Summary
Organoid intestinale culture sono stabilite da cripte interi e non consentono l'analisi di auto-rinnovamento e differenziazione in modo specifico delle cellule. Questo protocollo descrive la ricostituzione del gambo ordinato (Lgr5+) e cellule (Paneth), che danno luogo a organoids consentendo loro previa modificazione biochimica e genetica e analisi funzionale di nicchia.
Abstract
L'epitelio intestinale è caratterizzata da un tasso di turnover estremamente rapida. Nei mammiferi, l'intero rivestimento epiteliale si rinnova entro 4-5 giorni. Le cellule staminali adulte intestinale risiedono nella parte inferiore delle cripte di Lieberkühn, sono state stanziate dall'espressione del gene Lgr5 e preservare l'omeostasi attraverso loro caratteristico alto tasso proliferativo1. In tutto l'intestino tenue, Lgr5+ cellule staminali sono mescolareate con le cellule secretorie specializzate chiamate cellule di Paneth. Cellule di Paneth secernono composti antibatterici (cioè, il lisozima e cryptdins/defensine) ed esercitano un ruolo di controllo sulla flora intestinale. Più recentemente, una funzione di romanzo è stato scoperto per cellule di Paneth, vale a dire la loro capacità di fornire supporto di nicchia di cellule staminali Lgr5+ attraverso diversi ligandi chiave come Wnt3, EGF e Dll12.
Quando isolato ex vivo e coltivate in presenza di specifici fattori di crescita e di componenti della matrice extracellulare, cripte intestinali intero danno luogo a longevo e autorinnovanti strutture 3D chiamato organoids che ricordano molto il cripta-villo architettura epiteliale del piccolo intestino adulto3. Organoid culture, quando stabilito da tutta cripte, consentono lo studio di auto-rinnovamento e differenziazione della nicchia staminale intestinale, senza però affrontare il contributo dei suoi singoli componenti, vale a dire la Lgr5+ e Cellule di Paneth.
Qui, descriviamo un nuovo approccio per il dosaggio di organoid che sfrutta la capacità di Paneth e Lgr5+ cellule per associare e formare organoids quando co-coltivate. Questo approccio, definito come "dosaggio di ricostituzione organoid" (ORA), consente la modifica genetica e biochimica di Paneth o Lgr5+ cellule staminali, seguite da ricostituzione in organoids. Come tale, consente l'analisi funzionale dei due principali componenti della nicchia staminale intestinale.
Introduction
L'epitelio intestinale è il tessuto più rapida auto-propagarsi nel corpo dei mammiferi e, come tale, è stato oggetto di una pletora di studi finalizzati alla identificazione e caratterizzazione funzionale delle cellule staminali adulte che risiedono nella parte inferiore della cripta di Lieberkühn, stanziato dall'espressione del gene di Lgr5 e dalla canonica Wnt segnali1. In particolare, le cellule staminali Lgr5+ sono affiancate e supportate da cellule specializzate di nicchia, cioè cellule di Paneth, che dipendono anche dalla segnalazione di Wnt per loro maturazione2. Insieme, questi due tipi di cellule sono alla base di auto-rinnovamento del rivestimento epiteliale intestinale e preservare l'equilibrio omeostatico giornaliero: Lgr5+ cellule staminali rapidamente dividersi e dare origine a cellule progenitrici e più specializzata intestinale epiteliale cellule; Cellule di Paneth forniscono fattori essenziali di nicchia (ad es., Dll1, Wnt3, EGF) a Lgr5+ 2le cellule staminali. La capacità delle cripte intestinali quando placcato ex vivo per formare le strutture organizzate e autorinnovabile chiamato organoids, o "mini-coraggio", è stata sfruttata come strumento sperimentale per fornire la comprensione nei processi quali auto-rinnovamento e differenziazione in condizioni normali e patologiche, tra cui cancro4. Organoid culture sono state stabilite da diversi tessuti, tra cui l'intestino, pancreas, fegato e rene, da campioni umani4sia il mouse. Il metodo di estrazione e i fattori di crescita impiegati per sviluppare queste culture organoid sono tessuto-specifici e progettati per guidare la differenziazione multi-lignaggio e imitare quanto più possibile l'originale nicchia staminale in vivo. Organoids possono avere potenziali applicazioni compreso il trattamento di malattie genetiche, la valutazione dell'efficacia terapeutica nel cancro, l'analisi della tossicità della droga o lo studio dell'organogenesi in vitro5.
Nel complesso, la limitazione principale di organoid culture quando stabilito dai campioni di tessuto è una mancanza di specificità delle cellule. Ad esempio, intestinale organoids stabilito da cripte intestinali intero non consentono l'analisi dei singoli componenti cellulari, incluso all'interno dell'origine del tessuto (ad esempio, contengono cripte tutta Lgr5+, Paneth, e cellule progenitrici).
Qui, descriviamo un metodo novello, indicato come ORA, che unisce i vantaggi delle culture organoid intestinale con l'analisi funzionale delle sue componenti fondamentali, vale a dire (Lgr5+) cellule staminali e nicchia (Paneth). Ciò si realizza attraverso la capacità unica di Paneth e Lgr5+ cellule per associare fisicamente a vicenda quando co-incubate e danno luogo a organoids2,6,10. Abbiamo approfittato di questa funzionalità e pre-trattati singolarmente i due tipi cellulari prima di consentire loro di ricostituire organoids. In tal caso, ciascun componente delle cellule possa essere esposti a qualsiasi dato farmaco, fattore di crescita, biochimici inibitore, modificazione genetica o trattamento chimico prima della ricostituzione e formazione organoid. Quindi, usando l'analisi ORA permetterà la determinazione di se un trattamento specifico o la modificazione genetica ha un effetto specifico sulle cellule staminali o loro controparte di nicchia.
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Protocol
Tutte le procedure sono state fatte secondo le linee guida e le leggi locali benessere degli animali.
1. preparazione di strumenti, mezzi di coltura e piatti
- Set di autoclave 1 di Forbici intestinali normali forbici e pinze in un contenitore sterile.
- Posizionare un piatto di 96 pozzetti (fondo piatto) in un incubatore a 37 ° C.
- Preparare 10 mL di terreno di coltura completa con i reagenti elencati nella tabella dei materiali.
- Incubare la sostanza completa a 37 ° C in un bagno d'acqua.
- Scongelare la membrana basale ricostituita collocandolo in un secchio di ghiaccio. La membrana basale ricostituita diventerà liquida a 4 ° C.
- Riempire 4 capsule di Petri con soluzione tampone fosfato e freddo o abbreviato PBS (4 ° C).
2. isolamento di piccole cripte intestinali
- Sacrificio per inalazione di CO2 , un mouse - eGFP-IRES-CreERt2 Lgr5su uno sfondo di C57BL6/J. Sezionare il peritoneo longitudinalmente con un paio di forbici.
- Tenere lo stomaco con il forcipe e tagliato trasversalmente a metà.
- Usando le forbici intestinali da ora in poi, tirare fuori l'intestino e metterlo in una capsula di Petri contenente PBS.
Nota: Forbici intestinali hanno un forte e una punta smussata. La punta smussata di queste forbici è destinata a non danneggiare l'architettura cripta-villo durante l'apertura dell'intestino. - Iniziare posizionando la punta smussata nello stomaco e spingerlo delicatamente attraverso il piloro. Procedere tagliando con le forbici e tirando con il forcipe.
- Una volta aperto longitudinalmente l'intero piccolo intestino, lavate in PBS freddo tenendolo con le pinze e sciacquare delicatamente con la soluzione di PBS con movimenti a forma di U.
- Una volta che vengono cancellati tutti i residui di feci, procedere per appiattire l'intestino su un tagliere, luminal rivolta verso l'alto. Il lato Luminale è facilmente riconoscibile dall'assenza di vasi sanguigni e dal suo aspetto pallido se confrontato con la parte esterna.
- Con una lastra di vetro, rimuovere delicatamente i villi raschiando l'intestino appiattito. Eseguire questo passaggio due volte lungo tutta la lunghezza del tessuto.
- Tagliare l'intestino tenue con una lama chirurgica sterile in pezzi di 2-5 mm.
- Posizionare i piccoli frammenti intestinali in un tubo da 50 mL contenente 10 mL di PBS freddo ghiaccio.
- Pulire i frammenti di tessuto, rimuovere eventuali impurità rimanenti pipettando su e giù in PBS. Eliminare il surnatante e ripetere questo passaggio finché il PBS è completamente chiaro.
- Aggiungere 15 mL di PBS freddo, per portare il volume finale totale di PBS a 25 mL. Aggiungere 2 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare per 45 min su un rullo a 4 ° C.
- Scartare l'EDTA/PBS.
- Aggiungere 10 mL di PBS e staccare le cripte pipettando duramente i frammenti di tessuto su e giù (almeno tre volte). Raccogliere il surnatante.
- Ripetere il punto 2.13 quattro volte. Aggiungere il terreno di coltura per raggiungere un volume finale di 50 mL.
- Agglomerare le cellule mediante centrifugazione (300 x g per 5 min).
- Risospendere il pellet in 10 mL di terreno di coltura e pellet cripte mediante centrifugazione (80 x g per 3 min).
3. singola cella preparazione
- Scartare il surnatante delle cripte pellettate e li risospendere in enzimi come tripsina 1ml insieme con 50 µ l della dnasi (50 µ g/mL).
- Incubare le cellule in un bagno di acqua a 32 ° C per 2 min.
- Aggiungere 10 mL di terreno di coltura. Dissociare le cripte in singole celle duramente pipettando su e giù, almeno 5 volte.
- Filtrare la soluzione attraverso un colino di 40 µm (per eliminare grumi e altre impurità) e appallottolare le celle singole a 300 x g per 5 min.
4. flusso Cytometry e placcatura
- Preparare 50 mL di soluzione salina tamponata di 1 x Hank o HBSS/2% mucca fetale del siero (FCS) soluzione e risospendere il pellet in 1 mL per ogni 106 cellule
- Aggiungere alla sospensione di cellule BV421 Lin– (CD31, CD45, TER119) ad una concentrazione di 1: 100 e CD24-APC e CD117-PE entrambi ad una concentrazione di anticorpi 1: 250 per 30 min.
- Ordinamento Lgr5+ cellule staminali e cellule di Paneth in basso separato legano tubi. Per ulteriori informazioni sull'ordinamento protocolli per Lgr5+ e cellule di Paneth, vedere Roth et al. 7 e Schewe et al. 6
- Centrifugare le cellule ordinate a 300 x g per 5 min. Risospendere le cellule in 100 µ l medium con i componenti descritti come in 1.3 (Vedi la Tabella materiali).
- Trattare (ad es., tramite modifica chimica o genetica) le cellule di Paneth (n = 2000) o le cellule staminali Lgr5+ (n = 2000).
- Per trattare le cellule, utilizzare 5 µ l di reagente di transfezione liposoma-mediata in un volume totale di 100 µ l terreno di coltura e short interfering RNA (siRNA) ad una concentrazione di 100 nM. Incubare per 30 min a 37 ° C per siRNA o per il tempo necessario per la modifica selezionata.
- Lavare le cellule due volte in 500 µ l di coltura.
- Centrifugare a 300 x g per 5 min e risospendere le cellule in terreno di coltura 10 µ l.
- Le due componenti cellulari della piscina (Paneth o Lgr5+ cellule) in un 20 µ l di volume totale e centrifugare a 300 x g per 5 minuti a TA.
- Co-Incubare il Paneth e cellule del Lgr5+ per 10 minuti a TA.
- Rimuovere 10 µ l del surnatante e lasciare un menisco del liquido per essere sicuri di non aspirare il pellet cellulare.
- Aggiungere 30 µ l di membrana basale ricostituita alle celle per un volume totale di 40 µ l, risospendere le cellule e piastra in un piatto ben 96 pre-riscaldato. Dopo 10 min, aggiungere 200 µ l di terreno completo (Vedi la Tabella materiali). Mezzo di cambiamento ogni 48 h.
- Molteplicità di conteggio organoid giorno 5.
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Representative Results
Il dosaggio di ricostituzione organoid permette l'analisi funzionale separata dei componenti essenziali di nicchia e di cellule staminali dell'epitelio intestinale, qui ha dimostrato di piccoli RNA interferente (siRNA) del gene dell'Apc .
Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo utilizzato prima cella attivata fluorescente ordinano (FACS) per separare 8000 Lgr5+ e 6000 cellule di Paneth da inbred topi C57BL6/J. In Figura 1a, è raffigurato un diagramma di flusso del test ORA. Capacità di ricostituzione organoid è stata valutata incubando le cellule Lgr5+ con oligonucleotidi siRNA diretti contro il mRNA di Apc o che comprende una sequenza strapazzata (SCR) come controllo. Dopo il trattamento, le cellule di Lgr5+ stesse siRNA-trattate erano direttamente placcate in organoid medio/ricostituito membrana dello scantinato, o incubate con un numero uguale di cellule di Paneth non trattate e successivamente placcate fuori. Come controllo, le cellule Lgr5+ non trattate erano cromate da solo (cioè, senza cellule di Paneth) a determinare il numero dei organoids derivato da cellule non trattate Lgr5+ . Inoltre, come un ulteriore controllo, cellule di Paneth da solo erano cromate per controllare per lo sfondo di formazione organoid derivato dalla contaminazione di doppietti di cellule di Paneth-Lgr5 ordinati nel cancello delle cellule di Paneth. Come previsto, siRNA atterramento mediato del gene Apc murino nelle cellule staminali Lgr5+ (e la risultante attivazione del pathway di segnalazione Wnt/β-catenina canonica) influenzato positivamente organoid molteplicità rispetto ai controparti non trattate o il controllo uova strapazzato (Figura 1B). L'attivazione costitutiva di Wnt anche salvato il requisito per cellule di Paneth, come precedentemente segnalato1. Inoltre, questi organoids apparso sfere come Cave (sferoidi), un fenotipo ben descritto per Apc-mutante o organoids Wnt-stimolata (Figura 1, pannello 1), se confrontato con la morfologia di quelli ottenuti da cellule di Paneth-Lgr5 doppietti (Figura 1 C, pannello 2)8,9. Collettivamente, questi risultati dimostrano che ricostituire le cellule di Paneth e Lgr5+ cellule possono dare visione sui meccanismi di cellula-specifico all'interno di questi due tipi di cellule; analisi morfologica dei organoids da microscopia può essere utile a questo proposito poiché la morfologia della organoids riflette la loro composizione cellulare (ad es., sferoidi sono costituite da Lgr5+ cellule solo). Un altro parametro importante da prendere in considerazione è la complessità del organoid (ad esempio, il numero di eventi in erba cripta).
Figura 1. Effetto di siRNA mediato atterramento di Apc in Lgr5+ cellule. (A) diagramma di flusso delle procedure sperimentali. Lgr5 Reporter EGFP topi (Lgr5EGFP-IRES-creERT2)1 sono stati impiegati come fonte di Lgr5+ ordinati cellule staminali. Cellule di Paneth sono state ordinate come indicato e descritto in precedenza6,7. ((B)) Organoid molteplicità riscontrato al momento della ricostituzione delle cellule staminali di Lgr5+ e cellule di Paneth. Quando indicato le cellule sono state pretrattate con oligonucleotidi siRNA diretti contro l' Apc (siRNA Apc) o strapazzate sequenza di controllo (SCR). Gli asterischi indicano differenze statisticamente significative (n = 3, * p < 0,05 * * p < 0,001). Barre di errore fanno riferimento a celle di SD. (1) Lgr5+ , (2) Lgr5+ cellule SCR, siRNA di (3) Lgr5+ cellule Apc, (4) cellule di Lgr5+ + cellule di Paneth, (5) Lgr5+ cellule siRNA Apc + cellule di Paneth, (6) cellule di Paneth. (C) immagini rappresentative dei organoids derivano da siRNA di (1) Lgr5+ cellule Apc, cellule di Paneth - Lgr5+(2). Barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Le ORA permette la raffinata analisi funzionale dei due componenti essenziali della nicchia staminale intestinale, vale a dire Lgr5+ e cellule di Paneth. Questo approccio è stato impiegato in precedenza da noi e gli altri con lievi modifiche6,10,11. Qui, presentiamo la procedura ORA come un protocollo di laboratorio riproducibile e standardizzato. Inoltre, segnaliamo sugli effetti dell'Apc downregulation nelle cellule staminali Lgr5+ , come un esempio della possibilità di implementazione di genetica (o biochimici6) modifiche ai componenti cellulari ordinati. Collettivamente, i dati mostrano che siRNA atterramento mediata di Apc migliora la funzione delle cellule staminali di cellule Lgr5+ , come indicato dalla molteplicità maggiore organoid (Figura 1B).
Diversi vantaggi dell'utilizzo di culture intestinale organoid 3D già sono stati elencati in recensioni4, tra cui la notevole somiglianza della loro organizzazione con quello della cripta-villo architettura in vivo, soprattutto se confrontato con il architettura da metodi di coltura 2D standard con linee cellulari immortalizzate. Tuttavia, uno dei principali limiti di questo metodo è che nella maggior parte dei casi, organoid culture sono stabilite da cripte intero intestinali, un processo che non consente l'analisi funzionale dei suoi singoli componenti e, in particolare, del tronco e di nicchia cellule, qui rappresentate da Lgr5+ e cellule di Paneth, rispettivamente.
ORA supera queste limitazioni. Cellule staminali e di nicchia possono essere ordinate dall'animale e ricostituite per generare organoids separatamente. Come tale, questo approccio consente l'analisi funzionale di questi due componenti cellulari di entrambi impiegando modelli murini che trasportano specifiche modificazioni genetiche o esposti a fattori di stress specifici (ad esempio, DSS e diete specifiche); o modificando direttamente le cellule ordinate geneticamente (siRNA, CRISPR-Cas9) o biochimicamente, prima ricostituzione loro per generare organoids. La molteplicità, morfologia, capacità di auto-rinnovamento e misura di differenziazione (e alla fine la misura dei cambiamenti metaplastic) del organoids risultante può essere impiegati come letture funzionale. In caso di manipolazione genetica, come siRNA, quando un effetto morfologico non è evidente, le cellule devono essere analizzate un'ora dopo la trasfezione per convalidare l'atterramento del mRNA di interesse. Paneth e Lgr5+ possono essere ordinati anche da topi geneticamente costruiti con differenti mutazioni di studiare se mutazioni differenti in cellule staminali e nicchia portano a alterate interazioni tra questi due tipi di cellule e una diversa organoid efficienza di formazione e/o morfologia.
Fasi critiche all'interno del protocollo sono la rimozione dei villi (punto 2.7) e la risospensione delle cellule in HBSS/2%FCS (punto 4.1). Rimozione dei villi è critica per arricchire Paneth e Lgr5+ cellule situate nel terzo inferiore delle cripte e per migliorare l'efficienza dell'ordinamento. Anche se i protocolli di FACS suggeriscono comunemente ordinamento celle in PBS/FCS, l'uso di HBSS invece di PBS aumentata e mantenuta stabile per tutto il tempo di smistamento attuabilità delle cellule. Altri passi importanti sono passaggi 4.7 e 4.8, dove fisico associazione di Paneth e Lgr5+ cellule permette questi lignaggi di doppietti di forma che alla fine darà luogo a organoids.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcun interesse finanziario concorrenti o altri conflitti di interesse
Acknowledgments
Questo studio è stato reso possibile dai finanziamenti dalla Dutch Cancer Society (KWF; EMCR 2012-5473) e il World Cancer Research fondi International (WCRF; progetto n. 2014-1181)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM F12 * | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Glutamax * | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Final concentration: 10 mM |
| Penicillin/streptomycin * | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Final concentration: 1% |
| Hepes * | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Final concentration: 10 mM |
| Recombinant murine EGF * | Thermo Fisher Scientific | PMG8041 | Final concentration: 50 ng/ml |
| Recombinant murine Noggin * | Peprotech | 250-38 | Final concentration: 100 ng/ml |
| y27632 * | Sigma | Y0503 | Final concentration: 10 µM |
| Jagged-1 * | Anaspec Bio | AS-61298 | Final concentration: 1 µM |
| Recombinant murine R-spondin * | R&D systems | 3474-RS-050 | Final concentration: 1 mg/ml |
| Flexitube Gene solution siRNA APC | Qiagen | GS11789 | Final concentration: 100 nM |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| CD24 APC | Biolegend | 101814 | |
| c-kit PE | Biolegend | 105808 | |
| BV 421 CD31 | Biolegend | 102424 | |
| BV 421 CD45 | Biolegend | 103134 | |
| BV421 TER119 | Biolegend | 116234 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14180046 | |
| B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J | Jackson Laboratories | 008875 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| * The combination of these reagents constitutes the complete culture medium |
References
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- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
- Cantrell, M. A., Kuo, C. J. Organoid modeling for cancer precision medicine. Genome Med. 7, 32 (2015).
- Schewe, M., et al. Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer. Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).
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