Etter nyresvikt bekkenet injeksjon for ikke-viral uttrykk for proteiner i nyre
Summary
Denne protokollen beskriver en metode for å injisere plasmider DNA i mus nyre via nyresvikt bekkenet å produsere transgene uttrykk spesielt i nyret.
Abstract
Etter injeksjon oppretter en lokal, høytrykks miljø for å transfect ulike vev med plasmider DNA og andre stoffer. Etter halen blodåre injeksjon, for eksempel er en etablert metode som leveren kan være transfected. Dette manuskriptet beskriver et program etter prinsipper ved injeksjon av mus nyre direkte med plasmider DNA for nyre-spesifikke genuttrykk. Mus er anesthetized og nyre utløses av en flanke snitt etterfulgt av en rask injeksjon av en plasmider DNA inneholder løsning direkte til nyresvikt bekkenet. Nålen holdes på plass i ti sekunder og webområdet snitt Burrows. Dagen live dyr bildebehandling, Western blot, eller immunohistochemistry kan brukes til analysen genuttrykk eller andre analyser til transgene valgfrihet brukes for påvisning av protein av interesse. Publisert metoder for å forlenge genuttrykk inkluderer transposon-mediert transgene integrering og cyklofosfamid behandling for å hemme immunforsvaret til av transgene.
Introduction
Etter halen blodåre injeksjon teknikken har blitt en vanlig måte å oppnå høye nivåer av genuttrykk i musen leveren1,2. Nyrene er også transfekterte av denne teknikken på et mye lavere nivå, ca 100 ganger mindre3. Etter nyresvikt bekkenet injeksjon beskrevet her gir en enkel måte å kontrollere spesifisiteten av orgel uttrykk gjennom fysiske midler de samme etter prinsippene som ble opprettet tidligere i leveren4,5 , muskel6og andre organer7,8. Denne metoden transfects celler i levende dyr i vivo ved hjelp av press og fart å tvinge væske som inneholder DNA i cellene, samtidig inducing skade orglet som er raskt løst9. Bruke veletablerte kirurgiske teknikker for å visualisere nyre via en flanke snitt10 sammen med en enkelt injeksjon av insulin sprøyten, har vi funnet vellykket transfection ulike typer nyreceller, hovedsakelig interstitiell fibroblaster, tubuli og samle duct11. Disseksjon av disse musene har vist at andre organer ikke er transfekterte på et nivå høyt nok til å visualisere ved luciferase imaging teknikker11. Siden teknikken er ikke-viral, tillater bruk av plasmider DNA for transfection raskt og enkelt forberedelse av reagenser kreves for injeksjon.
Vi har brukt lokaliserte etter injeksjoner uttrykke antioksidant glutation S-transferase A4, insulin-lignende vekstfaktor 1 reseptoren og hormon erytropoietin i nyrene, alle med den forventede biologiske effekter11, 12 , 13. detaljert evaluering av administrasjonen, injeksjon volum, DNA dosering og promoter valg har vært utført11. I tillegg både piggyBac transposon system og/eller cyklofosfamid behandling å undertrykke immunreaksjon til av transgene vist seg å forbedre langsiktig genet uttrykk utfall11. Andre etterforskere har brukt en nyre blodåre tilnærming i rotte med suksess, oppnå høy transfection effektivitet for perioder på mer enn én måned14. Imidlertid genetisk korrigering av fenotyper mimicking menneskelig sykdom vanligvis utføres i mus først som en proof-of-concept siden de fleste pattedyr genetisk modeller er musen modeller. Vi sammenlignet nyre blodåre injeksjon til nyresvikt bekkenet injeksjon og fant at injeksjon i nyresvikt bekkenet var overlegen nyre venen for genuttrykk (ca ti-fold høyere) og overlevelse11. Nyresvikt bekkenet er en ideell ruten trer i nyrene fordi det er fleksibel nok til å tåle svingninger i urin produksjon og er ofte kjøpedyktig vedlikeholde dens strukturelle integritet selv når utvidet under hydronephrosis. I tillegg injeksjon i nyresvikt bekkenet tilgang til nyrene uten piercing nyre kapselen, slik at de injiserte væsken beholdes synlig av nyre bedre enn intraparenchymal injeksjon. Andre mus organer har ikke en rute posten enn er blodkar, men urin løpet av nyre er en ideell injeksjonsstedet. I tillegg resulterte injeksjon i nyre venen i lekkasje av blod i bukhulen. Totalt nyre volumet av vill-type mus nyrene har blitt anslått av magnetisk resonans imaging å være ca 0.2 cm3, slik at volumet av en enkelt nyre er omtrent lik mengden av væske injisert med nyresvikt bekkenet etter injeksjon (100 µL)15. Her, har vi gjort alle detaljerte nyansene av etter nyresvikt bekkenet injeksjon protokollen for å oppnå reproduserbar transfection av nyret.
Protocol
Representative Results
Discussion
En robust metode for å oppnå reproduserbar genuttrykk spesielt i nyret er beskrevet i denne protokollen. Vi har funnet prosentandelen av mus transfekterte av denne teknikken til å være i størrelsesorden 50-100%, avhengig av musen alder og følsomheten til presentasjon av transgene i hendene på en middels erfaren kirurg. Luciferase genuttrykk var bakgrunnen for månedene i mus mottar piggyBac transposons og opprettholdt helt i flere uker i immunsupprimerte mus mottar de samme transposons11…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
En karriere Development Award fra Institutt for Veteraner saker [BX002797] støttede L.E.W. og National Institutes of Health [R01-DK095867] og American Heart Association [15GRNT25700209] støttet JC National Institutes of Health [DK093660], Department of Veterans Affairs [BX002190] og Vanderbilt Center for nyresykdom støttet M.H.W. Dette materialet er resultatet av arbeidet støttes og bruk av VA Tennessee Valley Healthcare system.
Materials
| AnaSed Xylazine | Patterson Veterinary | 07-808-1947 | Anesthetic – Not controlled substance |
| BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch | Cardinal Health | 309306 | Required syringes |
| Buprenex | Pharmacist/Veterinarian | Analgesia – Controlled Substance | |
| Dynarex Disposable Towel Drape | Thermo Fisher Scientific | 19-310-671 | Place over heat pad |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Use only endotoxin-free plasmid DNA |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control | Charles River | PC200 | Positive control for endotoxin test |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial | Charles River | R13500 | Endotoxin test |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5882 | Surgical tool |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouch – 9" | Thermo Fisher Scientific | 01-812-51 | For autoclaving surgical tools |
| Gaymar Heat Pump | Paragon Medical | TP-700 | Water-circulating heat pump |
| Germinator 500 | Roboz Surgical Instrument | DS-401 | To reuse surgical tools during surgery |
| Graefe Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5136 | Surgical tool |
| Graefe Tissue Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5153 | Surgical tool |
| Halsey Needle Holder, 5" Length | Roboz Surgical Instrument | RS-7841 | Surgical tool |
| Heat pads – 15" x 21" – need at least 3 | Paragon Medical | TP22G | For use with Gaymar Heat Pump |
| IsoFlo (Isoflurane, USP) | Abbott Animal Health | 5260-04-05 | For imaging and euthanasia |
| Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor | Smiths Medical | VCT3K2 | For imaging and euthanasia |
| Ketamine | Pharmacist/Veterinarian | Anesthetic – Controlled Substance | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Laboratory tissues |
| Living Image software | Caliper Life Sciences | For live animal imaging | |
| Luciferin | Perkin Elmer | 122796 | For live animal imaging |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000-US-CAN | Spectrophotometer for DNA measurement |
| Prevantics Swabs | Thermo Fisher Scientific | 23-100-110 | For skin surgery prep |
| Prolene 5-0 sutures Taper 30" | Thermo Fisher Scientific | NC0256891 | Non-absorbable sutures for skin |
| Puralube Brand Opthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | To keep eyes moist during surgery |
| Trans IT – QR Hydrodynamic Delivery Solution | Mirus Bio | MIR-5240 | Hydrodynamic delivery buffer for diluting DNA |
| Vicryl 5-0 Sutures J303H | Thermo Fisher Scientific | NC9816710 | Absorbable sutures for muscle layer |
| Wahl Mini Arco Clipper | Med-Vet International | 8787-1550 | Shaver for skin prep |
| Xenogen IVIS 200 | Caliper Life Sciences | For live animal imaging |
References
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Human Gene Therapy. 10, 1735-1737 (1999).
- Fumoto, S., Nishimura, K., Nishida, K., Kawakami, S. Three-Dimensional Imaging of the Intracellular Fate of Plasmid DNA and Transgene Expression: ZsGreen1 and Tissue Clearing Method CUBIC Are an Optimal Combination for Multicolor Deep Imaging in Murine Tissues. PLoS One. 11 (1), e0148233 (2016).
- Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume. Gene Ther. 13 (24), 1696-1702 (2006).
- Kamimura, K., Suda, T., Xu, W., Zhang, G., Liu, D. Image-guided, lobe-specific hydrodynamic gene delivery to swine liver. Mol Ther. 17 (3), 491-499 (2009).
- Kamimura, K., Zhang, G., Liu, D. Image-guided,intravascular hydrodynamic gene delivery to skeletal muscle in pigs. Mol Ther. 18 (1), 93-100 (2010).
- Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Mol.Ther. 15 (12), 2063-2069 (2007).
- Alino, S. F., et al. Naked DNA delivery to whole pig cardiac tissue by coronary sinus retrograde injection employing non-invasive catheterization. J Gene Med. 12 (11), 920-926 (2010).
- Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver. Gene Ther. 14 (2), 129-137 (2007).
- Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. J Vis Exp. (78), (2013).
- Woodard, L. E., et al. Kidney-specific transposon-mediated gene transfer in vivo. Sci Rep. 7, 44904 (2017).
- Liang, A., et al. Loss of glutathione S-transferase A4 accelerates obstruction-induced tubule damage and renal fibrosis. Journal of Pathology. 228 (4), 448-458 (2012).
- Liang, M., et al. Protective role of insulin-like growth factor-1 receptor in endothelial cells against unilateral ureteral obstruction-induced renal fibrosis. Am J Pathol. 185 (5), 1234-1250 (2015).
- Corridon, P. R., et al. A method to facilitate and monitor expression of exogenous genes in the rat kidney using plasmid and viral vectors. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (9), F1217-F1229 (2013).
- Wallace, D. P., et al. Tracking kidney volume in mice with polycystic kidney disease by magnetic resonance imaging. Kidney Int. 73 (6), 778-781 (2008).
- Woodard, L. E., Wilson, M. H. piggyBac-ing models and new therapeutic strategies. Trends Biotechnol. 33 (9), 525-533 (2015).
- Yeikilis, R., et al. Hydrodynamics based transfection in normal and fibrotic rats. World J Gastroenterol. 12 (38), 6149-6155 (2006).
- Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. J Vis Exp. (41), (2010).
- Wooddell, C. I., et al. Muscle damage after delivery of naked plasmid DNA into skeletal muscles is batch dependent. Hum Gene Ther. 22 (2), 225-235 (2011).
- Crespo, A., et al. Hydrodynamic liver gene transfer mechanism involves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocytic vesicles. Gene Ther. 12 (11), 927-935 (2005).
- Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).
