Tarm organoid kulturer er etableret fra hele krypter og tillader ikke, at analysen af selvfornyelse og differentiering i en celle-specifikke mode. Denne protokol beskriver rekonstituering af sorterede stilk (Lgr5+) og niche (Paneth) celler, som giver anledning til organoids samtidig med at deres forudgående biokemiske og genetiske modifikation og funktionelle analyse.
Den intestinale epitel er karakteriseret ved en meget hurtig omsætningshastighed. Hos pattedyr, er hele epithelial foring fornyes inden for 4-5 dage. Tarm stamceller fra voksne bor i bunden af Krypter af Lieberkühn, er øremærket ved ekspression af Lgr5 -gen og bevare homøostase gennem deres karakteristiske høje proliferativ sats1. I hele tyndtarmen, Lgr5+ stamceller er sammenblandet med specialiserede sekretoriske celler kaldet Paneth cellerne. Paneth celler udskiller antibakterielle stoffer (dvs., lysozym og cryptdins/defensins) og udøve en kontrollerende rolle på tarmfloraen. For nylig, en ny funktion er blevet opdaget for Paneth cellerne, nemlig deres kapacitet til at niche støtte Lgr5+ stamceller gennem flere centrale ligander som Wnt3, EGF og Dll12.
Når isoleret ex vivo og kulturperler bestemte vækstfaktorer og ekstracellulære matrix komponenter, hele tarm Krypter give anledning til langlivede og selvstændig fornyelse 3D strukturer kaldet organoids, der meget ligner krypt-villus epitelial arkitektur af voksen tyndtarmen3. Organoid kulturer, når etableret fra hele Krypter, tillade studiet af selvfornyelse og differentiering af den intestinale stamcelle niche, uden dog at tackle bidrag af dens enkelte komponenter, nemlig Lgr5+ og Paneth cellerne.
Her, vi beskrive en ny tilgang til organoid analysen, der udnytter muligheden i Paneth og Lgr5+ celler til at knytte og danne organoids når Co kulturperler. Denne tilgang, betegnes som “organoid rekonstitution assay” (ORA), tillader den genetiske og biokemiske ændring af Paneth eller Lgr5+ stamceller, efterfulgt af rekonstituering i organoids. Som sådan, det giver mulighed for den funktionelle analyse af de to vigtigste komponenter i tarm stamcelle niche.
Den intestinale epitel er den mest hurtigt selv fornyelse væv i pattedyr kroppen og som sådan har været genstand for et utal af undersøgelser med henblik på identifikation og funktionel karakterisering af de voksne stamceller bosat nederst i krypten af Lieberkühn, øremærkede ved ekspression af Lgr5 -gen og afhængige af canonical Wnt signaler1. Især, er Lgr5+ stamceller flankeret og støttet af specialiserede niche celler, dvs Paneth cellerne, som også afhænger af Wnt signalering til deres modning2. Sammen, disse to celletyper ligge til grund for self-fornyelse af den intestinale epitel foring og bevare den daglige homeostatiske balance: Lgr5+ stamceller hurtigt dividere og give anledning til Stamform og mere specialiseret intestinale epitel celler; Paneth cellerne give væsentlige niche faktorer (f.eks.Dll1, Wnt3, EGF) Lgr5+ stilk celler2. Kapacitet af intestinal Krypter når forgyldt ex vivo til at danne organiseret og selvstændig fornyelse strukturer kaldes organoids, eller “mini-modet”, er blevet udnyttet som en eksperimentel redskab til at give indsigt i processer som selvfornyelse og differentiering i normale og patologiske betingelser herunder kræft4. Organoid kulturer har været etableret fra flere væv, herunder tarm, bugspytkirtel, lever og nyrer, fra både musen og menneskelige prøver4. Metoden udvinding og vækstfaktorer ansat til at udvikle disse organoid kulturer er væv-specifikke og designet til at køre flere lineage differentiering og efterligner så tæt som muligt de oprindelige stamceller niche in vivo. Organoids kan have potentielle applikationer, herunder behandling af genetiske sygdomme, vurderingen af den terapeutiske virkning i kræft, analyse af lægemiddeltoksicitet eller studiet af organogenesis in vitro-5.
Samlet set er den største begrænsning af organoid kulturer når etableret fra vævsprøver manglende celle-specificitet. For eksempel tarm organoids etableret fra hele tarm Krypter ikke tillader analyse af enkelte cellulære komponenter omfattede inden for væv kilde (f.eks.hele Krypter indeholder Lgr5+, Paneth, og stamceller).
Her, beskriver vi en roman metode, betegnes som ORA, der kombinerer fordelene ved tarm organoid kulturer med den funktionelle analyse af dets mest grundlæggende komponenter, nemlig stilk (Lgr5+) og niche (Paneth) celler. Dette opnås gennem en unik evne af Paneth og Lgr5+ celler for at fysisk forbinder med hinanden når Co udruget og give anledning til organoids2,6,10. Vi tog fordel af denne funktion og forbehandlet to celletyper individuelt før den tillader dem at rekonstruere organoids. Når du laver så hver celle komponent kan blive udsat for enhver given stof, vækstfaktor, biokemiske inhibitor, genetisk modifikation eller kemisk behandling inden rekonstitution og organoid dannelse. Derfor vil tillade bruge ORA assay bestemmelse af om en specifik behandling eller genetisk modificering har en specifik virkning på stamcellerne eller deres niche modstykke.
ORA tillader den raffinerede funktionel analyse af de to væsentlige komponenter i den intestinale stamcelle niche, nemlig Lgr5+ og Paneth cellerne. Denne tilgang har tidligere været ansat ved os og andre med mindre ændringer6,10,11. Vi præsenterer her, ORA procedure som laboratorier reproducerbare og standardiseret protokol. Også, vi rapport om virkningerne af Apc downregulation i Lgr5<…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev muliggjort af tilskud fra den hollandske Cancer Society (KWF; EMCR 2012-5473) og World Cancer Research midler International (WCRF; project no. 2014-1181)
Advanced DMEM F12 * | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
Glutamax * | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Final concentration: 10 mM |
Penicillin/streptomycin * | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Final concentration: 1% |
Hepes * | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Final concentration: 10 mM |
Recombinant murine EGF * | Thermo Fisher Scientific | PMG8041 | Final concentration: 50 ng/ml |
Recombinant murine Noggin * | Peprotech | 250-38 | Final concentration: 100 ng/ml |
y27632 * | Sigma | Y0503 | Final concentration: 10 µM |
Jagged-1 * | Anaspec Bio | AS-61298 | Final concentration: 1 µM |
Recombinant murine R-spondin * | R&D systems | 3474-RS-050 | Final concentration: 1 mg/ml |
Flexitube Gene solution siRNA APC | Qiagen | GS11789 | Final concentration: 100 nM |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
CD24 APC | Biolegend | 101814 | |
c-kit PE | Biolegend | 105808 | |
BV 421 CD31 | Biolegend | 102424 | |
BV 421 CD45 | Biolegend | 103134 | |
BV421 TER119 | Biolegend | 116234 | |
HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14180046 | |
B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J | Jackson Laboratories | 008875 | |
Low binding tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | |
Matrigel | Corning | 356230 | |
* The combination of these reagents constitutes the complete culture medium |