4,5 , músculo6y otros órganos7,8. Este método transfects las células de animales vivos en vivo mediante el uso de presión y velocidad para forzar fluido que contienen ADN en las células, induciendo simultáneamente daño al órgano que es rápidamente resueltos9. Usando técnicas quirúrgicas bien establecidas para visualizar el riñón a través de una incisión de flanco10 junto con una sola inyección de la jeringuilla de la insulina, hemos encontrado exitosa transfección de varios tipos de células del riñón, principalmente fibroblastos intersticiales, túbulos y conductos que recoge11. La disección de estos ratones ha demostrado que otros órganos no son transfectados en niveles suficientemente altos como para visualizar por luciferase imágenes técnicas11. Ya que la técnica es no-viral, uso de ADN plásmido para transfección permite fácil y rápida preparación de los reactivos necesarios para la inyección.
Hemos utilizado las inyecciones localizadas de hidrodinámicas para expresar el antioxidante glutatión S-transferasa A4, el receptor de factor de crecimiento 1 similar a la insulina y la hormona eritropoyetina en el riñón, con los esperados efectos biológicos11, 12 , 13. evaluación detallada de la ruta de administración, volumen de inyección, dosis de ADN y elección del promotor ha sido realizado11. Además, tanto en el piggyBac transposon sistema o ciclofosfamida tratamiento para suprimir la reacción inmune a la transgénica han demostrado para mejorar a largo plazo de los resultados de expresión génica11. Otros investigadores han utilizado un enfoque de la vena renal en rata con éxito, logrando eficiencia de transfección alta durante períodos de tiempo de más de un mes14. Sin embargo, la corrección genética de fenotipos mímico enfermedad humana se realizan generalmente en ratones primero como una prueba de concepto ya que los modelos genéticos más mamíferos son modelos de ratón. En comparación con la inyección en la vena renal a la inyección de la pelvis renal y encontraron que la inyección en la pelvis renal es superior a la vena renal para la expresión de genes (aproximadamente diez veces mayor) y supervivencia11. La pelvis renal es la vía ideal de entrada en el riñón porque es lo suficientemente flexible para tolerar fluctuaciones en la producción de orina y a menudo es capaz de mantener su integridad estructural, incluso cuando se dilatan durante la hidronefrosis. Adicionalmente, la inyección en la pelvis renal permite acceso al riñón sin perforación de la cápsula del riñón, permitiendo que el líquido inyectado para conservarse visiblemente por el riñón mejor que la inyección de la intraparenchymal. Otros órganos de ratón no tiene una ruta de entrada distinta a la vasculatura y el espacio urinario del riñón es un sitio ideal de la inyección. Además, la inyección en la vena renal dio lugar a la salida de sangre en la cavidad abdominal. El volumen total renal de riñones de tipo salvaje ratón ha estimado la proyección de imagen de resonancia magnética a ser aproximadamente de 0,2 cm3, por lo que el volumen de un solo riñón es aproximadamente igual a la cantidad de líquido inyectado por la hidrodinámica de la pelvis renal inyección (100 μL)15. En este documento, nos hemos puesto a disposición todos los matices detallados del Protocolo de inyección hidrodinámica la pelvis renal para lograr reproducible de la transfección del riñón.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo se describe un método robusto para alcanzar expresión génica reproducible específicamente en el riñón. En manos de un cirujano experimentado moderado encontramos el porcentaje de ratones transfectadas por esta técnica en el rango de 50-100%, dependiendo de la edad del ratón y la sensibilidad de la lectura del transgén. El nivel de expresión del gen de luciferasa fue sobre el fondo durante varios meses en ratones recibiendo transposones piggyBac y totalmente mantenida durante varias se…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Un premio de desarrollo de carrera del Departamento de Asuntos Veteranos [BX002797] apoyó L.E.W. y los institutos nacionales de salud [R01-DK095867] y Asociación Americana del corazón [15GRNT25700209] apoyado J.C. Los institutos nacionales de salud [DK093660], Departamento de asuntos de veteranos [BX002190] y el centro de Vanderbilt para enfermedad renal compatible M.H.W. Este material es el resultado del trabajo apoyado con recursos y uso de instalaciones en el sistema de Healthcare del Valle de Tennessee de VA.
Materials
| AnaSed Xylazine | Patterson Veterinary | 07-808-1947 | Anesthetic – Not controlled substance |
| BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch | Cardinal Health | 309306 | Required syringes |
| Buprenex | Pharmacist/Veterinarian | Analgesia – Controlled Substance | |
| Dynarex Disposable Towel Drape | Thermo Fisher Scientific | 19-310-671 | Place over heat pad |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Use only endotoxin-free plasmid DNA |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control | Charles River | PC200 | Positive control for endotoxin test |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial | Charles River | R13500 | Endotoxin test |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5882 | Surgical tool |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouch – 9" | Thermo Fisher Scientific | 01-812-51 | For autoclaving surgical tools |
| Gaymar Heat Pump | Paragon Medical | TP-700 | Water-circulating heat pump |
| Germinator 500 | Roboz Surgical Instrument | DS-401 | To reuse surgical tools during surgery |
| Graefe Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5136 | Surgical tool |
| Graefe Tissue Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5153 | Surgical tool |
| Halsey Needle Holder, 5" Length | Roboz Surgical Instrument | RS-7841 | Surgical tool |
| Heat pads – 15" x 21" – need at least 3 | Paragon Medical | TP22G | For use with Gaymar Heat Pump |
| IsoFlo (Isoflurane, USP) | Abbott Animal Health | 5260-04-05 | For imaging and euthanasia |
| Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor | Smiths Medical | VCT3K2 | For imaging and euthanasia |
| Ketamine | Pharmacist/Veterinarian | Anesthetic – Controlled Substance | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Laboratory tissues |
| Living Image software | Caliper Life Sciences | For live animal imaging | |
| Luciferin | Perkin Elmer | 122796 | For live animal imaging |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000-US-CAN | Spectrophotometer for DNA measurement |
| Prevantics Swabs | Thermo Fisher Scientific | 23-100-110 | For skin surgery prep |
| Prolene 5-0 sutures Taper 30" | Thermo Fisher Scientific | NC0256891 | Non-absorbable sutures for skin |
| Puralube Brand Opthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | To keep eyes moist during surgery |
| Trans IT – QR Hydrodynamic Delivery Solution | Mirus Bio | MIR-5240 | Hydrodynamic delivery buffer for diluting DNA |
| Vicryl 5-0 Sutures J303H | Thermo Fisher Scientific | NC9816710 | Absorbable sutures for muscle layer |
| Wahl Mini Arco Clipper | Med-Vet International | 8787-1550 | Shaver for skin prep |
| Xenogen IVIS 200 | Caliper Life Sciences | For live animal imaging |
References
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