Summary
Detta protokoll fungerar som ett system för att ställa in ett funktionellt Tet-ON system i cancer cellinjer och dess efterföljande användning, i synnerhet för studerar roll för tumör cell-derived proteiner i rekrytering av monocyter/makrofager att den tumör mikromiljö.
Abstract
siRNA och shRNA-medierad knock-down (KD) metoder för reglering av genuttryck är ovärderliga verktyg för att förstå genen och protein funktion. Emellertid i fall att KD av proteinet av intresse har en dödlig effekt på celler eller den förväntade effekten av KD är är tidsberoende, ovillkorlig KD metoder inte lämpliga. Villkorliga system är mer lämpliga i dessa fall och har varit föremål för stort intresse. Dessa inkluderar Ecdysone-inducerbara överuttryck system, cytokrom P450-induktion system1, och tetracyklin reglerad gen uttryck system.
Tetracyklin reglerad gen uttryck systemet möjliggör reversibel kontroll över proteinuttryck genom induktion av shRNA uttryck i närvaro av tetracyklin. I detta protokoll presenterar vi en experimentell design med funktionella Tet-ON system i human cancer cellinjer för villkorlig reglering av genuttryck. Sedan visar vi användningen av detta system i studien av tumör cell-monocyt interaktion.
Introduction
Tumör associerade makrofager (TAMs) bidra till tumörutveckling genom att främja tumörtillväxt, metastaser och reglering av immunsvar2. Cancerceller rekrytera inflammatorisk monocyter, som infiltrera tumör och differentieras till pro-tumörframkallande TAMs3. Infiltration av tumören med TAMs korrelerar med dålig kliniskt utfall och har kopplats till makrofager4,5immunhämmande roll. Men mekanismerna för rekrytering av makrofager att tumören inte är väl undersökt och en bättre förståelse av de inblandade vägarna är avgörande för vidare befordran av fältet och lovande terapier. En av utmaningarna i att studera interaktioner mellan tumör och normala celler i tumören närmiljön (TME) är komplexiteten av mekanismer och celler inblandade, som kräver in vitro- metoder som gör dissekering av överhörning. Här presenterar vi en mångsidig metod som kan användas för att studera de parakrin effekt av en cancer cell-derived, utsöndrade proteinet migration av andra celltyper som makrofager, in vitro. Med ett system där uttrycket av shRNA mot en cancer cell-derived protein som deltar i rekrytering av monocyter är under kontroll av tetracyklin inducerbara arrangören, är parakrin effekt utsöndrade proteinet på monocyter quantitated. I detta protokoll följt kloning av shRNA sekvenser i den tetracyklin reglerade vektor presenteras av generation av stabil cancer cellinjer. Ytterligare, rening av primära humana monocyter och en Boyden kammare analys används för att analysera parakrin effekt en cancer-cell härrör protein på migration av monocyter.
Nedreglering av protein kodande gener är vanligen tillämpas med siRNA och shRNA tekniker, men inte utan begränsningarna av dess användning. Den långsiktiga knock-down (KD) av gener kan framkalla sekundära adaptiv Svaren av celler som störa experimentella resultat. Bristande temporal kontroll över genuttryck gör det utmanande att studera ett protein dynamisk roll över tid eller rollen av ett protein som är avgörande för cellöverlevnad. Denna fråga är särskilt viktigt i i vivo inställningar, där rollen av ett protein i tumörutveckling och progression kan kräva nedreglering av uttrycket av proteinet av intresse endast efter tumör är etablerad. Villkorliga KD har fördelen av att förebygga ett för tidigt dödliga effekten av KD på celler och för att möjliggöra analys av rollen av protein i olika stadier av tumörtillväxt, medan ovillkorlig KD kan resultera i brist på tumörutveckling.
Ett antal villkorlig KD system har utvecklats för att hantera begränsningar i stabil KD. De villkorliga gen uttryck system inkluderar Ecdysone-inducerbara överuttryck system, med cytokrom P450-induktion system1, och tetracyklin reglerad gen uttryck system. De tetracyklin-reglerad gen uttryck system tillåter kontroll över uttryck för shRNA vid tillägg av den antibiotiska tetracyklin (eller dess mer stabil analog - doxycyklin). I Tet-ON system, ett uttryck för shRNA induceras i närvaro av tetracyklin/doxycyklin vilket resulterar i en genuttryck KD, medan i Tet-OFF system, ett uttryck för shRNA dämpas i närvaro av tetracyklin resulterar i genuttryck. En nackdel med tetracyklin-inducerbara system är tidigare rapporterade låga nivåer av uttryck av shRNA i avsaknad av doxycyklin - so-called leakiness6,7. I Tet-ON system som beskrivs här, vid administrering av tetracyklin, bindningen av konstitutivt uttryckta tetracyklin repressor (te) protein till sekvensen Tet-responsive element (TRE) inom H1 promotor regionen shRNA av intresse är undertryckta. Detta resulterar i uttryck av shRNA och hämning av översättning av proteinet av intresse i en tetracyklin-beroende sätt8,9.
Andra tillgängliga Tet-ON system inkluderar samtidiga inpressning av den TetO sekvens mellan TATA box och proximala sekvens element (PSE) och mellan TATA box och transkription starta webbplatsen utvecklad av Chan et al. 10 detta system kräver mindre än toxiska doser av tetracyklin att reglera shRNA uttryck, dock under en icke-inducerad stat, låga nivåer av shRNA uttrycks. Krüppel-associerade box (KRAB) baserat Tet-ON system11 inkluderar KRAB, ett zink finger protein, som försökspersoner gener ligger inom 3 kb KRAB bindande webbplatsen transkriptionell dämpning. Den chimär protein tTRKRAB kan binda till TetO, och på grund av det stora utbudet av DNA kontrollerbar kapacitet, TetO inte behöver begränsas mellan transkriptionen starta webbplatsen och arrangören och har låg effekt på aktiviteten av arrangören. Under icke-inducerad staten rapporterades kontrollerbar RNA interferens systemet att visa en lägre nivå av läckt uttryck shRNA11,12; Det kräver dock en sekventiell, två-vektor kloning strategi. I jämförelse med tidigare utvecklade villkorlig KD system såsom Ecdysone-inducerbara överuttryck systemet eller cytokrom P450-induktion system, tetracyklin-reglerade systemet har fördelen av dess robusthet och reversibilitet, och därför är mest används rutinmässigt system13. Det system som används i detta protokoll har fördelen över den dubbla TetO knock-in system och KRAB Tet-ON system eftersom det kräver rakt fram, enda vektor kloning, möjliggör snabb generering av flera kloner, och den uppvisar mycket låga nivåer av leakiness i den avsaknad av doxycyklin.
TME är avgörande för utvecklingen av cancer. För att underlätta tumörtillväxt, rekrytera cancerceller inflammatorisk monocyter genom att utsöndra kemotaktisk proteiner. Rekryteras monocyter infiltrera tumören och differentieras till pro-tumörframkallande TAMs som bidrar till tumörtillväxt och metastasering. In vitro studier av immunceller rekrytering utnyttja migration analyser, med Boyden kammare assay som allmänt används14,15,16,17. I denna analys, är korrektiv proteinet källan, till exempel cancerceller eller ett renat protein, placerad i botten kammare. Immunceller är placerade i den övre kammaren separerade med porösa membran från bottenfack. Celler migrerar mot ökande gradient korrektiv, och de som finns på den nedre sidan av membranet är målat och räknade under mikroskopet. Här testar vi funktionen korrektiv av Plasminogen aktivator Inhibitor 1 (PAI-1) på monocyter genom att generera stabila, inducerbara cancer cell linjer där uttrycket av PAI-1 regleras av doxycyklin tillägg. Vi använder mänskliga primära monocyter i Boyden kammare migration analysen för att bedöma PAI-1 roll i monocyt migration. Skillnader mellan människors primära monocyter och utbredda monocytic cellinjer som THP1 har rapporterats och inkluderar olika cytokin uttryck mönster18; exempelvis 5-10 gånger ökning av TNF-α uttryck nivåer av THP1 celler jämfört med humana monocyter19. THP1 celler härrör från mänskliga leukemiceller monocytic, är lätta att underhålla och föröka med genomsnitt fördubbling tid 19-50 h20. Tvärtom, kännetecknas humana monocyter av en kort livslängd i frånvaro av tillväxtfaktorer. Eftersom monocyter renas från blodet av givare, en hel del variation uppstår bland individerna och beroende på metoden rening, kan kontaminering med andra celltyper inträffa. Ändå primära monocyter är relevanta och har det rekommenderats att använda eller bekräfta de resultat som erhålls med de monocytic cellinjer som använder primära monocyter i biologisk forskning19. Här beskriver vi ett protokoll för rening av människans primära monocyter från perifert blod. Alternativa metoder för monocyt rening inkluderar täthet lutning och vidhäftning protokoll och två steg med enda lutningar av Ficoll-Hypaque följt av en Percoll gradient21. Renhet av monocyt befolkningen erhålls genom dessa metoder varierar mellan 70-90%. Den metod som beskrivs här används en täthetlutning följt av en negativ immun urval22 och möjliggör rening av humana monocyter utan direktkontakt med antikroppar, därmed undvika deras oavsiktlig aktivering och resulterar i en > 95% ren befolkningen av monocyter.
Det protokoll som presenteras här används för att upprätta ett funktionellt Tet-ON system för genuttryck KD i human cancer cellinjer för att studera korrektiv effekten av cancer-derived utsöndrade proteinet PAI-1 på monocyter. PAI-1 förekommer i ökad utsträckning av en mängd olika tumörer och dess uttryck paradoxalt nog korrelerar med dålig kliniskt resultat23,24. PAI-1 pro-tumörframkallande roll är ett resultat av dess proangiogena och anti-apoptotiska funktioner25,26. PAI-1 har visat sig bidra till inflammation genom att främja rekrytering av makrofager till platsen för inflammationen27. PAI-1 visades att främja muskulatur cellmigration28,29 och delta i Mac-1 beroende makrofag migration30. PAI-1 överuttryck har också visat att väsentligt öka rekryteringen av Raw 264,7 makrofager B16F10 melanom tumörer31. Rollen av PAI-1 i TAM migration har dock inte undersökts i detalj. Vi använder protokollet beskrivs för att besvara frågan om huruvida PAI-1 lockar monocyter till cancerceller. Denna metod tillåter dissekering av överhörning mellan tumör och TME genom tysta utsöndrade proteinet i cancerceller och analysera komponenterna i TME.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Avsnittet protokoll som använder humana monocyter erhållits från friska frivilliga följer riktlinjerna i Children's Hospital Los Angeles mänskliga forskningsetisk kommitté och har godkänts av den institutionella Review Board under den mänskliga Material Protokoll nummer: CCI 08-00208.
1. beredning av Cancer cellinjer med tetracyklin-reglerade shRNA uttryck
- Kloning av shRNA PAI-1 i Tet-pLKO-puro vektor 8 , 9
- Design shRNA oligomerer som innehåller ålderjag och EcoRI klyvning webbplats på slutet 5', sekvensen känsla, en 6 nukleotid loop och antisense sekvensen.
Obs: Typiska oligonukleotider är konstruerad enligt följande: framåt oligo: 5' CCGG - 19-21 bp känsla - CTCGAG - 19-21 bp antisense - TTTTT, omvänd oligo: 5' AATTAAAAA-19-21 bp känsla - CTCGAG - 19-21 bp antisense 3'. Detaljerade protokoll för oligomer design kan hittas i 8. I denna studie testades 3 shRNA sekvenser mot PAI-1 för den starkaste ljuddämpningssystemet effekten: shRNA 132, shRNA 2, shRNA 333och kodade33 ingår i tabell 1. - Glödga de shRNA oligomererna och kodade shRNA oligomerer.
- Rekonstituera oligonukleotider till 100 µM i vatten och blanda 1 µL framåt oligonukleotiden, 1 µL omvänd oligonukleotiden och 8 µL H2O.
- För att glödga oligonukleotider, blanda följande: 1 µL oligonukleotiden blandning, 5 µL buffert 10 mM Tris (hydroxymetyl) aminometan (Tris) pH 7.5, 50 mM natriumklorid (NaCl), 10 mM magnesiumklorid (MgCl2), 1 mM dithioerythritol (DTE) och 44 µL H 2 O.
- Inkubera blandningen i ett polymeras-kedjereaktion (PCR) termocykel vid 95 ° C i 5 min, Stäng av instrumentet och vänta tills rumstemperatur (RT) nås.
- Fällningen glödgad oligonukleotider genom att lägga till 5 µL 3 M natriumacetat pH 5.2 till 50 µL glödgas oligonukleotider.
- Tillsätt 100 µL kallt 100% etanol (EtOH) och inkubera i 30 minuter vid-80 ° C. Centrifugera i en bänkmonterade centrifug med maximal hastighet under 30 minuter vid 4 ° C.
- Ta bort supernatanten, tillsätt 500 µL kallt 70% EtOH, Centrifugera i 30 min, ta bort supernatanten och lös pelleten i 20 µL H2O.
- Bedöma koncentrationen av glödgad oligonukleotider av spektrofotometri, mäta absorbansen vid 260 nm. Späd oligonukleotider till slutliga koncentration 1 ng/µL.
- Förbereda Luria Bertani (LB) medium och LB agarplattor.
- För LB medium, lös 10 g trypton, 5 g jäst extrakt, 10 g NaCl i 1 L vatten. Justera pH på medellång till pH 7,0 använder 1 N NaOH och autoklav.
- Tillsätt 15 g/L agar i LB medium för LB agarplattor. Autoklav och svalna till cirka 50 ° C. Lägga till antibiotika och häll plattorna.
- Strimma bakterier sensorik med Tet-pLKO-puro vektor (se Tabell för material) på LB agarplatta kompletteras med 100 µg/mL ampicillin och inkubera över natten (O/N) vid 37 ° C.
- Inokulera 100 mL LB medium kompletteras med 100 µg/mL ampicillin (LB/ampicillin) med 1 koloni från plattan och växa O/N med skakningar vid 37 ° C.
- IsolateTet-pLKO-puro från 100 mL bakterieodling med hjälp av en plasmid isolering kit.
- Förbereda begränsning reaktionen för Tet-pLKO-puro vektorn med mina och AgeI restriktionsenzym enligt följande: 1 µL mina, 1 µL AgeI, 5 µL 10 x buffert, 1 µL plasmid DNA (1 µg), 42 µL H2O. Inkubera i 1 timme vid 37 ° C. För att få nog av klyvs vektor, förbereda upp till 5 x 50 µL reaktioner.
- Använda 1% agarosgel för att rena klyvs vektor från det agarosgel med hjälp av ett DNA-rening kit. För att öka avkastningen av DNA, minimera Agarens DNA förhållande i gel med hjälp av en agaros gel kam för stora brunnar och genom att försiktigt ta bort de flesta Agarens från bandet med en skalpell.
- Förbereda ligering reaktion mixen enligt följande: 1 ng glödgas oligonukleotider, 50 ng klyvs vektor, 2 µL 10 x ligase buffert, 1 µL ligase och vatten upp till 20 µL. ligera vektorn med glödgad shRNA oligonukleotider 16 ° C O/N.
- Förbered dig dessutom en negativa kontrollreaktionen utan oligonukleotider att redovisa uncleaved, delvis klyvs och själv sammanskrivna vektor som kommer att resultera i falskt positiva kolonier.
- Använda standarden omvandling tekniker, förvandla ligering blandningar till kemiskt behöriga bakterieceller för att förhindra att homolog rekombination av lentiviral vektorer som innehåller direkta repetitioner.
- Odla bakterier på plattor med ampicillin O/N vid 37 ° C.
Obs: Om tillväxt av satellit kolonier sker, upprepa omvandlingen och odla bakterier vid 30 ° C att bromsa tillväxten och därigenom förhindra satellit kolonier. - För att verifiera framgångsrik ligatur, plocka mellan 10-20 enstaka kolonier, ympning 2 mL LB/ampicillin kulturer och en ampicillin platta som en lager plåt (för att senare användas som en positiv klon). Växa flytande kulturer med skakar O/N vid 37 ° C. Inkubera plattan O/N vid 37 ° C.
- Försegla plattan med parafilm och förvaras vid 6 ° C.
- Isolera plasmid DNA från flytande kulturer med hjälp av en plasmid isolering kit.
- Utföra begränsning analys av plasmid DNA isolerade från ampicillin-resistenta kolonier med XhoI enzym. För varje klon, förbereda följande reaktion mixen: 0,5 µL XhoI, 2,5 µL 10 x buffert, 1 µL plasmid DNA (0,5 µg), och 21 µL H2O. Inkubera för 1 h vid 37 ° C. Analysera resultatet av begränsning reaktionen genom att köra reaktionen på en 1% agarosgel.
Obs: Begränsning analys av WT vektorn klyvs av XhoI kommer att generera 3 fragment: 8,447, 1 800 och 200 bp. Stuffer sekvensen i Tet-pLKO-puro vektor av 1,800 bp är inte närvarande i positiva kloner som innehåller shRNA-PAI-1 och XhoI digest kommer att resultera i DNA-fragment av storlek: 8,447, 190 och 130 bp. I figur 1visas det 2 000 bp-fragmentet finns inte i DNA isolerade från ampicillin resistenta kolonier nummer: 3, 8 och 11. Beroende på utformningen av oligonukleotider variera längden och antal erhållna fragment i DNA från positiva kolonier. - Verifiera korrekt införande av shRNA sekvenser i Tet-pLKO-puro vektorn av sekvensering8,9.
- Inokulera 100 mL LB/Ampicillin kultur med kolonin som innehåller de rätta klonen och växa O/N vid 37 ° C.
- Isolera plasmid DNA med hjälp av en plasmid isolering kit.
- Design shRNA oligomerer som innehåller ålderjag och EcoRI klyvning webbplats på slutet 5', sekvensen känsla, en 6 nukleotid loop och antisense sekvensen.
- Generering av lentivirus partiklar.
- Coat en 15 cm vävnadsodling maträtt med Poly-L-lysin genom att täcka ytan i skålen med sterilt vattenlösning av 0,01% Poly-L-lysin och ruvar på RT för 15 min. ta bort lösningen genom aspiration och lufttorka rätter.
- Utsäde 5 x 106 mänskliga embryonala njure 293 celler (HEK293) celler i Poly-L-lysin-coated 15 cm skålen och kultur i Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) medium kompletteras med 10% FBS och 1% Penicillin/Streptomycin mix (penna/Strep) vid 37 ° C, 5% CO 2 tills de når 70% konfluens.
- För att producera viruspartiklar, transfect HEK293 celler med 25 µg pLKO-Tet-på-shRNA, 25 µg psPAX, (förpackning plasmid), och 5 µg pMD2.G plasmider (kuvert uttrycker plasmid) använder transfection reagens.
Obs: psPAX och pMD2.G plasmider är en gåva från Didier Trono labbet (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne, Schweiz). - Framkalla HEK293 celler nästa dag genom att ändra mediet till DMEM kompletteras med 10 mM natrium butyrate och 20 mM HEPES pH 7,2, och odling för 8 h.
- Tvätta cellerna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och tillsätt 25 mL färsk DMEM medium innehållande 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES) pH 7,2. Efter inkubation vid 37 ° C för 48 h, noggrant samla virusinnehållande medium genom pipettering; undvika spill.
- Filtrera det insamlade mediet genom ett 0,45 µM spruta filter att avlägsna HEK293 celler. Det medium som innehåller viruspartiklar kan användas omedelbart eller förvaras vid-80 ° C för senare användning.
- Generation av stabilt transfekterade cellinjer
- Frömaterial HCT116 kolon cancerceller och MDA-MB-231 bröstcancerceller på 50.000 celler per brunn i DMEM medium kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penna/Strep i en 12-bra platta. Inkubera vid 37 ° C 5% CO2 tills cellerna är 60-70% konfluenta.
- Tvätta cellerna med PBS och tillsätt 1 mL virusinnehållande medium till cancer celler och inkubera O/N vid 37 ° C 5% CO2. Som en kontroll, tillsätt 1 mL färsk DMEM medium kompletteras med 10% FBS och 1% penna/Strep 2 brunnar med cancerceller.
- Ta försiktigt bort virusinnehållande medium av aspiration. Tvätta cellerna med PBS och ändra mediet till DMEM med 10% (v/v) tetracyklin-fri (Tet-fri) FBS och 1% penna/Strep.
- Efter 72 h, tvätta cellerna med PBS och ändra mediet till DMEM 10% Tet-fri FBS 1% penna/Strep, 1 µg/mL puromycin för val av virus-transfekterade celler.
- Beroende på den cellinje som används, justera puromycin koncentration för optimala val genom att testa spänna av puromycin koncentrationer (0,1, 0,5, 1, 2 och 5 µg/mL) i icke-sensorik celler och välja den lägsta koncentrationen där ingen kontroll celler överleva efter 3 dagar av kultur.
- Välj virus-sensorik celler genom odling av celler i närvaro av puromycin för 3-14 dagar. Som kontroller, förbereda två ytterligare brunnar med icke-sensorik celler, en med medium som innehåller puromycin och en utan puromycin. Observera partiell dödandet av cellerna av puromycin i brunnen med virus-sensorik celler jämfört kontrollbrunnarna.
Obs: Icke-sensorik celler växer inte i närvaro av puromycin. - Kontrollera effektiviteten i villkorlig KD i puromycin-resistenta HCT116 tjocktarmscancer och MDA-MB-231 bröstcancerceller.
Obs: Den effektiva koncentrationen av doxycyklin kommer att variera med den cellinje som används och måste titreras (vanligtvis från 100 ng/mL till 2 µg/mL).- Bestämma doxycyklin koncentration som inte är giftiga för cellerna men effektiva i downregulating uttrycket av proteinet av intresse. I detta protokoll var 1 µg/mL framgångsrikt används i vitro.
- Odla cellerna för 72 h i närvaro och frånvaro av 0.1, 1 och 2 µg/mL doxycyklin. Kontrollera nivån av uttryck av proteinet nedreglerade (här, PAI-1) i cell lysate genom Western blot analys. Jämföra HCT116 och MDA-MB-231 celler som villkorligt uttrycker shRNA till kodade kontroll celler.
- Beredning av konditionerat medium
- Frö 1 x 106 celler stabilt transfekterade med doxycyklin reglerade pLKO-shRNA innehållande lentiviruses i 10 cm rätter.
- Växa cellinjer i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium med 10% Tet-fri FBS och 1% penna/Strep i frånvaro och närvaro av 1 µg/mL doxycyklin för 72 h vid 37 ° C 5% CO2, lägga till färsk doxycyklin dagligen.
Obs: RPMI medium är kompatibel med odlingsbetingelser av monocyter. Doxycyklin är en ljus känsliga förening. Ljuskänsligt cellkulturer av täcka med aluminiumfolie och undvika att arbeta under direkt ljusexponering. - Samla in mediet genom pipettering, filtrera genom 0.45 µm filter och frysa vid-80 ° C i alikvoter.
2. isolering av monocyter från humanblod
- Isolera monocyter från perifert blod.
Obs: Människans primära monocyter är isolerade från 7 mL av vita blodkroppar koncentrerade i ett leukocyt filter från givare som friska trombocyter. Beroende på givaren producerar en leukocyt filter mellan 1 x 109 och 2 x 109 i perifera mononukleära blodceller (PBMC), cirka 10% som utgör monocyter.- Förbereda arbetsstationen i laminärt flöde skåp.
- Sterilisera sax och laminärt flöde skåp med ultraviolett ljus (UV) för 30 min.
- Spray leukocyt filtret med 70% EtOH och lufttorka insidan den laminärt flöden skåp.
- Skär båda ändarna av leukocyt filtret med sax och Töm innehållet i filtret i en 50 mL tub.
- Späd till 90 mL genom att lägga till PBS med 1% (v/v) FBS (PBS/FBS).
- Förbered 3 x 50 mL rör med 15 mL täthet lutning lösning. Lager långsamt 30 mL PBS/FBS utspädd blod över tätheten gradient lösning med en pipett controller inställd på gravitationell flöde att undvika blandning av lager.
- Centrifugera i en gunga rotor vid 400 x g vid RT utan bromsar i 25 min.
- Förfoga över det översta lagret och överföra det mellersta lagret som innehåller PBMC till en färsk 50 mL tub.
- Lägg till PBS/FBS upp till 50 mL och centrifugera vid 120 x g vid RT i 10 min. ta bort supernatanten innehållande trombocyter. Upprepa detta två gånger.
- Återsuspendera pelleten i 50 mL PBS/FBS och räkna de PBMC använder en hemocytometer. Centrifugera vid 120 x g vid RT och återsuspendera pelleten i PBS/FBS som innehåller 1 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) (PBS/FBS/EDTA) till en slutkoncentration på 5 x 107 celler/mL.
- Använda ett negativt urval kit för att berika monocyter av utarmning av icke-monocytic celler.
Obs: Den negativa urval kit använder en cocktail av antikroppar (CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123 och glycophorin A) mot T celler, NK celler, neutrofiler, B celler, granulocyter och erytrocyter. De antikropp-komplex binder till ytan av dessa icke-monocytic celler och dextran magnetiska partiklar. När röret placeras i en magnet, Pärlorna följer väggarna i röret och ta bort icke-monocytic cellerna från lösningen.- Tillsätt 50 µL antikroppen cocktail 1 ml 5 x 107 PBMC/mL, blanda med en pipett och inkubera i 10 min vid RT. Tillsätt 50 µL magnetiska pärlor till PBMC med antikroppen cocktail, blanda med en pipett och inkubera i en annan 10 min vid RT.
- Lägga till PBS/FBS/EDTA upp till 25 mL och plats PBMC blandningen i en magnet som kan rymma en 50 mL tub. Inkubera i 10 min vid RT. magnetiska pärlor kommer att följa väggarna i röret och binda de icke-monocytic cellerna från lösningen.
- Med 25 mL pipett bort lösningen innehållande monocyter från röret i magneten. Var noga med att inte vidröra sidorna av röret med pipetten.
- Centrifugera lösningen vid 250 x g vid RT, avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten innehållande monocyter i RPMI medium innehållande 10% Tet-fri FBS och 1% penna/Strep.
3. Boyden kammare Migration Assay
- Bered 1% (w/v) bovint serumalbumin (BSA) lösning genom att lösa upp 1 g av BSA i 100 mL ultrarent vatten och filtrera genom ett 0,2 µm porstorlek att sterilisera.
- Inkubera porösa membran skären i 1% steril BSA lösning O/N för förbättrad efterlevnad av makrofager membranet. För monocyter/makrofager, Använd skär i 5-8 µm porstorlek storlek.
- Fyll en steril vävnadsodling maträtt med 1% BSA lösning och placera skären i skålen. Tillämpa 200 µL 1% BSA lösning inuti skären.
- Tvätta skär två gånger genom att placera dem i en skål fylld med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning och tillämpa PBS inuti filtret.
- Utsäde 40.000 HCT116 eller MDA-MB-231 celler i 0,5 mL RPMI medium innehållande 10% Tet-fri FBS och 1% penna/Strep per brunn, i en 24-väl plåt, i tre exemplar. Alternativt placera 0,5 mL av tidigare genererade luftkonditionerade medium i brunnen som en källa till korrektiv.
- Tallrik 8 000 monocyter i det beredda sätt i 0,3 mL volym av RPMI medium som innehåller 10% Tet-fri FBS och 1% på nästa dag, penna/Strep, i tre exemplar, och inkubera vid 37 ° C 5% CO2.
- Samla skären efter 48 h.
Obs: Längden på ett experiment måste optimeras beroende på särskilda villkor och celler används, genom att utföra ett tidsförlopp experiment där skär samlas in på olika inkubationstider.- Skaka av överflödig medium och just svep den inre ytan med en bomull spets applikatorn för att ta bort celler som inte migrera.
- Färga den yttre sidan av skären med metoden Wright-Giemsa.
- Noggrant montera 3 skär/glasskiva i en hög viskositet Mikroskop nedsänkning olja, vilket gör att sidan av filtret med migrerade makrofager vänd uppåt.
- Bild bilder med ett ljusmikroskop med 20 X-objektiv. Ta bilder av 9 fält/filter. Räkna migrerade makrofager i 9 fält/filter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tre shRNA sekvenser testades för den mest effektiva KD av PAI-1. För detta, var shRNA sekvenser mot PAI-1 och äggröra (tabell 1) klonad i Tet-pLKO-puro uttryck vektor efter det protokoll som beskrivs ovan. Den HT-1080 fibrosarkom cellinje var stabilt transfekterade med genererade konstruktioner och cellerna behandlades med doxycyklin i 3 dagar. Uttrycket av PAI-1 kontrollerades av Western blotting ()figur 2A) och intensiteten av de band som motsvarar PAI-1 och tubulin analyserades av densitometry. Med den mest effektiva KD-sekvensen (shRNA 2), dessutom genererade vi MDA-MB-231 epitelial bröst adenocarcinom (figur 2B) och HCT116 kolorektal carcinom celler (figur 2 c) stabilt transfekterade med en tetracyklin-reglerade pLKO-shRNA2-PAI-1 uttryck vektor (och shRNA äggröra som kontroll). Vi uppnådde en minskning av PAI-1 uttryck i MDA-MB-231 cellinje (figur 2B) 74% och 17,5% minskning i HCT116 cellinje i närvaro av doxycyklin (1 µg/mL)()figur 2 c) bedömt genom Western blotting och Densitometrisk analys av banden. Boyden kammare analysen användes för att kvantifiera migration av monocyter mot cancerceller. Vi hade en hypotes att cancer cell-derived PAI-1 främjar migration av monocyter mot tumörceller och därför mindre migration kommer att observeras när PAI-1 är nedreglerade genom tillsats av doxycyklin. Cancerceller som behandlats med doxycyklin i 3 dagar och var seedad i botten av en 24-väl plattan på 40 000 celler per brunn. Renat primära humana monocyter tillämpades i den övre kammaren analysens och efter 24 h, de monocyter som sitter på undersidan av membranet var målat och räknade under mikroskopet. Vi visar att i avsaknad av doxycyklin och därför förekomsten av PAI-1, i MDA-MB-231 och HCT116 celler (PAI-1 shRNA och kodade kontroller), ökat betydligt migration av humana monocyter (figur 3). Migreringen av monocyter hämmades sedan av 33% och 74% när doxycyklin lades till samtidig kulturer och produktionen av PAI-1 av tumörceller var ned-reglerade (figur 3A, C). Ingen inhibition av monocyt migration observerades med tumörceller sensorik med kodade shRNA kontroller, vilket också anges att doxycyklin hade ingen hämmande effekt på monocyt migration. Liknande resultat erhölls när luftkonditionerade medlet av doxycyklin-behandlade cancerceller placerades i botten av brunnarna som en källa till chemoattractants (figur 3B, D).
Figur 1 . XhoI begränsning analys av DNA extraheras från 16 bakteriekolonier. DNA var extraheras från 16 bakteriekolonier och underkastas inskränkning reaktion med XhoI enzym. De resulterande DNA-fragment analyserades av agaros gelelektrofores. Positiva kloner (körfält 3, 8 och 11) som saknar 2 kb fragmentet efter XhoI begränsning digest är markerade med pilar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Villkorlig KD av PAI-1 uttryck i cancer cellinjer. Western blotting analys av PAI-1 uttryck i cellinjer stabilt transfekterade med tetracyklin-reglerade pLKO-shRNA-PAI-1 (1-3 shRNA) och kodade uttrycket vektor efter 3 dagars behandling med doxycyklin. (A) HT1080. (B) MDA-MB-231. (C) HCT116. Densitometry analys av banden är nedanstående lanesna av västra blotting som en kvot av PAI-1 intensitet över tubulin bandet intensiteten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . PAI-1 främjar makrofag migration. Migration av humana monocyter mot (A) MDA-MB-231 och (C) HCT116 cell linjer stabilt transfekterade med vektor villkorligt uttrycker shRNA 2 mot PAI-1 och kodade shRNA, mätt med Boyden kammare analys. Cancerceller behandlades med doxycyklin i 3 dagar och seedade i en 24-väl plåt i tre exemplar. Människans primära monocyter tillämpades på toppen av skäret. Efter 24 h, var monocyter på den nedre sidan av filtret målat och räknade under mikroskopet. Migration av humana monocyter mot luftkonditionerade medium genererade över 72 h (B) MDA-MB-231 och (D) HCT116 cellinjer villkorligt uttrycka PAI-1 i närvaro och frånvaro av doxycyklin. Uppgifterna representerar medelvärdet av tekniska exemplar [+/-standardavvikelse (SD)]. För varje replikat räknades migrerade monocyter i 9 fält 20 X objektiv förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namnet på Oligo | Sekvens | ||||
| shRNA 1 (anti PAI-1 sekvens 1 - 8 ) | Framåt: | shPAI-1A5' CCGGCTGACTTCACGAGTCTTTCCTCGAGGAAAGACTCGTGAAGTCAGTTTTT 3' | |||
| Bakåt: | shPAI-1B 5' AATTAAAAACTGACTTCACGAGTCTTTCCTCGAGGAAAGACTCGTGAAGTCAG 3' | ||||
| shRNA 2: (anti PAI-1 sekvens 2) | Framåt: | shPAI - 1C 5'-CCGGCAGACAGTTTCAGGCTGACTTCTCGAGAAGTCAGCCTGAAACTGTCTGTTTTT-3' | |||
| Bakåt: | shPAI - 1D 5'-AATTAAAAACAGACAGTTTCAGGCTGACTTCTCGAGAAGTCAGCCTGAAACTGTCTG-3' | ||||
| shRNA 3 (anti PAI-1 sekvens - 3 9) | Framåt: | shPAI-1E 5'-CCGGAAGGATGAGATCAGCACCACACTCGAGTGTGGTGCTGATCTCATCCTTTTTTT-3' | |||
| Bakåt: | shPAI-1F 5'-AATTAAAAAAAGGATGAGATCAGCACCACACTCGAGTGTGGTGCTGATCTCATCCTT-3' | ||||
| Scramble (förvränga sekvens - 4 9) | Framåt: | Förvränga 1 5'-CCGGAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTT-3' | |||
| Bakåt: | Scramble 2 5'-AATTAAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATT-3' | ||||
Tabell 1. shRNA sekvenser. Här 3 shRNA sekvenser mot PAI-1 testades för den starkaste ljuddämpningssystemet effekten: shRNA 1, shRNA 2, shRNA 3 och äggröra
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Består av en mängd olika celltyper, är TME avgörande för utvecklingen av cancer. För att fastställa optimala odlingsbetingelser, locka cancerceller monocyter genom utsöndring av kemotaktiska faktorer. Här presenterar vi ett protokoll för att studera mekanismen av monocyt rekrytering av tumör celler in vitro. För detta ändamål används en kombination av inducerbara gen uttryck system, rening av primära humana monocyter, och som ett exempel på en migration assay, Boyden kammare analysen.
Ett första viktigt steg i protokollet presenterade är att bekräfta rätt kloning av shRNA sekvenser i Tet-ON vektorn, som bör alltid utvärderas av sekvensering. Ytterligare inrättandet av funktionella stabil Tet-ON cellinjer måste bekräftas genom att testa KD i närvaro av doxycyklin av Western blotting. Mängden tillämpad doxycyklin kan variera mellan cellinjer, och det är därför lämpligt att testa de effektiva koncentrationerna för KD och toxicitet på cellerna. En känd nackdel av tetracyklin-inducerbara system är deras leakiness6,7. Mängden protein påvisas i närvaro och frånvaro av doxycyklin måste mätas och jämfört med de kodade kontrollerna att ta hänsyn till denna effekt. I in vitro- experiment observeras en låg nivå av leakiness shRNA2 och shRNA3 KD, som visas i figur 2. Dessutom är det viktigt att alltid använda tetracyklin-fritt serum i vitro för att undvika nedreglering av proteinnivåer i villkor kontroll. Det system som används i detta protokoll har fördelar framför andra Tet-ON system eftersom det kräver en enda vektor kloning, tillåter snabb generering av flera kloner och uppvisar mycket låga nivåer av leakiness.
Ett viktigt steg i att få primära humana monocyter från blod är att få bra lutning separation, som bygger på långsam skiktning av utspädda blod över täthetlutningen. Ytterligare ett avgörande steg i protokollet är att korrekt uppskatta antalet celler innan steget negativa urval eftersom det kommer avgöra mängden antikroppar cocktail och magnetiska pärlor till blod suspensionen. För att försäkra reproducerbarheten av experiment, ska mer än en blodgivare användas i utför replikera experiment. Denna teknik är överlägsen befintliga alternativ av monocyt rening inklusive en täthetlutning och vidhäftning-baserat protokoll34 och ett tvåstegsförfarande med enda övertoningar21, eftersom det garanterar låga lymfocyter kontaminering och hög renhet (> 95%) av erhållna monocyter. Eftersom de icke-monocytic celltyper tas bort från PBMC blandning av negativa urval, kommer monocyter inte i direkt kontakt med antikroppar som är närvarande i antikroppen cocktail, och därmed risken för monocyter blir aktiverad genom interaktion med antikroppar är minimal. Alternativa tillämpningar av erhållna celler kan omfatta differentiering av monocyter i makrofager genom in vitro- och in-vivo experiment där humana monocyter injiceras i nedsatt immunförsvar möss. Ändringar av protokollet innehåller vanligen användningen av den röda blodkroppar lyseringsbuffert under tvätt stegen av PBMC. Denna ändring syftar till att ytterligare borttagning av röda blodkroppar genom att tillämpa osmotiska trycket. Begränsningar av tekniken inkluderar ett begränsat antal makrofager som kan erhållas med ett angivet belopp av reagenser.
Boyden kammare migration analysen är ett snabbt och enkelt sätt att analysera om ett protein som utsöndras eller en cell fodrar stimulerar migration av andra celltyper. Fallgroparna i denna analys har låg känslighet och inte redovisning av celler som genomgår programmerad celldöd. Sätt att ta itu med dessa problem skulle bekräftar resultaten med en annan analys som en mikroflödessystem baserat test och ett tidsförlopp experiment där migration mäts under kortare tidsperioder. Förutom små populationer, Mogen monocyter inte föröka sig i vivo35,36. men om andra celler används, en tidslinje som är kortare än sin division cykel bör väljas att undvika en ökning av antalet celler. Alternativt bör reagenser blockerar celldelning användas för att undvika att ändra den ursprungligen guldpläterade mobilnummer.
Det protokoll som presenteras här kan lätt anpassas till studier av andra proteiner som utsöndras av cancerceller och deras parakrin funktioner. En av de möjliga tillämpningarna av villkorlig KD cancer cellinjer studerar rollen av proteiner vars KD är giftigt för celler inte bara in vitro- utan också i vivo, där Tet-reglerade cellinjer är xenotransplanted i möss, och KD är inducerad efter etablering av tumören genom tillsats av doxycyklin till dricksvattnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna Jacqueline Rosenberg för korrekturläsning manuskriptet. Detta arbete stöds av den oss Department of Health and Human Services/National Institutes of Health med ett bidrag till YA DeClerck (bevilja 5R01 CA 129377) och TJ Martell stiftelsen. MH Kubala är mottagare av en forskning karriär utveckling Fellowship award för Saban Research Institute vid Children's Hospital Los Angeles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tet-pLKO-puro lentiviral vector | Addgene | 21915 | |
| FBS (Tetracycline-free) | Omega Scientific | FB-15 | |
| Histopaque | Sigma | 10771-500ML | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell | 18002 | |
| EcoRI HF | NEB | R3101S | |
| AgeI HF | NEB | R3552S | |
| Cut Smart buffer | NEB | B7200S | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System | PROMEGA | A9281 | |
| psPAX vector | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G vector | Addgene | 12259 | |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C737303 | |
| Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain | Protocol | 123-869 | |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| XhoI restriction enzyme | NEB | R0146S | |
| Ligase | NEB | M0202S | |
| Ligase buffer | NEB | M0202S | |
| EDTA 0.5 M solution | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| The Big Easy" EasySep Magnet | Stem Cell | 18001 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 0.45 μM syringe filters | VWR International | 28145-479 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-500g | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Invitrogen | 15504-020 | |
| Sodium Chloride(NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653-5 kg | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| dithioerythritol (DTE) | Sigma-Aldrich | B8255-5g | |
| ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| tryptone | Amresco | J859-500g | |
| yeast extract | Fluka | 70161-500g | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5g | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Corning | 10-040-CV | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane | Becton Dickinson | 353097 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cotton-Tipped Applicator | Medline | MDS202000 | |
| Protocol Hema 3 STAT pack | Fisher Scientific Company | 123-869 | |
| Resolve Immersion Oil, High Viscosity | Richard Allan Scientific | M4004 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 |
References
- Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. Conditional transgenic technologies. J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).
- Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
- Franklin, R. A., et al. The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages. Science. 344 (6186), 921-925 (2014).
- Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27 (4), 462-472 (2015).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Mizuguchi, H., Hayakawa, T. Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system. Biochim Biophys Acta. 1568 (1), 21-29 (2001).
- Meyer-Ficca, M. L., et al. Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies. Anal Biochem. 334 (1), 9-19 (2004).
- Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
- Wee, S., et al. PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (35), 13057-13062 (2008).
- Chen, Y., Stamatoyannopoulos, G., Song, C. Z. Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro. Cancer Res. 63 (16), 4801-4804 (2003).
- Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. J Virol. 77 (16), 8957-8961 (2003).
- Solari, V., et al. MYCN-dependent expression of sulfatase-2 regulates neuroblastoma cell survival. Cancer Res. 74 (21), 5999-6009 (2014).
- Liao, Y., Tang, L. Inducible RNAi system and its application in novel therapeutics. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 630-638 (2016).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Jungi, T. W. Assay of chemotaxis by a reversible Boyden chamber eliminating cell detachment. Int Arch Allergy Appl Immunol. 48 (3), 341-352 (1975).
- Jung, H. S., et al. Monoclonal antibodies against autocrine motility factor suppress gastric cancer. Oncol Lett. 13 (6), 4925-4932 (2017).
- Park, H., et al. Effect of Sorbus commixta on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells. Int J Mol Med. , (2017).
- Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. Monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and THP-1 cells exhibit different cytokine expression patterns following stimulation with lipopolysaccharide. Mediators Inflamm. 2013, 697972 (2013).
- Heil, T. L., Volkmann, K. R., Wataha, J. C., Lockwood, P. E. Human peripheral blood monocytes versus THP-1 monocytes for in vitro biocompatibility testing of dental material components. J Oral Rehabil. 29 (5), 401-407 (2002).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
- Flo, R. W., et al. Negative selection of human monocytes using magnetic particles covered by anti-lymphocyte antibodies. J Immunol Methods. 137 (1), 89-94 (1991).
- Grondahl-Hansen, J., et al. Plasminogen activator inhibitor type 1 in cytosolic tumor extracts predicts prognosis in low-risk breast cancer patients. Clin Cancer Res. 3 (2), 233-239 (1997).
- Borgfeldt, C., Hansson, S. R., Gustavsson, B., Masback, A., Casslen, B. Dedifferentiation of serous ovarian cancer from cystic to solid tumors is associated with increased expression of mRNA for urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR) and its inhibitor (PAI-1). Int J Cancer. 92 (4), 497-502 (2001).
- Devy, L., et al. The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent. FASEB J. 16 (2), 147-154 (2002).
- Bajou, K., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 protects endothelial cells from FasL-mediated apoptosis. Cancer Cell. 14 (4), 324-334 (2008).
- Xu, X., Wang, H., Wang, Z., Xiao, W. Plasminogen activator inhibitor-1 promotes inflammatory process induced by cigarette smoke extraction or lipopolysaccharides in alveolar epithelial cells. Exp Lung Res. 35 (9), 795-805 (2009).
- Ji, Y., et al. Pharmacological Targeting of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Decreases Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (11), 2167-2175 (2016).
- Carmeliet, P., et al. Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice. Circulation. 96 (9), 3180-3191 (1997).
- Cao, C., et al. Endocytic receptor LRP together with tPA and PAI-1 coordinates Mac-1-dependent macrophage migration. EMBO J. 25 (9), 1860-1870 (2006).
- Thapa, B., Koo, B. H., Kim, Y. H., Kwon, H. J., Kim, D. S. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates infiltration of macrophages into melanoma via phosphorylation of FAK-Tyr(9)(2)(5). Biochem Biophys Res Commun. 450 (4), 1696-1701 (2014).
- Kortlever, R. M., Higgins, P. J., Bernards, R. Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence. Nat Cell Biol. 8 (8), 877-884 (2006).
- Fang, H., Placencio, V. R., DeClerck, Y. A. Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function. J Natl Cancer Inst. 104 (19), 1470-1484 (2012).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56 (3), 236-240 (1994).
- Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
- Bauer, M., Goldstein, M., Heylmann, D., Kaina, B. Human monocytes undergo excessive apoptosis following temozolomide activating the ATM/ATR pathway while dendritic cells and macrophages are resistant. PLoS One. 7 (6), e39956 (2012).
