Summary
Este protocolo serve como um esquema para a criação de um sistema funcional de Tet-ON em linhas de células de câncer e sua utilização posterior, em especial para estudar o papel das proteínas derivado de células de tumor no recrutamento de monócitos/macrófagos para o microambiente do tumor.
Abstract
siRNA e mediada por shRNA derrubar métodos (KD), de regular a expressão gênica são ferramentas inestimáveis para compreender a função do gene e proteína. No entanto, no caso que o KD da proteína de interesse tem um efeito letal sobre as células ou o efeito esperado o KD é dependente do tempo, incondicionais métodos KD não são adequados. Sistemas condicionais são mais adequados nestes casos e têm sido alvo de muito interesse. Estes incluem sistemas de superexpressão isoinokosterone-inducible, de sistema de indução do citocromo P-4501, e a tetraciclina regulada sistemas de expressão do gene.
O sistema de expressão de gene de tetraciclina regulada permite controle reversível sobre a expressão da proteína por indução da expressão de shRNA na presença de tetraciclina. Neste protocolo, apresentamos um projeto experimental usando o sistema funcional de Tet-ON em linhas de células cancerosas humanas para condicional regulação da expressão génica. Então, vamos mostrar o uso deste sistema no estudo da interação célula-monócito de tumor.
Introduction
Tumor associado os macrófagos (TAMs) contribuam para o desenvolvimento de tumor, promovendo o crescimento do tumor, metástase e regulação da resposta imune2. As células cancerosas recruta monócitos inflamatória, que se infiltrar o tumor e se diferenciar em pro-oncogenicidade TAMs3. Infiltração do tumor com TAMs correlaciona-se com resultado clínico ruim e tem sido associada à função imunossupressora de macrófagos4,5. No entanto, os mecanismos de recrutamento de macrófagos para o tumor não são bem explorados e uma melhor compreensão das vias envolvidas é crucial para o avanço mais do campo e terapias promissoras. Um dos desafios no estudo de interações entre células tumorais e as células normais no microambiente do tumor (TME) é a complexidade dos mecanismos e de células envolvidas, exigindo abordagens em vitro que permitem que a dissecação do crosstalk. Aqui apresentamos uma metodologia versátil que pode ser aplicada para estudar o efeito parácrina de um cancro derivado de células, proteína secretada na migração de outros tipos de células como macrófagos, em vitro. Usando um sistema onde a expressão do shRNA contra um cancro derivado de células da proteína envolvida no recrutamento de monócitos está sob o controle do promotor inducible tetraciclina, o efeito de parácrina da proteína secretada em monócitos é quantificado. Neste protocolo, clonagem de shRNA sequências em vetor regulamentado é apresentado a tetraciclina seguido pela geração de linhas de células de câncer estável. Além disso, a purificação de monócitos humanos primários e um ensaio de câmara Boyden são usados para analisar o efeito parácrina uma proteína derivada de célula cancerosa na migração de monócitos.
Downregulation de proteína codificação de genes é comumente aplicado com técnicas de siRNA e shRNA, embora não sem limitações no seu uso. O longo prazo knock-down (KD) de genes pode eliciar respostas adaptativas secundárias das células que interferem com os resultados experimentais. Falta de controle temporal sobre a expressão dos genes torna desafiador para estudar o papel dinâmico de uma proteína ao longo do tempo ou o papel de uma proteína essencial para a sobrevivência da pilha. Esta questão é especialmente importante nas configurações na vivo , onde o papel de uma proteína no desenvolvimento do tumor e progressão pode exigir downregulation da expressão da proteína de interesse, só depois o tumor é estabelecida. KD condicional tem a vantagem de evitar um efeito letal cedo de KD a células e para permitir a análise do papel da proteína dentro de diferentes estágios de crescimento do tumor, enquanto KD incondicional pode resultar em falta de desenvolvimento do tumor.
Um número de condicional KD sistemas foram desenvolvido para resolver as limitações de KD estável. Os sistemas de expressão do gene condicional incluem isoinokosterone-inducible superexpressão sistemas, o citocromo P-450 indução sistema1, e tetraciclina regulada sistemas de expressão do gene. Os sistemas de expressão do gene tetraciclina-regulado permitem controle sobre a expressão do shRNA sobre adição da antibiótico tetraciclina (ou seu análogo mais estável - doxiciclina). Em sistemas de Tet-ON, a expressão de shRNA é induzida na presença de tetraciclina/doxiciclina, resultando em uma expressão de gene KD, enquanto em sistemas de Tet-OFF, a expressão de shRNA é suprimida na presença de tetraciclina, resultando na expressão gênica. Uma desvantagem do sistema tetraciclina-inducible é relatados anteriormente a baixos níveis de expressão de shRNA na ausência de doxiciclina - so-called leakiness6,7. No Tet-ON sistema descrito aqui, após administração de tetraciclina, a ligação da proteína do repressor (juntos) tetraciclina constitutivamente expressa à sequência de elemento (TRE) Tet-responsivo na região promotora do shRNA de interesse é o H1 suprimida. Isso resulta em expressão de shRNA e inibição da tradução da proteína de interesse em uma maneira dependente de tetraciclina8,9.
Outros sistemas de Tet-ON disponíveis incluem bater-em simultâneo do TetO começar a sequência entre caixa TATA e elemento de sequência proximal (PSE) e entre a transcrição e caixa TATA site desenvolvido por Chan et al. 10 este sistema requer menos de doses tóxicas de tetraciclina para regular a expressão de shRNA, no entanto, sob um estado de não-induzida, níveis baixos de shRNA são expressos. A caixa Krüppel-associado (CASCUDO) com base em Tet-ON sistema11 inclui CASCUDO, uma proteína do dedo do zinco, que genes de indivíduos localizados dentro de um intervalo de 3 kb do sítio de ligação do CASCUDO supressão transcricional. A tTRKRAB de proteínas quiméricas pode ligar para o TetO, e devido a grande gama de capacidade controlável de DNA, TetO não precisa ser limitado entre a transcrição iniciar o site e o promotor e tem baixo impacto sobre a atividade do promotor. Sob o estado de não-induzida, este sistema de interferência de RNA controlável foi relatado para mostrar um nível inferior de expressão vazada de shRNA11,12; no entanto, requer uma abordagem de clonagem sequencial, dois-vector. Em comparação com anteriormente condicional KD sistemas desenvolvidos tais como o sistema de isoinokosterone-inducible superexpressão ou sistema de indução do citocromo P-450, o sistema de tetraciclina-regulado tem a vantagem de sua robustez e reversibilidade e, portanto, é o mais utilizado, rotineiramente, sistema13. O sistema utilizado no presente protocolo tem a vantagem sobre o TetO batida-em sistema dual e CASCUDO Tet-ON sistema como exige para a frente, o único vetor de clonagem, permitindo a rápida geração de vários clones, e apresenta níveis muito baixos de leakiness na ausência de doxiciclina.
TME é fundamental para o desenvolvimento de câncer. Para facilitar o crescimento do tumor, as células cancerosas recrutam inflamatórios monócitos através da secreção de proteínas Quimiotáticos. Os monócitos recrutados infiltrar o tumor e diferenciarem em pro-oncogenicidade TAMs que contribuem para o crescimento do tumor e metástases. Estudos in vitro do recrutamento celular imune utilizam ensaios de migração, com Boyden ensaio de câmara, sendo amplamente usado14,15,16,17. Neste ensaio, a fonte de proteína quimiotático, por exemplo, as células cancerosas, ou uma proteína purificada, é colocada na câmara inferior. Células do sistema imunológico são colocadas na câmara superior, separada por uma membrana porosa do compartimento inferior. Migrando para o gradiente crescente de quimiotático e aqueles encontrados no lado inferior da membrana de células são manchadas e contadas sob o microscópio. Aqui nós testamos a função quimiotático de plasminogênio ativador inibidor 1 (PAI-1) em monócitos por gerar linhas de células de câncer estável, inducible onde a expressão de PAI-1 é regulada pela adição de doxiciclina. Nós usamos humanos primários monócitos no ensaio de migração de Boyden câmara para avaliar o papel de PAI-1 em migração de monócitos. Diferenças entre humanos primários monócitos e linhas de célula monocítica amplamente utilizada como THP1 têm sido relatadas e incluem citocinas diferentes padrões de expressão18; por exemplo, aumento de 5-10 vezes nos níveis de expressão de TNF-α por células THP1 comparado com monócitos humanos19. As células THP1 são derivados de células de leucemia humana monocítica, são fáceis de manter e se proliferam com uma média de tempo de 19-50 h20de duplicação. Pelo contrário, os monócitos humanos caracterizam-se por uma vida curta na ausência de fatores de crescimento. Uma vez que os monócitos são purificados de sangue de doadores, uma quantidade razoável de variabilidade ocorre entre os indivíduos e, dependendo do método de purificação, pode ocorrer contaminação com outros tipos de células. Não obstante, monócitos primários são relevantes e foi recomendado para usar ou confirmar os resultados obtidos com as linhas de célula monocítica usando monócitos primários em pesquisas biológicas19. Aqui descrevemos um protocolo para a purificação do humanos primários monócitos do sangue periférico. Métodos alternativos de purificação monócito incluem protocolos de aderência e gradiente de densidade e procedimento de dois passos com único gradientes de Ficoll-Hypaque seguido por um gradiente de Percoll21. A pureza da população monócitos obtida por esses intervalos de métodos entre 70-90%. O método descrito aqui usa um gradiente de densidade, seguido por uma seleção negativa imune22 e permite a purificação de monócitos humanos sem contacto directo com os anticorpos, assim, evitando a sua activação acidental e resultando em um > 95% da população pura de monócitos.
O protocolo apresentado aqui é usado para configurar um sistema funcional de Tet-ON para expressão gênica KD em linhas de células cancerosas humanas para estudar o efeito quimiotático da câncer-derivado secretada proteína PAI-1 em monócitos. PAI-1 é overexpressed por uma variedade de tumores e sua expressão, paradoxalmente, correlaciona-se com resultado clínico ruim23,24. O papel pro-oncogenicidade do PAI-1 é um resultado de sua pro-angiogênico e anti-apoptotic funções25,26. PAI-1 tem demonstrado contribuir para a inflamação, promovendo o recrutamento de macrófagos para o local da inflamação,27. PAI-1 foi mostrado para promover o músculo liso cellmigration28,29 e participar no Mac-1 dependente macrófago migração30. PAI-1 superexpressão também mostrou significativamente melhorar o recrutamento de macrófagos 264.7 crus para de tumores de melanoma B16F1031. No entanto, o papel de PAI-1 em migração TAM não tem sido pesquisado em detalhe. Nós usamos o protocolo descrito para responder à pergunta de se o PAI-1 atrai monócitos para células cancerosas. Esta metodologia permite que a dissecação do crosstalk entre tumor e TME silenciar a proteína secretada em células cancerosas e analisando os componentes do TME.
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Protocol
A seção de protocolo que usa monócitos humanos obtidos de voluntários sadios segue as diretrizes do Hospital Los Angeles humano pesquisa Comitê das crianças de ética e foi aprovada pelo Conselho de revisão institucional sob o Material humano Número do protocolo: ICC 08-00208.
1. preparação de linhas de células de câncer com tetraciclina-regulado shRNA expressão
- Clonagem de shRNA PAI-1 em vetor Tet-pLKO-puro 8 , 9
- Projeto oligómeros de shRNA que contêm a idadeque eu e o EcoRI clivagem site na extremidade 5', a sequência de sentido, um loop de 6 nucleotídeos e a sequência antisentida.
Nota: Típicos oligonucleotides são projetados como segue: Forward oligo: 5' CCGG - 19-21 bp sentir - CTCGAG - 19-21 bp antisentido - TTTTT, oligo inversa: sentido de bp 5' AATTAAAAA-19-21 - CTCGAG - 19-21 antisentido de bp 3'. Protocolo detalhado para o projeto oligómero pode ser encontrado em 8. Neste estudo 3 sequências de shRNA contra PAI-1 foram testadas para o efeito mais forte e silencioso: shRNA 132, shRNA 2, shRNA 333e mexidos33 estão incluídos na tabela 1. - Recoze os oligômeros de shRNA e mexidos oligómeros de shRNA.
- Reconstituir os oligonucleotides a 100 µM em água e misture 1 do oligonucleotide frente µ l, 1 do oligonucleotide reversa µ l e 8 µ l H2O.
- Para recozer os oligonucleotides, misture o seguinte: 1 mistura de µ l do oligonucleotide, 5 µ l tampão 10 mM Tris (hidroximetil) aminometano (Tris) pH 7,5, 50 mM de cloreto de sódio (NaCl), 10 mM de cloreto de magnésio (MgCl2), dithioerythritol de 1 mM (DTE) e 44 µ l H 2 O.
- Incubar a mistura em um polymerase reação em cadeia (PCR) termociclador a 95 ° C por 5 min, desligue o aparelho e esperar até que atinja a temperatura de quarto (RT).
- Oligonucleotídeos recozidos precipitados pela adição de 5 µ l 3 M acetato de sódio pH 5.2 a 50 µ l recozido oligonucleotides.
- Adicione 100 µ l frio 100% de etanol (EtOH) e incube por 30 min a-80 ° C. Centrifugue em uma centrífuga de bancada na velocidade máxima durante 30 min a 4 ° C.
- Remover o sobrenadante, adicionar 500 µ l frio 70% EtOH, centrífuga para 30 min, retire o sobrenadante e dissolver a pelota em 20 µ l H2O.
- Avaliar a concentração dos oligonucleotides recozidos por espectrofotometria, medindo a absorbância em 260 nm. Oligonucleotídeos diluídos para a concentração final de 1 ng / µ l.
- Prepare o meio de Luria Bertani (LB) e placas de ágar LB.
- Por meio de LB, dissolver 10 g triptona, extracto de levedura 5 g, 10 g de NaCl em 1 L de água. Ajustar o pH do meio a pH 7.0 usando 1 N NaOH e autoclave.
- Para placas de ágar LB, adicione 15 g/L de ágar-ágar em meio LB. Autoclave e cool até aproximadamente 50 ° C. Adicionar o antibiótico e despeje as placas.
- Raia bactérias transfectadas com Tet-pLKO-puro vetor (veja a Tabela de materiais) na LB placa de ágar suplementado com ampicilina 100 de µ g/mL e incubar durante uma noite (O/N) a 37 ° C.
- Inocular a 100 mL de meio de LB suplementado com ampicilina de 100 µ g/mL (LB/ampicilina) com 1 colônia da placa e crescer O/N agitando a 37 ° C.
- IsolateTet-pLKO-puro da cultura bacteriana 100ml, usando um kit de isolamento do plasmídeo.
- Preparar a reação de restrição para o vetor de Tet-pLKO-puro com enzimas de restrição EcoRI e AgeI como segue: 1 µ l EcoRI, 1 µ l AgeI, buffer de 5 µ l x 10, 1 µ l do plasmídeo DNA (1 µ g), 42 µ l H2O. Incubar 1 h a 37 ° C. Para obter o suficiente de vetor clivada, prepare reações de até 5 x 50 µ l.
- Use gel de agarose 1% para purificar clivada vetor do gel do agarose usando um kit de purificação de DNA. Para aumentar o rendimento do ADN, minimize o agarose a proporção de DNA no gel usando um pente de gel de agarose para grandes poços e removendo cuidadosamente a maioria da agarose da banda usando um bisturi.
- Prepare a mistura de reação da ligadura do seguinte modo: 1 os oligonucleotides ng recozido, vetor clivada de 50 ng, 2 µ l x 10 ligase buffer, 1 ligase µ l e água até 20 µ l. ligam o vetor com oligonucleotídeos de shRNA recozido em 16 ° C O/N.
- Prepare-se para além disso, uma reação de controlo negativo sem oligonucleotides para dar conta uncleaved, parcialmente entalhada e auto ligado vetor que irá resultar em falsas positivas colônias.
- Usando as técnicas padrão de transformação, transforme misturas de ligadura em células bacterianas quimicamente competentes visa evitar recombinação homóloga de Lentivirus vetores contendo repetições diretas.
- Crescer bactérias em placas com ampicilina O/N a 37 ° C.
Nota: Se o crescimento de colônias de satélite ocorre, repita a transformação e crescer bactérias a 30 ° C para desacelerar o crescimento e assim evitar a colónias de satélite. - Para verificar o êxito da ligadura, escolhe entre colônias única de 10-20, inoculando mL 2 LB/ampicilina culturas e uma placa de ampicilina como uma placa de estoque (para ser usado mais tarde como um clone positivo). Cultivar culturas líquidas agitando O/N a 37 ° C. Incubar a placa O/N a 37 ° C.
- Selar a placa com parafilm e em 6 ° C.
- Isole o Plasmídeo de culturas líquidos usando um kit de isolamento do plasmídeo.
- Realizar análise de restrição de Plasmideo DNA isolado de colônias ampicilina-resistentes utilizando a enzima XhoI. Para cada clone, prepare a mistura de reação a seguir: 0,5 µ l XhoI, buffer de 10 x 2,5 µ l, 1 µ l Plasmídeo (0,5 µ g) e 21 µ l H2O. Incubar durante 1 h a 37 ° C. Analise o resultado da reação de restrição executando a reação em um gel de agarose a 1%.
Nota: Análise de restrição do vetor WT clivada por XhoI gerará 3 fragmentos: 8.447, 1.800 e 200 bp. A sequência de estofador em Tet-pLKO-puro vetor de 1.800 bp não está presente no positivos clones contendo shRNA-PAI-1 e a digest XhoI resultará em fragmentos de DNA do tamanho: 8.447, 190 e 130 bp. Como mostrado na Figura 1, o fragmento de bp 2.000 não é encontrado no DNA isolado do número de colônias resistentes ampicilina: 3, 8 e 11. Dependendo do design dos oligonucleotides, o comprimento e o número de fragmentos obtidos no DNA das colônias positivas podem variar. - Verificar a inserção adequada das sequências de shRNA para o vetor de Tet-pLKO-puro por sequenciamento8,9.
- Inocular a colônia contendo o clone correto a 100ml cultura LB/ampicilina e crescer O/N a 37 ° C.
- Isole o Plasmídeo usando um kit de isolamento do plasmídeo.
- Projeto oligómeros de shRNA que contêm a idadeque eu e o EcoRI clivagem site na extremidade 5', a sequência de sentido, um loop de 6 nucleotídeos e a sequência antisentida.
- Geração de partículas de lentivirus.
- Revestir um prato de cultura de tecidos de 15 cm com poli-L-lisina, cobrindo a superfície do prato com solução estéril de água do 0,01% poli-L-lisina e incubando em RT durante 15 min. remover a solução por aspiração e secar os pratos.
- Semente de 5 x 106 293 de rim embrionário humano células (HEK293) no prato 15cm poli-L-lisina-revestido, e cultura médio e médio (DMEM) modificado águia de Dulbecco suplementado com 10% FBS e 1% de mistura de penicilina/estreptomicina (caneta/Strep) a 37 ° C, 5% CO 2 até que eles atinjam 70% confluência.
- Para produzir partículas virais, transfect células HEK293 com 25 µ g pLKO-Tet-na-shRNA, 25 µ g psPAX, (embalagem do plasmídeo) e 5 µ g pMD2.G plasmídeos (plasmídeo expressando de envelope) usando o reagente de transfeccao.
Nota: plasmídeos psPAX e pMD2.G são um presente do laboratório Didier Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne, Suíça). - Induzi células HEK293 no dia seguinte, alterando o meio para DMEM suplementado com 10 mM de sódio butirato e 20 mM HEPES pH 7.2 e cultivo para 8 h.
- Lavar as células com tampão fosfato salino (PBS) e adicionar 25 mL de fresco DMEM médio contendo 20 mM 4 ácido-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES) pH 7,2. Após a incubação a 37 ° C por 48 h, cuidadosamente coletar médio contendo vírus pipetando; Evite derramamentos.
- Filtre o meio coletado através de um filtro de seringa de 0,45 µM para remover células HEK293. O meio contendo partículas virais pode ser usado imediatamente ou armazenado a-80 ° C para uso posterior.
- Geração de linhas de células transfectadas estàvel
- HCT116 células de câncer de cólon e células de câncer de mama MDA-MB-231 de 50.000 células/poço em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de sementes caneta/Strep em uma placa de 12. Incube a 37 ° C em 5% CO2 até que as células são de 60-70% de Confluencia.
- Lavam-se células com PBS e adicione 1 mL de vírus contendo médio e câncer de células e O/N, incubar a 37 ° C em 5% CO2. Como um controle, adicionar 1 mL de meio fresco DMEM, suplementado com 10% FBS e 1% caneta/Strep 2 poços com células cancerosas.
- Remova cuidadosamente o meio contendo vírus por aspiração. Lavar as células com PBS e alterar o meio para DMEM com 10% (v/v), tetraciclina-free FBS (Tet-livre) e 1% caneta/Strep.
- Depois de 72 h, lavam-se células com PBS e alterar o meio DMEM 10% FBS Tet-free 1% caneta/Strep, puromicina 1 µ g/mL para a seleção de células transfectadas de vírus.
- Dependendo da linhagem celular usada, ajustar a concentração de puromicina para seleção ideal testar a gama de concentrações de puromicina (0.1, 0.5, 1, 2 e 5 µ g/mL) em células não transfectadas e escolhendo a menor concentração onde sobrevivem sem células de controle após 3 dias de cultura.
- Selecione células transfectadas vírus cultivo de células na presença de puromicina 3-14 dias. Como controles, prepare dois poços adicionais com células não transfectadas, um com meio contendo puromicina e outra sem puromicina. Observe a matança parcial das células por puromicina no poço com células transfectadas-vírus em relação ao controle de poços.
Nota: As células não transfectadas não crescerá na presença de puromicina. - Verificar a eficiência da condicional KD no resistente a puromicina HCT116 câncer de cólon e células de câncer de mama MDA-MB-231.
Nota: A concentração eficaz de doxiciclina variará com a linhagem celular usada e deve ser titulada (normalmente a partir de 100 ng/mL a 2 µ g/mL).- Determine a concentração de doxiciclina não é tóxico para as células, mas eficaz em ácido a expressão da proteína de interesse. Neste protocolo, 1 µ g/mL foi usado com sucesso em vitro.
- Cultura de células para 72 h na presença e na ausência de doxiciclina de 0,1, 1 e 2 µ g/mL. Verificar o nível de expressão da proteína ativador (aqui, PAI-1) na célula lisada por Western blot-análise. Compare células HCT116 e MDA-MB-231 condicionalmente expressam shRNA para células controle ovos mexidos.
- Preparação do meio condicionado
- Semente de 1 x 106 células estàvel transfectadas com doxiciclina regulada pLKO-shRNA contendo lentivírus em pratos de 10 cm.
- Linhas de células em meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) com 10% FBS Tet-free e 1% de crescer caneta/Strep na ausência e presença de 1 doxiciclina µ g/mL para 72 h a 37 ° C em 5% de CO2, adicionando doxiciclina fresca diariamente.
Nota: O meio RPMI é compatível com as condições de cultura de monócitos. A doxiciclina é um composto de luz sensível. Proteger as culturas de células de luz, coberta com papel alumínio e evitar trabalhar sob exposição à luz direta. - Coletar o médio pipetando, filtrar com filtro de 0,45 µm e congelar a-80 ° C em alíquotas.
2. isolamento de monócitos do sangue humano
- Isole os monócitos do sangue periférico humano.
Nota: Monócitos primários humanos são isolados de 7 mL de glóbulos brancos, concentrados em um filtro de leucócitos obtido de doadores de plaquetas saudáveis. Dependendo do doador, um filtro de leucócitos produz entre 1 x 109 e 2 x 109 de células mononucleares de sangue periférico (PBMC), aproximadamente 10% dos quais constituem os monócitos.- Prepare a estação de trabalho no fluxo laminar.
- Esterilize a tesoura e o fluxo laminar com luz ultravioleta (UV) por 30 min.
- Pulverize o filtro de leucócitos com 70% EtOH e secado ao ar dentro do fluxo laminar.
- Corte as duas extremidades do filtro de leucócitos com uma tesoura e esvazie o conteúdo do filtro em um tubo de 50 mL.
- Dilua a 90 mL adicionando PBS contendo 1% (v/v) FBS (PBS/FBS).
- Prepare os tubos de 3 x 50 mL com 15 mL de solução de densidade gradiente. Camada lentamente a 30 mL de PBS/FBS diluído sangue sobre a densidade gradiente solução usando um pipeta controlador definida no fluxo gravitacional para evitar a mistura das camadas.
- Centrifugue em um rotor de balanço a 400 x g em RT sem freios por 25 min.
- Elimine a camada superior e transferir a camada média contendo PBMCs para um tubo 50 mL.
- Adicione QUE PBS/FBS até 50 mL e centrifugar x 120 g em RT por 10 min. Retire o sobrenadante contendo as plaquetas. Repita mais duas vezes.
- Resuspenda o pellet em 50 mL de PBS/FBS e contar os PBMCs usando um hemocytometer. Centrifugar a 120 x g em RT e resuspenda o pellet em PBS/FBS contendo 1mm de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (PBS/FBS/EDTA) a uma concentração final de 5 x 107 células/mL.
- Use um kit de seleção negativa para enriquecer os monócitos pela depleção de células não-monocítica.
Nota: O kit de seleção negativa usa um coquetel de anticorpos (CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123 e glucoforina A) contra T células NK células, neutrófilos, B células, granulócitos e eritrócitos. Os complexos de anticorpos ligam-se a superfície dessas células não-monocítica e às partículas magnéticas de dextrano. Quando o tubo é colocado em um ímã, os grânulos de aderirem às paredes do tubo e retirar as células não-monocítica da solução.- Adicionar 50 µ l do anticorpo cocktail para 1 mL de 5 x 107 PBMCs/mL, misture com uma pipeta e incubar durante 10 min em grânulos magnéticos de RT. Adicionar 50 µ l para os PBMCs com o anticorpo cocktail, misturar com uma pipeta e incubar durante mais 10 minutos no RT
- Adicione PBS/FBS/EDTA até 25 mL e coloque a mistura PBMC em um ímã que pode acomodar um tubo de 50 mL. Incube durante 10 minutos a RT. magnético grânulos irão aderir às paredes do tubo e sequestrar as células não-monocítica da solução.
- Utilizando uma pipeta de 25 mL, remova a solução contendo os monócitos do tubo no imã. Tenha cuidado para não tocar os lados do tubo com a pipeta.
- Centrifugue a solução a 250 x g em RT, remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado contendo monócitos em meio RPMI contendo 10% FBS Tet-free e 1% caneta/Strep.
3. ensaio de migração de câmara Boyden
- Preparar a solução de albumina de soro bovino (BSA) de 1% (p/v), dissolvendo 1 g de BSA em 100 mL de água ultrapura e filtrar através de um tamanho de poro de 0,2 µm para esterilizar.
- Incube as inserções de membrana porosa em 1% solução estéril BSA O/N para aderência melhorada de macrófagos para a membrana. Por monócitos/macrófagos, use 5-8 µm inserções de tamanho dos poros.
- Encha um prato de cultura de tecidos estéreis com solução de 1% de BSA e coloque as inserções no prato. Aplica 200 µ l 1% BSA solução dentro as inserções.
- Lave as inserções duas vezes, colocando-os em um prato cheio de PBS estéril e PBS aplicando dentro do filtro.
- 40.000 HCT116 ou MDA-MB-231 células em meio RPMI de 0,5 mL contendo 10% FBS Tet-free e 1% de sementes caneta/Strep por bem, em uma placa de 24, em triplicado. Como alternativa, coloque 0,5 mL do meio condicionado gerado anteriormente no poço como uma fonte de quimiotático.
- No dia seguinte, os monócitos placa 8.000 no preparado inserir no volume de 0,3 mL do meio RPMI contendo 10% FBS Tet-free e 1% de caneta/Strep, em triplicado e incubar a 37 ° C em 5% CO2.
- Recolha as inserções após 48 h.
Nota: O comprimento de um experimento deve ser otimizado dependendo das condições específicas e células utilizadas, realizando um experimento de tempo-curso onde inserções são coletadas em momentos diferentes de incubação.- Sacuda o excesso de meio e precisamente, golpear a superfície interna com um cotonete para remover as células que não migrar.
- Mancha do lado exterior das pastilhas usando o método de Wright-Giemsa.
- Monte cuidadosamente 3 inserções/vidro slide em um óleo de imersão de microscópio de alta viscosidade, certificando-se de que o lado do filtro com macrófagos migrados enfrenta até.
- Imagem de slides usando um microscópio de luz, com o objectivo de X 20. Tire fotos de 9 campos/filtro. Conte migrados macrófagos em 9 campos/filtro.
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Representative Results
Três sequências de shRNA foram testadas para KD mais eficiente de PAI-1. Por isso, sequências de shRNA contra PAI-1 e ovos mexidos (tabela 1) foram clonadas em vetor de expressão Tet-pLKO-puro seguindo o protocolo descrito acima. A linha de celular HT-1080 Fibrossarcoma foi estàvel transfected com construções geradas e as células foram tratadas com doxiciclina por 3 dias. A expressão de PAI-1 foi verificada pela mancha de (Figura 2Aocidental) e a intensidade das bandas correspondente ao PAI-1 e tubulina foi analisada pela densitometria. Usando a sequência de KD mais eficaz (shRNA 2), além disso geramos células de adenocarcinoma de mama epiteliais do MDA-MB-231 (Figura 2B) e células de carcinoma colorrectal HCT116 (Figura 2) estàvel transfected com uma tetraciclina-regulado pLKO-shRNA2-PAI-1 expressão vetorial (e shRNA mexidos como um controle). Alcançamos uma redução de 74% de PAI-1 expressão em linha de celular MDA-MB-231 (Figura 2B) e diminuição de 17,5% na linha de celular HCT116 na presença de doxiciclina (1 µ g/mL)(,Figura 2), avaliadas pela mancha ocidental e densitométricos análise de as bandas. O ensaio de câmara Boyden foi usado para quantificar a migração de monócitos em direção as células cancerosas. Formulamos a esse cancro derivado de células PAI-1 promove a migração de monócitos para células tumorais e, portanto, menos migração será observado quando o PAI-1 é ativador pela adição de doxiciclina. As células cancerosas foram tratadas com doxiciclina por 3 dias e foram semeadas no fundo de uma placa de 24 células/poço 40.000. Purificada monócitos humanos primários foram aplicados na câmara superior do ensaio e após 24h, os monócitos anexados à parte inferior da membrana foram manchados e contados sob o microscópio. Demonstramos que a ausência de doxiciclina e, portanto, a presença de PAI-1, no MDA-MB-231 e HCT116 células (PAI-1 shRNA e controles mexidos), aumentaram significativamente a migração de monócitos humanos (Figura 3). A migração de monócitos então foi inibida por 33% e 74% quando doxiciclina foi adicionada às culturas co e a produção de PAI-1 por células tumorais foi para baixo-regulado (Figura 3A, C). Sem inibição da migração de monócitos, observou-se com tumor de células transfectadas com os controles de shRNA embaralhada, que também indicaram que doxiciclina não teve nenhum efeito inibitório sobre a migração de monócitos. Resultados semelhantes foram obtidos quando o meio condicionado de células de câncer tratados com doxiciclina foi colocado no fundo dos poços como fonte de quimioatraentes (Figura 3B, D).
Figura 1 . XhoI análise de restrição do DNA extraído de 16 colônias bacterianas. DNA foi extraído de 16 colônias bacterianas e submetido a reação de restrição com enzima XhoI. Os fragmentos de DNA resultantes foram analisados por eletroforese em gel de agarose. Clones positivos (faixas 3, 8 e 11) que não possuem o fragmento 2 kb após XhoI digest de restrição são marcadas com setas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Expressão condicional KD de PAI-1 em células cancerosas no. Mancha a análise da expressão de PAI-1 na linha celular estàvel ocidental transfected com tetraciclina-regulada pLKO-shRNA-PAI-1 (1-3 de shRNA) e mexidos vector de expressão após 3 dias de tratamento de doxiciclina. () HT1080. (B) MDA-MB-231. (C) HCT116. Análise de densitometria das bandas é indicado abaixo as pistas do Western borrões, como uma relação de PAI-1 intensidade sobre a intensidade da banda tubulina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . PAI-1 promove a migração de macrófagos. Migração de monócitos humanos para MDA-MB-231 do (A) e (C) HCT116 célula linhas estàvel transfected com vetor condicionalmente expressando de shRNA 2 contra PAI-1 e mexido shRNA, medido usando o ensaio de câmara Boyden. As células cancerosas foram tratadas com doxiciclina por 3 dias e semeadas em uma placa de 24 em triplicado. Monócitos primários humanos foram aplicados na parte superior da inserção. Após 24h, monócitos no lado inferior do filtro foram manchados e contados sob o microscópio. Migração de monócitos humanos em direção a meio condicionado gerado mais de 72 h (B) MDA-MB-231 e (D) linhas de célula HCT116 condicionalmente expressando PAI-1, na presença e na ausência de doxiciclina. Os dados representam a média dos técnico triplica [+ /-desvio padrão (SD)]. Para cada replicar, monócitos migrados foram contados em 9 campos em 20 X ampliação objetiva. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome do Oligo | Sequência de | ||||
| shRNA 1 (antiseqüência de PAI-1 1 - 8 ) | Para a frente: | shPAI-1A5' CCGGCTGACTTCACGAGTCTTTCCTCGAGGAAAGACTCGTGAAGTCAGTTTTT 3' | |||
| Reverso: | shPAI-1B 5' AATTAAAAACTGACTTCACGAGTCTTTCCTCGAGGAAAGACTCGTGAAGTCAG 3' | ||||
| shRNA 2: (anti-PAI-1 sequencial 2) | Para a frente: | shPAI - 1C 5'-CCGGCAGACAGTTTCAGGCTGACTTCTCGAGAAGTCAGCCTGAAACTGTCTGTTTTT-3' | |||
| Reverso: | shPAI - 1D 5'-AATTAAAAACAGACAGTTTCAGGCTGACTTCTCGAGAAGTCAGCCTGAAACTGTCTG-3' | ||||
| shRNA 3 (antiseqüência de PAI-1 - 3 9) | Para a frente: | shPAI-1E 5'-CCGGAAGGATGAGATCAGCACCACACTCGAGTGTGGTGCTGATCTCATCCTTTTTTT-3' | |||
| Reverso: | shPAI-1F 5'-AATTAAAAAAAGGATGAGATCAGCACCACACTCGAGTGTGGTGCTGATCTCATCCTT-3' | ||||
| Scramble (embaralhar sequência de 4 - 9) | Para a frente: | Misturar 1 5'-CCGGAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTT-3' | |||
| Reverso: | Scramble 2 5'-AATTAAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATT-3' | ||||
Tabela 1. sequências de shRNA. Aqui 3 sequências de shRNA contra PAI-1 foram testadas para o efeito mais forte e silencioso: shRNA 1, Plasmideo shRNA 3 e ovos mexido 2
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Discussion
Composto por uma variedade de tipos de células, o TME é crucial para o desenvolvimento de câncer. Para verificar as condições ideais de crescimento, as células cancerosas atraem monócitos através da secreção de Fatores Quimiotáticos. Aqui nós apresentamos um protocolo para o estudo do mecanismo de recrutamento de monócitos por tumor células em vitro. Para este efeito, uma combinação do sistema de expressão de gene inducible, purificação de monócitos humanos primários e como um exemplo de um ensaio de migração, o ensaio de câmara de Boyden, é usada.
O primeiro passo crítico no protocolo apresentado é para confirmar a clonagem correto das sequências de shRNA para o vetor de Tet-ON, que deve sempre ser avaliada por sequenciamento. Mais estabelecimento das linhas de célula funcionais estáveis Tet-ON deve ser confirmado por testes a KD na presença de doxiciclina pela mancha ocidental. A quantidade de doxiciclina aplicada pode variar entre linhagens celulares, e, portanto, é aconselhável testar as concentrações eficazes para KD e toxicidade sobre as células. Uma desvantagem conhecida de tetraciclina-inducible sistemas é sua leakiness6,7. A quantidade de proteína detectada na presença e na ausência de doxiciclina deve ser medida e comparada aos controles de ovos mexidos a conta para esse efeito. Em experimentos em vitro , um baixo nível de leakiness é observado com o KD shRNA2 e shRNA3, como é mostrado na Figura 2. Além disso, é importante sempre usar soro livre de tetraciclina em vitro para evitar downregulation dos níveis de proteína em condições de controle. O sistema utilizado neste protocolo tem vantagens sobre outros sistemas de Tet-ON como requer um único vetor de clonagem, permite a rápida geração de vários clones e apresenta níveis muito baixos de leakiness.
Um passo fundamental na obtenção de monócitos humanos primários do sangue é a obtenção de boa separação gradiente, que se baseia em lenta estratificação do sangue diluído ao longo do gradiente de densidade. Outro passo importante do protocolo é para estimar corretamente o número de células antes da etapa de seleção negativa porque vai determinar a quantidade de grânulos de cocktail e magnético de anticorpo adicionado à suspensão sangue. Para garantir a reprodutibilidade de experimentos, mais de um doador de sangue deve ser usado na execução de replicar as experiências. Esta técnica é superior às alternativas existentes de purificação de monócitos, incluindo um gradiente de densidade e protocolo baseado na adesão de34 e um procedimento em duas etapas com gradientes único21, porque ele garante que contaminação baixa de linfócitos nível e de alta pureza (> 95%) de monócitos obtidos. Desde que os tipos de células não-monocítica são removidos da mistura PBMC por seleção negativa, monócitos não vêm no contato direto com os anticorpos presentes no coquetel do anticorpo e, portanto, o risco de se tornar ativado pela interação com anticorpos de monócitos é mínima. Aplicações alternativas das células obtidas podem incluir a diferenciação de monócitos em macrófagos através de experimentos in vitro e in vivo , onde os monócitos humanos são injetados em camundongos imunodeficientes. Modificações do protocolo comumente incluem o uso da lise de células vermelhas do sangue durante as etapas de lavagem de PBMC. Esta alteração visa remoção adicional das células vermelhas do sangue, aplicando pressão osmótica. Limitações da técnica incluem um número limitado de macrófagos que podem ser obtidos usando uma quantidade especificada dos reagentes.
O ensaio de migração de câmara Boyden é uma maneira rápida e simples para analisar se uma proteína secretada ou uma linha celular estimula a migração de outros tipos de células. As armadilhas deste ensaio incluem baixa sensibilidade e não contabilização de células em fase de morte celular. As maneiras de abordar as preocupações que confirmar os resultados com um ensaio diferente como um microfluidic baseada ensaio e uma experiência de tempo-curso onde a migração é medida durante períodos mais curtos de tempo. Exceto por pequenas populações, monócitos maduros não proliferam na vivo35,36; no entanto se outras células são usadas, uma linha de tempo mais curta do que o seu ciclo de divisão deve ser escolhida para evitar um aumento no número de células. Alternativamente, bloquear a divisão celular de reagentes devem ser usados para evitar alterar o número de células originalmente chapeado.
O protocolo aqui apresentado pode ser facilmente adaptado para estudos de outras proteínas secretadas pelas células cancerosas e suas funções parácrina. Uma das possíveis aplicações de linhas de células de câncer de KD condicionais é estudar o papel das proteínas cujo KD é tóxico para as células não só em vitro , mas também na vivo, onde linhas celulares Tet regulamentados são xenotransplanted em ratos, e é induzida a KD após o estabelecimento do tumor pela adição de doxiciclina para a água potável.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostaria de acusar Jacqueline Rosenberg para revisão do manuscrito. Este trabalho foi financiado nos nacional/departamento de saúde e serviços humanos institutos de saúde com uma subvenção para YA Santos (conceder 5R01 CA 129377) e o TJ Martell Foundation. Kubala MH é o destinatário de um prêmio de bolsa de desenvolvimento de carreira de pesquisa do Instituto de pesquisa de Saban L.a. às crianças Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tet-pLKO-puro lentiviral vector | Addgene | 21915 | |
| FBS (Tetracycline-free) | Omega Scientific | FB-15 | |
| Histopaque | Sigma | 10771-500ML | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell | 18002 | |
| EcoRI HF | NEB | R3101S | |
| AgeI HF | NEB | R3552S | |
| Cut Smart buffer | NEB | B7200S | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System | PROMEGA | A9281 | |
| psPAX vector | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G vector | Addgene | 12259 | |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C737303 | |
| Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain | Protocol | 123-869 | |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| XhoI restriction enzyme | NEB | R0146S | |
| Ligase | NEB | M0202S | |
| Ligase buffer | NEB | M0202S | |
| EDTA 0.5 M solution | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| The Big Easy" EasySep Magnet | Stem Cell | 18001 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 0.45 μM syringe filters | VWR International | 28145-479 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-500g | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Invitrogen | 15504-020 | |
| Sodium Chloride(NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653-5 kg | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| dithioerythritol (DTE) | Sigma-Aldrich | B8255-5g | |
| ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| tryptone | Amresco | J859-500g | |
| yeast extract | Fluka | 70161-500g | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5g | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Corning | 10-040-CV | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane | Becton Dickinson | 353097 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cotton-Tipped Applicator | Medline | MDS202000 | |
| Protocol Hema 3 STAT pack | Fisher Scientific Company | 123-869 | |
| Resolve Immersion Oil, High Viscosity | Richard Allan Scientific | M4004 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 |
References
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