Summary
En metode til at opnå dendrimer-baserede ujævn nanopatterns, der tillader nanoskala kontrol af lokale arginin-glycin-aspartinsyre-syre (M.H.T.) overflade tæthed er beskrevet og anvendes til undersøgelse af adhæsion og chondrogenic Celledifferentiering.
Abstract
Cellulære vedhæftning og differentiering er betinget af nanoskala disponeringen af ekstracellulære matrix (ECM) komponenter, med lokale koncentrationer med en større virkning. Her præsenterer vi en metode til at opnå store ujævn nanopatterns af arginin-glycin-aspartinsyre (M.H.T.)-functionalized dendrimers, at nanoskala kontrol af lokale M.H.T. overflade tæthed. Nanopatterns er dannet af overflade adsorptionen af dendrimers fra løsninger på forskellige oprindelige koncentrationer og er karakteriseret ved vand kontakt vinkel (CA), X-ray photoelectron spektroskopi (XPS), og scanning probe mikroskopi-teknikker som scanning tunneling mikroskopi (STM) og atomic force mikroskopi (AFM). Den lokale overflade tæthed af M.H.T. måles ved hjælp af AFM billeder ved hjælp af sandsynlighed kontur kort af interparticle minimumsafstande og derefter korreleret med celle vedhæftning svar og differentiering. Metoden nanopatterning præsenteres her er en enkel procedure, der kan skaleres på en enkel måde til store arealer. Det er således fuldt ud forenelig med celle kultur protokoller og kan anvendes til andre ligander, at øve koncentration-afhængige effekter på cellerne.
Introduction
Her beskriver vi en simpel og alsidig dendrimer-baseret nanopatterning metode til at opnå celle kultur overflader, der tillader kontrol af lokale klæbeevne på nanoplan. Nanoskala detaljer af ECM organisation er blevet rapporteret,1,2,3 og nanopatterning af celle vedhæftning overflader har givet dyb indsigt i cellulære krav til vedhæftning4, 5. Eksperimenter ved hjælp af micellar litografi-baserede nanopatterns afslørede en grænseværdi på omkring 70 nm for M.H.T. peptid nanospacing, celle vedhæftning forsinkes væsentligt over denne værdi6,7,8 ,9. Disse undersøgelser også fremhævet større indflydelse af lokale end global ligand tæthed på celle vedhæftning9,10,11.
Under morfogenese udløse celle interaktioner med det omgivende miljø hændelserne første differentiering, som fortsætter indtil sidste komplekse strukturer er blevet dannet. Inden for denne ramme, har nanopatterned overflader været brugt til at tackle indflydelsen af de oprindelige celle-overflade interaktioner på morfogenese. Litografi-baserede M.H.T. nanopatterns med en lateral afstand af 68 nm i β-typen Ti-40Nb legeringer hjælp til at opretholde den udifferentierede Fænotypen af ikke-begået stamceller12, mens M.H.T. nanospacings af mellem 95 og 150 nm øge differentiering af mesenchymale stamceller (msc) mod adipogenic/osteogenic13,14,15 og chondrogenic skæbner16. Også, selvsamlende makromolekyler modificeret med signaling komponenter har vist sig at direkte celle vedhæftning og differentiering gennem nanoskala arkitektoniske regulering af signaling stikord17. I denne henseende er aflejring af dendrimers med celle-interagere fraspaltning i deres ydre kugle18,19,20 på overflader blevet brugt til at studere cellen vedhæftning21,22, morfologi23,24, og migration begivenheder25,26. Ikke desto mindre, manglen overflade karakterisering i disse undersøgelser gør det vanskeligt at etablere en sammenhæng mellem dendrimer overflade konfiguration og celle respons.
Dendrimer nanopatterns med væske-lignende ordre og definerede afstand kan opnås, når dendrimers adsorberes til lav-opkrævet overflader fra løsninger med lav ionisk styrker. 27 på grundlag af denne egenskab, her præsenterer vi en metode til at opnå store ujævn nanopatterns af M.H.T.-functionalized dendrimers på lav-opkrævet overflader, at nanoskala kontrol af lokale M.H.T. overflade tæthed. Vand kontakt vinkel (CA), X-ray photoelectron spektroskopi (XPS) og scanning probe mikroskopi teknikker (STM og AFM nanopatterns) Vis, lokale ligand tætheder kan justeres ændre den oprindelige dendrimer koncentration i opløsning. Den lokale M.H.T. overflade tæthed er kvantificeret fra AFM billeder af sandsynlighed kontur kort af interparticle minimumsafstande og derefter korreleret med celle eksperimenter. Sammenlignet med andre nanopatterning teknikker4, dendrimer-baseret nanopatterning er ligetil og nemt kan skaleres til store arealer, således at være fuldt kompatible med celle kultur applikationer. Nanopatterns bruges som bioaktive substrater til at vurdere effekten af den lokale M.H.T. overflade tæthed på celle vedhæftning28 og på chondrogenic induktion af voksne menneskers MSCs29. Vores resultater viser at M.H.T. dendrimer-baseret nanopatterns opretholde cellevækst og at celle vedhæftning er forstærket med høje lokale M.H.T. overflade tætheder. I eksperimenter differentiering mellemliggende klæbeevne af celler til substraterne begunstiget MSC kondens og tidlig chondrogenic differentiering. På grund af den lethed, med hvilken dendrimer perifere grupper kan ændres, kan metoden beskrevet her udvides yderligere til andre ECM ligander, at øve koncentration-afhængige effekter på cellerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. underlaget forberedelse
-
Udglødning 1,4 x 1,1 cm Au(111) på glimmer substrater.
- Placer Au(111) substrat på glas-keramisk kogeplade og bind det med en butan flame i 3 min. Tillad substrat til afkøling under en argon atmosfære. Gentag dette trin for hver Au(111) substrat.
Bemærk: Au(111) substrater bør anvendes umiddelbart efter afkølingen.
- Placer Au(111) substrat på glas-keramisk kogeplade og bind det med en butan flame i 3 min. Tillad substrat til afkøling under en argon atmosfære. Gentag dette trin for hver Au(111) substrat.
-
Forberedelse af Poly (L-mælkesyre) (PLLA)-belagt glas substrater.
- Klippe og vaske glas lysbilleder.
- Skære mikroskopi dias i 18 lysbilleder af 1,25 cm x 1,25 cm med en diamant-tip cutter. Gøre en lille fordybning på den nederste side af hvert dias, så de øverste og nederste sider kan skelnes senere.
- Vask dias grundigt med deioniseret vand efterfulgt af 96% ethanol. Lade dem lufttørre.
- Forberede 2% PLLA løsning.
- Tilføje 200 mg af PLLA til 10 mL af 1,4-dioxan i en presset tube. Tilføje en røre bar og luk glasset tæt.
- Tryk røret anbringes i et glycerin bad på en varmeplade ved 60 ° C under blid omrøring i 24 timer, og derefter overføre løsningen til en 15 mL hætteglas.
- Belægning glas dias med PLLA løsning.
- Placer glas lysbilleder og hætteglas med PLLA løsning på en ren varmeplade ved 60 ° C. Sørg for at placere dias opad og tillade dem at forblive i mindst 10 minutter at nå den nødvendige temperatur.
- Forberede spin coater og indstille programmet angivet i tabel 1.
- Placer en af dias ansigt op på spin coater, ved hjælp af et vakuum system. Pasteur pipette, anvende 0,25 mL af PLLA på diaset, og sørg for, at hele overfladen er dækket. Køre programmet belægning. Gentag dette trin for hvert dias.
- Klippe og vaske glas lysbilleder.
2. Dendrimer Nanopatterning
-
Forberedelse af M.H.T.-Functionalized Dendrimer (M.H.T.-Cys-D1) 28 løsninger.
- Opløses 5 mg af dendrimer i 6.494 mL deioniseret vand. Dette er løsningen A.
Bemærk: Brug dendrimer stamopløsning inden for 6 måneders forberedelse. - Der sonikeres opløsning A i 10 min og udarbejde løsninger B og C efter tabel 2.
- Der sonikeres løsning C i 10 min og forberede løsninger, D, E og F efter tabel 2.
- Gemme løsninger B, C, D, E og F ved 4 ° C indtil brug. Løsning A kan opbevares ved-20 ° C til senere brug.
- Opløses 5 mg af dendrimer i 6.494 mL deioniseret vand. Dette er løsningen A.
-
Nanopatterning af M.H.T.-Cys-D1 Dendrimers på substraterne
- I en vævskultur hætte, sterilisere substraterne af bestråling dem med UV-lys for 13 min.
Bemærk: Dette trin er kun nødvendige, når nanopatterned underlag skal bruges som celle kultur substrater. I dette tilfælde, opretholde de sterile forhold (vævskultur hood, sterile materialer, løsninger og teknikker) for følgende trin. - Placer hver substrat ansigt op i wells af en plade, håndtere dem forsigtigt med en pincet.
- Der sonikeres løsninger B, C, D, E og F i 10 min.
- Passere M.H.T.-Cys-D1 dendrimer løsninger gennem et 0,22 µm diameter filter ved hjælp af en sprøjte direkte i brøndene indeholdende substrater (2 mL/hul). Mindst tre kopier pr. dendrimer koncentration er anbefalet. Lukke og forsegle pladen og forlade det ved stuetemperatur (RT) for 16 h.
- Fjern og kassér løsningerne. Vask substrater med steril deioniseret vand og tør. Butik substrater ved 4 ° C.
Bemærk: Protokollen kan pause her.
- I en vævskultur hætte, sterilisere substraterne af bestråling dem med UV-lys for 13 min.
3. forberedelse af kontrol substrater
Bemærk: Alle trin blev udført i en steril vævskultur hood, og kun sterile materialer, løsninger og teknikker blev brugt. Mindst styre seks substrater blev brugt (tre kopier af den positive kontrol) og tre kopier af den negative kontrol.
- I en vævskultur hætte, sterilisere substraterne af bestråling dem med UV-lys for 13 min.
-
Kontrol substrater for Fibroblast vedhæftning eksperiment.
- Bruge flamme-udglødet Au(111) substrater som den negative kontrol. Guld har en velkendt protein-denaturering effekt, der giver anti-klæbende celleegenskaber28. Alle løsninger der sonikeres og filtrere før substrat inkubation.
- For den positive kontrol, fordybe flamme-udglødet Au(111) substrater i en opløsning af M.H.T. modificerede PIND thiol, Ac-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp-NH-ethylene af ethylenglycol mono-11-mercaptoundecanamide (M.H.T.-PIND-SH)30 og triethylene glycol mono-11-mercaptoundecyl ether (PIND-SH) i forholdet 1: 100 kindtand i 96% ethanol til 16 h på RT.
- Vask substrater grundigt i ethanol og tør dem med argon. Butik substrater ved 4 ° C.
-
Kontrol substrater for Chondrogenesis.
- Bruge uberørte PLLA substrater som den negative kontrol. Uden hvilken som helst overflade behandling viser PLLA fattige samspil med levende celler. 31
- For den positive kontrol, forberede 5 mL af 0,1 mg/mL fibronektin i fosfatbufferet saltopløsning (PBS), og der inkuberes hver PLLA substrat med 1,6 mL af opløsningen, fibronektin for 1 h på RT.
- Fjern og kassér fibronektin løsning og vaske substrater med PBS. Butik substrater ved 4 ° C.
4. overflade karakterisering
-
AFM Imaging
- Udføre AFM imaging PLLA underlag for en ruhed analyse. Da dendrimers har en diameter på 4-5 nm, ruhed værdier af 1 nm bør opnås for ordentlig visualisering af nanopatterns. Også udføre AFM billeddannelse af nanopatterns. I begge tilfælde udføre AFM i trykke tilstand i luften.
- Vælg en silicium cantilever med en foråret konstant k = 40 N/m og en resonant frekvens ν = 300 kHz og montere det på AFM udstyr.
- Montere prøven på scenen af atomic force microscope. Afhængigt af opsætning af apparatet, kan tuning og imaging specifikationer variere. Konsultere producentens håndbog.
- Nærme prøven med spidsen af mikroskopet indtil kontakt.
- For at billede PLLA til ruhed analyse, skal du vælge mindst fire repræsentative områder af 20 x 20 µm per substrat fra tre uafhængige substrater. Billede dendrimer nanopatterns, vælge mindst tre repræsentative billeder af 5 × 5 µm per substrat fra tre uafhængige substrater pr. betingelse (indledende dendrimer koncentration i opløsningen). For at undgå at beskadige dendrimer lag mens imaging, justere sætpunktet for at holde kraften på et minimum.
Bemærk: Valget af det billeddiagnostiske område afhænger også den piezoelektriske scanneren arbejdsområde. Kontakt venligst manualen instrument i denne henseende. - Processen AFM højde billeder ved at montere hver scanning linje til polynomium nivellering funktioner ved hjælp af proprietære software på fabrikanten af apparatet AFM, og analysere dem fra PLLA til at beregne overfladeruhed. Root-mean square (RMS) analyse kan give en passende mulighed.
-
Lokale M.H.T. overflade densitetsmåling.
- Få billede tærsklerne for forarbejdede AFM højde billederne for at vælge dendrimers på overfladen.
- Bestemme partikel positioner ved hjælp af en billedbehandling software og bruge dem til at opnå de mindste interparticle afstande (dmin).
- Plot dmin værdier i z til de tilsvarende partikel positioner at opnå sandsynlighed kontur kort til dmin. Justere farveskalaen plot til at visualisere områder af højeste lokale M.H.T. overflade tæthed (dmin < 70 nm).
- Kvantificere området i regioner med den højeste lokale M.H.T. overflade tæthed ved hjælp af en billedbehandling software. Omfatte områderne af dendrimer aggregater i beregningen.
-
STM billeddannelse.
Bemærk: STM imaging kan udføres kun for nanopatterns på ledende Au(111) substrater. Målingerne er udført i luften.- Placer nanopatterned substrat i prøveholderen STM udstyr. Tjek den elektriske forbindelse mellem prøve og indehaveren med en tester.
- Etch en spidsen af det valgte sonde materiale (dvs. PT 0,8: Ir 0,2) med en diameter, der sikrer korrekt montering på hovedet af STM udstyr. Ætsning kan udføres enten ved manuel skæring eller ved elektrokemiske ætsning. 32
Bemærk: Elektrokemiske ætsning gengiver mere symmetrisk tips. - Montere tip i hovedet af STM udstyr og forbinde prøven.
- Sæt "aktuelle" i feedback-kanal (i denne form for måling, nuværende bliver konstant af feedback tuning). Justere bias spænding og nuværende sætpunktet og scanningsstørrelse at opnå et godt løst billede, når spidsen er engageret.
Bemærk: Valget af det billeddiagnostiske område afhænger også den piezoelektriske scanneren arbejdsområde. Kontakt venligst manualen instrument i denne henseende. - Processen STM topografiske billeder ved at montere hver scanning linje til polynomisk nivellering fungerer ved hjælp af proprietære software på fabrikanten af apparatet STM.
-
CA målinger.
- Foranstaltning CA på nanopatterned substrater af siddende-slip-metoden på tre forskellige positioner på tre uafhængige substrater pr. betingelse (indledende dendrimer koncentration i opløsning) med et optisk system til CA.
- Fyld mikrosprøjte med deioniseret vand og indstille parametre i CA-softwaren til at producere dråber 1 µL.
- Prøven anbringes på scenen, således at overfladen af prøven er klart synlige på computer til billedbehandling.
- Flytte sprøjte med micromanipulator, indtil det bliver tæt på overfladen og dispensere slip på overfladen. Optage billedet umiddelbart efter droplet stabilisering.
Bemærk: I CA målinger, det er meget vigtigt at kontrollere luftfugtighed for at sikre reproducerbare resultater. - Analysere CAs målt med den proprietære software på fabrikanten af apparatet CA. Metoden montering kan tilpasses brugerens behov. Metoden elliptiske montering kan være en mulighed.
5. cellekultur
Bemærk: Alle trin blev udført i en vævskultur hood, og kun sterile materialer, løsninger og teknikker blev brugt.
-
Fibroblast vedhæftning eksperiment.
- Kultur NIH 3T3 mus embryonale fibroblaster fra tidlig passager (< 10) ved 37 ° C og 4,6% CO2 atmosfære i basal medium med høje glukose suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 1% L-glutamin, 1% penicillin-streptomycin og 1% natrium pyruvat (vækstmedium). T75 kolber for en total såning af 500.000 celler pr. flaske i 10 mL af vækstmediet er anbefalet.
- Fjern gamle medium med 10 mL pipette hver 2 dage og erstatte med 10 mL af frisklavede vækstmediet.
- Kultur celler i vækstmediet indtil de når omkring 80% sammenløb, så fjern mediet og tilsættes 5 mL trypsin pr. flaske. For at sikre ordentlig celle løsrivelse fra bunden af kolben, opretholde trypsin løsning i kontakt med cellerne i 5 min ved 37 ° C.
- Der tilsættes 5 mL af vækstmediet pr. flaske og indsamle cellerne i et centrifugeglas. Der centrifugeres celler på 470 x g i 5 min. Fjern supernatanten og celle resuspenderes i 10 mL af vækstmediet. Bestemme koncentrationen af celler ved hjælp af en hemocytometer.
- Overføre substrater for at nå plader ikke behandlet for vævskultur (ikke-tilhænger).
- Seed celler på substrater med en tæthed på 4.000 celler/cm2 i vækstmediet og inkuberes dem i 4,5 timer ved 37 ° C og 10% CO2 atmosfære.
-
Chondrogenic induktion af MSC'er.
- Kultur menneskelige MSCs fra tidlig passager (< 5) ved 37 ° C og 4,6% CO2 atmosfære i MSC vækstmediet. T75 kolber for en total såning af 500.000 celler pr. flaske i 10 mL af vækstmediet er anbefalet.
- Ændre medium hver 3 dage (som beskrevet i 5.1.2).
- Trypsinize celler, før 80% sammenløbet er nået, og der centrifugeres og resuspend dem i MSC vækstmediet (som beskrevet i 5.1.3). Bestemme koncentrationen af celler ved hjælp af en hemocytometer.
- Centrifugeres cellerne igen og resuspend dem i 10 mL af chondrogenesis-inducerende medium.
- Overføre substraterne fra plader til nye godt plader ikke behandlet for vævskultur (ikke-tilhænger). Seed celler på substrater med en tæthed på 3.000 celler/cm2.
- Ændre chondrogenic medium hver 3 dage (som beskrevet i 5.1.2).
6. celle fiksering og immunfarvning
Bemærk: Følgende trin kan udføres i ikke-sterile forhold.
- Fjern mediet, og cellerne vaskes forsigtigt med PBS. Løse dem ved at tilføje en 10% formalin løsning i 20 min. på RT.
- Fjerne formalin og cellerne vaskes med PBS.
- Blokere gratis aldehyd grupper ved at tilføje en 50 mM løsning af ammoniumklorid (NH4Cl) i PBS. Forlade cellerne i 20 min. på RT. fjerne NH4Cl løsning og cellerne vaskes med PBS.
Bemærk: Protokollen kan pause her. Opbevare prøver i PBS ved 4 ° C. - Fjern PBS og permeabilize celler ved at tilføje en 0,1% opløsning af saponin i den blokerende løsning (1% albumin i PBS) i 10 min på RT. Wash celler med PBS og overføre prøver til en ny godt plade.
- Inkuber celler med en opløsning af primære antistoffer i den blokerende løsning (tabel 3) i 1 time på RT. Derefter fjerne den primære antistof løsning og cellerne vaskes med PBS.
- Inkuber celler med sekundære antistoffer i den blokerende løsning (tabel 3) i 1 time på RT.
Bemærk: Undgå lys eksponering. - Sekundær antistof-opløsning og vaske cellerne med PBS og tør.
Bemærk: Protokollen kan pause her. Opbevare prøverne i PBS ved 4 ° C i mørke. - Prøve montering til mikroskop observation: ved hjælp af en diamant-tip cutter, skåret coverslips i 1,25 cm x 1,25 cm. anvende 50 µL mikroskopi montering medium på prøverne og dække dem forsigtigt med den cut coverslips.
- Overføre prøverne til en bekvem modtager, dække det med aluminiumfolie og opbevares i mørke ved 4 ° C indtil observation.
7. celle billedbehandling og analyse af Data
Bemærk: For uigennemsigtig Au(111) og tyk microslide-baserede substrater, en opretstående mikroskop skal anvendes.
-
Fibroblast vedhæftning eksperiment.
- Brug et epifluorescensmikroskop udstyret med et digitalt kamera og lav (dvs. 10 X) og høj (dvs. 40 X) forstørrelse mål. Udføre målingerne i air.
- Prøven anbringes på scenen og billede cellekerner med 10 X målet ved hjælp af en ultraviolet excitation, longpass emission filter til at visualisere Hoechst/DAPI pletten.
- Billede celle cytoskelettet og fokale sammenvoksninger (FAs) med 40 X målsætningen, at vælge filteret mikroskop, der matcher de tilsvarende antistof fluorokrom specifikationer.
- For FA kvantificeringen, skal du bruge en billedbehandling software til at konvertere billeder til 8-bit-filer. Fjerne de baggrund og konvertere billeder til et binært tal ved at fastsætte en tærskel. Beregne mindst 30 billeder pr. sample og overveje FAs fra 1 µm2 for beregningen.
-
Chondrogenic induktion af MSC'er.
- Billede celle kondensater på de indledende stadier af chondrogenic induktion (< 5 dage) med en opretstående epifluorescensmikroskop udstyret med et digitalt kamera og et lavt (dvs. 10 X) forstørrelse mål. Brug ultraviolet excitation og longpass emission filter til at visualisere Hoechst/DAPI pletten.
- Til måling af området kondensat, bruge en billedbehandling software, konvertere billeder til 8-bit-filer, fjerne baggrunden og vælg en tærskel, der fremhæver den samlede kontur. Beregne område af partikler.
- Billede immunostained prøver for FAs, cytoskeleton actin fibre og brusk-specifikke kollagen type II alpha 1 (COL2A1) med en opretstående Konfokal mikroskop ved høj forstørrelse (dvs. 40-60 X). Indsamle sektioner på en repræsentativ interval (dvs. 0,5 – 1 µm).
- For at behandle stakken, bruge en billedbehandling software. Konvertere billeder til 8-bit-filer, fjerne baggrunden og gøre dem binære ved at fastsætte en tærskel. Behandle et minimum af tre celle kondensater pr. betingelse af tre uafhængige prøver.
- Kvantificere den FA protein farvede områder fra de basale zone af celle kondensater og udtrykke dem som den tilsvarende andel af areal divideret med antallet af cellekerner i billedet.
- For at måle COL2A1 farvning, bruge Konfokal z-fremskrivninger og kvantificering af summen af de forventede område (maksimal COL2A1 areal pr. prøve). Normalisere området værdien opnået mod området af den tilsvarende kondensat.
8. kvantitative Reverse transkription-polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) analyse
Bemærk: For at forhindre RNase forurening, bruge engangs, sterile plastik ware og bære engangshandsker mens håndtering af reagenser og RNA. Altid bruge ordentlig mikrobiologiske aseptisk teknik og bruge en passende dekontaminering løsning til at fjerne RNase forurening fra arbejdsflader og ikke-disponible varer såsom centrifuger og pipetter.
- Isolere total RNA og male det i en RNA Disrupters. Behandle RNA prøver med DNase og konvertere dem til cDNA ved hjælp af en cDNA syntese kit.
- Gennemføre qRT-PCR ved hjælp af primere for transkriptionsfaktor SOX9. Beta-2-mikroglobulin (B2M) og ribosomale protein L13a (RPL13a) kan bruges som husholdning gener.
- Beregne udtryk niveauer og normalisere dem mod den negative kontrol (PLLA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi præsenterer en nanopatterning metode, der giver mulighed for overflade klæbeevne behandles på nanoskala (figur 1). Den kemiske struktur af M.H.T.-Cys-D1 er vist i figur 1A. Dendrimers var mønstret på elektrisk ledende Au(111) overflader for høj opløsning STM karakterisering. Lav dendrimer koncentrationer i løsning (op til 10-5% w/w) gengives isolerede dendrimers af 4-5 nm i diameter (figur 1B), mens stærkt pakket dendrimer aggregater dannet ved højere koncentrationer (figur 1 c). AFM overflade karakterisering (Tal 1 D-G, øverste række) viste, at overfladen fordelingen af M.H.T.-Cys-D1 dendrimers kan justeres som funktion af koncentrationen af indledende dendrimer i løsning. På sandsynlighed kontur kort i dminresulterer dette i forskellige lokale M.H.T. nanoskala tætheder på overfladen (Tal 1 D-G, nederste række).
I celle kultur eksperimenter, celle-membran receptor integriner omkring 10 nm i diameter anerkendt M.H.T. sekvens i dendrimers periferien. Selv om otte eksemplarer af denne sekvens blev leveret pr. dendrimer, kommunikerede kun en dendrimer pr. integrin på grund af sin størrelse (4-5 nm måles af STM; Figur 1B). Det vil sige, fastsat hver dendrimer et enkelt websted integrin bindende, dermed tillader en direkte sammenhæng fra dendrimer distribution (som ses i AFM billeder) og M.H.T. distribution tilgængelig for celle vedhæftning. Desuden blev ikke fundet nogen betydelige variationer i CA værdier opnået for de forskellige nanopattern konfigurationer, der kan påvirke celle vedhæftning29. Disse egenskaber gør dendrimer nanopatterns på biokompatible overflader egnede substrater hvorigennem modulere og studere cellen adfærd.
Celle vedhæftning til nanopatterned Au(111) blev testet med fibroblaster inden for de første 24 timer af kulturen (figur 2A) og med MSCs på nanopatterned PLLA (figur 2B). I begge tilfælde, procentdelen af området farvet for FA protein paxillin (pax) øges gradvis med dendrimer koncentration, som gjorde lokale M.H.T. overflade tæthed (procentdelen af nanopatterned område med dmin tærsklen på 70-nm for effektiv celle vedhæftning; Tabel 4). For en indledende dendrimer koncentration på 10-2% w/w og positive kontroller, procentdelen af området farvet for pax per celle faldt og sammenhængen med procentdelen af nanopatterned område med dmin < 70 nm var tabt.
Procentdelen af arealet besat af dmin < 70 nm (fig. 1 d-G nederste række og tabel 4) er en god indikation af lokale M.H.T. overflade tæthed for nanopatterns op til 10-5% w/w indledende dendrimer koncentration, men ikke af dem op til 10-2% w/w, på grund af dendrimer sammenlægning. Sammenlægning produceret særdeles heterogene prøver i form af ligand distribution, med kun en lille procentdel af overfladen med dmin værdier tærsklen 70-nm (fig. 1 d nederste række og tabel 4). XPS resultater viste, at disse overflader præsentere en global M.H.T. tæthed svarende til 10-5% w/w-afledt nanopatterns28. Denne observation angiver at maksimal M.H.T. tæthed blev opnået i regioner med dendrimer aggregater og at procentdelen af arealet besat af dmin < 70 nm er ikke repræsentative for den lokale M.H.T. overflade tæthed i denne sag.
Den iagttagelse, at positive kontroller (homogene belægninger) med maksimale lokale M.H.T. overflade tæthed ikke udviste den forventede stigning i celle vedhæftning kan tilskrives en sterisk hindring effekt. Disse resultater viser, at i forhold til de tilsvarende homogene overflader almindeligt anvendt i cellekultur, M.H.T. nanopatterns opretholde celle vedhæftning mere effektivt. Denne konstatering således understreger relevansen af lokale ligand tæthed.
Samspillet med det omgivende miljø i morfogenese udløse hændelserne første celle differentiering og udbrede dem indtil indførelsen af de endelige komplekse strukturer. For at evaluere virkningerne af dendrimer nanopatterns på celle vedhæftning og differentiering, brugte vi chondrogenic induktion af MSCs som en model. Under chondrogenesis er der aktive matrix remodeling, som en lærerig rolle i ledelsen af celler gennem de forskellige stadier af brusk dannelse.
MSC'er undergik chondrogenesis på nanopatterns (figur 3). Chondrogenic differentiering begynder med en celle kondens skridt, som involverer celle rekruttering til at danne tætte kondensater, etablering af celle-til-celle kommunikation og samtidige ændringer i celle morfologi33. Figur 3A , viser, at celle kondens opstod i alle substrater og at kondensater steg i området med stigende dendrimer koncentrationer op til 2,5 x 10-8% w/w området kondensat faldt derefter igen til en dendrimer koncentration af 10-2% w/w og for den positive kontrol. Celle kondens trin i chondrogenesis sker gennem aktive celle bevægelse og ikke gennem en stigning i celle spredning34. Denne celle bevægelse er begunstiget af fleksible vedhæftning med underlaget: stabil sammenvoksninger bør blive dannet til at tillade trækkraft styrker til at flytte cellen kroppen, og på samme tid, bør disse sammenvoksninger svag nok til at tillade celle frigivelse fra bærematerialet under bevægelse. Celle kondens er begunstiget af en stigning i lokale M.H.T. overflade tæthed op til 2.5x10-8% w/w-afledt nanopatterns, med en god balance mellem celle vedhæftning og celle bevægelse. For 10-2 og den positive kontrol var den lokale RDG overflade tæthed for høj, hvilket forringer hændelsen kondens.
Chondrogenic differentiering provenuet fra prechondrogenic kondensater: celler i kondensater bliver mere afrundet og begynde syntesen af brusk specifikke markører, såsom ECM protein COL2A1 og transskription faktor SOX933, 34 , 35. i overensstemmelse hermed, substrater med en mellemliggende klæbeevne, favorisere dannelsen af celle kondensater, viste højere COL2A1 farvning (figur 3B) og højere niveauer af SOX9 mRNA udtryk (figur 3 c).
Vores resultater fremhæve indflydelse af celle-celle matrix interaktioner i de tidlige stadier af chondrogenic differentiering. Sådanne interaktioner kan løses nemt gennem dendrimer-baseret nanopatterns.
| Trin | Tid (s) | Hastighed (rpm) | Acceleration (rpm/s) |
| 1 | 5 | 500 | 300 |
| 2 | 30 | 3.000 | 1.500 |
Tabel 1: Spinner programtrin anvendes til at belægge glas dias med opløsningen forberedt PLLA. Et første skridt i homogenisering blev brugt på 500 omdrejninger i minuttet med en acceleration på 300 rpm/s til 5 s. efterfulgt af en sidste trin på 3.000 omdr. / min. med en acceleration på 1.500 rpm/s for 30 s.
| Løsning | M.H.T.-Cys-D1 (mg/mL) | M.H.T.-Cys-D1 (mg) | MQ vand (µL) |
| A | 0,77 | 5 | 6,494 |
| M.H.T.-Cys-D1 (% w/w) | Løsning en (µL) | ||
| B | 10-2 | 779 | 5,220 |
| C | 10-5 | 0,78 | 6.000 |
| Løsning C (µL) | |||
| D | 2,5 x 10-8 | 15,0 | 5,985 |
| E | 10-8 | 6.0 | 5,994 |
| F | 4 x 10-9 | 2.4 | 5,998 |
Tabel 2: Detaljer om forberedelsen af de M.H.T.-Cys-D1 løsninger anvendes. En stamopløsning af M.H.T.-Cys-D1 dendrimers blev udarbejdet i en endelig koncentration på 0,77 mg/mL (opløsning A), hvorfra løsninger B og C blev udarbejdet på 10-2 og 10-5% w/w koncentrationer. Løsning C med en 10-5% w/w koncentration af M.H.T.-Cys-D1 dendrimer blev brugt til at udarbejde løsninger D, E og F i endelige koncentrationer på 2,5 x 10-8, 10-8 og 4 x 10-9%w/w, henholdsvis.
| Navn | Volumen (µL) | Blokerende buffer (mL) | |
| Primære mix | Kanin mAb til pax | 65 | 12.870 |
| Musen mAb til COL2A1 | 32,5 | ||
| Sekundære mix | Alexa Fluor 488 ged anti-mus | 13 | 12.961 |
| Alexa Fluor 568 ged anti-kanin | 13 | ||
| Hoechst løsning | 13 |
Tabel 3: antistof løsning forberedelse. Primære antistof blandingen indeholdt monoklonalt antistof mod pax produceret i kanin fortyndet 1:200 i den blokerende løsning med monoklonalt antistof mod COL2A1 produceret i mouse fortyndes 1: 400 i den blokerende løsning. Sekundær antistof blandingen indeholdt cellekerner pletten Hoechst og de sekundære antistoffer produceret i ged mod mus og kanin henholdsvis (mærket med Alexa Fluor 488 og 568 fluorophores, henholdsvis).
Figur 1 : M.H.T.-Cys-D1 dendrimer nanopatterning for kontrolelementet nanoskala af lokale M.H.T. overflade tæthed. (A) M.H.T.-Cys-D1 dendrimer struktur, der indeholder op til otte eksemplarer af celle klæbende M.H.T. peptid. Repræsentant STM billeder (bias = 200 mV, setpunkt = 0,5 nA) af M.H.T.-Cys-D1 nanopatterns på Au(111) fra en indledende vandig opløsning af 10-8% w/w (skalalinjen = 3 nm, B) og den tilsvarende højde-afstand profil opnået på den stiplede region anført i (B)og (C) af 10-2% w/w viser dendrimer sammenlægning (skalalinjen = 20 nm). (D-G) Repræsentant AFM billeder af M.H.T.-Cys-D1 nanopatterns på PLLA fremstillet af de tilsvarende dendrimer vandige opløsninger af 10-2%, 2,5 x 10-8%, 10-8%og 4 x 10-9% w/w, henholdsvis (skalalinjen = 1 µm). Den tilsvarende interparticle minimumsafstand (dmin) sandsynlighed Kurvekort er vist nedenstående hver AFM billede, med høj densitet M.H.T. regioner vist i mørkerødt (dmin < 70 nm). Dendrimers og dendrimer aggregater er afbildet i sort for klarhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Celle vedhæftning på M.H.T.-Cys-D1 nanopatterns. Plot af procentdel af farvet for FA protein pax per celle for celler i kontakt med underlaget (venstre akse) med indledende dendrimer koncentration. Værdier sammenlignes med den lokale M.H.T. overflade tæthed (procentdel af areal i den nanopatterns, der indeholder dmin værdier under tærsklen 70 nm) (højre akse) med 100 og 0 procenter tildeles positivt (+ kontrol) og negative (- kontrol) styrer, henholdsvis. (A) Fibroblast vedhæftning på dendrimer nanopatterns på Au(111) efter 4,5 h af kultur. (B) MSC vedhæftning på dendrimer nanopatterns på PLLA evalueres på dag 1 af chondrogenic induktion. Værdierne angives som middelværdi med standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| M.H.T.-Cys-D1 (% w/w) | Område (< dmin = 70 nm) (%) på Au(111) | Område (< dmin = 70 nm) (%) på PLLA |
| 10-2 | 5 ± 1 | 2 ± 2 |
| 10-5 | 97 ± 2 | |
| 2, 5 x 10-8 | 65 ± 11 | 90 ± 2 |
| 10-8 | 25 ± 16 | 45 ± 7 |
| 4 x 10-9 | 18 ± 11 |
Tabel 4: procentdel af område med d min værdier under 70 nm opnået for M.H.T.-Cys-D1 dendrimer deposition på Au(111) og på PLLA overflader som en funktion af de oprindelige dendrimer koncentrationerne anvendes.
Figur 3 : Chondrogenic differentiering af MSCs på M.H.T.-Cys-D1 nanopatterns. (A) kondensering af MSCs kulturperler på M.H.T.-Cys-D1 nanopatterns på PLLA efter 5 dage af chondrogenic induktion. Repræsentant epifluorescensmikroskop billeder af farvede cellekerner (Hoechst; Skalalinjen = 300 µm; øverste række) og plot af området i celle kondensater (nederste række) opnået på M.H.T.-Cys-D1 nanopatterns fra forskellige indledende dendrimer koncentrationer. Differentiering provenuet fra celle kondens trin med udtryk for bestemt chondrogenic mærker: (B) procentdel af arealet af COL2A1 farvning normaliseret med området i celle kondensat fra de tilsvarende Konfokal z-fremskrivninger fremstillet efter 5 dage af chondrogenic induktion. (C) Relative SOX9 mRNA udtryk (mod negativ kontrol) efter 3 dage af chondrogenic induktion. Værdierne angives som middelværdi med standardafvigelse (B) og (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under udviklingen af den beskrevne protokol betragtes som en række vigtige skridt. Først henviser til nanopattern karakterisering med scanning probe mikroskopi-teknikker. For at visualisere nanopatterns, overfladen hvor mønstret er produceret skal have en ruhed værdi ligger under den gennemsnitlige diameter af dendrimers, som er omkring 4-5 nm målt af STM (figur 1B). Det bør også tages i konto, høj opløsning STM imaging er begrænset til ledende substrater, i dette tilfælde Au(111). En ophævelse af polymer fra hjørnerne af diaset efter spin-coating kan afhjælpes ved hjælp af biokompatible lim.
Dendrimer nanopatterning er et processtyret hvorigennem at opnå lokale celle klæbeevne på nanoplan. Baseret på den samlesæt af dendrimers på overfladen af adsorption, denne teknik ikke kræver nogen kompleks nanopatterning udstyr, dermed kontrasterende med tidligere beskrevet litografi-baserede metoder36,37, 38. Dendrimer nanopatterning nemt kan skaleres til store arealer og er fuldt kompatibel med celle kultur protokoller.
Metoden dendrimer nanopatterning beskrevet her kan finde fremtidige anvendelser i regenerativ medicin. Kontrol udøves af dendrimer nanopatterning på celle klæbeevne gør denne teknik egner sig til konditionering af biomaterialer forud for implantation, dermed at lette deres integration i værten væv. Desuden, den lethed, med hvilken dendrimer perifer fraspaltning kan ændres gør dendrimer nanopatterning egnet til andre ligander, at øve koncentration-afhængig aktivitet på celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender Oriol Font-Bach og Albert G. Castaño for deres hjælp i dmin kvantificering. De anerkender også den avancerede digitale mikroskopi enhed ved Institut for forskning i biomedicin (IRB Barcelona) at lade forfattere optage video i deres lokaler. Dette arbejde blev støttet af netværk Biomedical Research Center (CIBER), Spanien. CIBER er et initiativ finansieret af det VI nationale f & u & jeg planen 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Program, CIBER handlinger, og Instituto de Salud Carlos III, med støtte fra den europæiske fond for Regionaludvikling. Dette arbejde er blevet støttet af Kommissionen for universiteter og forskning på Institut for Innovation, universiteter og Enterprise af Generalitat de Catalunya (2014 SGR 1442). Det var også finansieret af projekter OLIGOCODES (nr. MAT2012-38573-C02) og CTQ2013-41339-Pedersen, tildelt af det spanske ministerium for økonomi og konkurrenceevne, desuden til INTERREG V-A Spanien-Portugal 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E). C.R.P. anerkender finansiel støtte fra den spanske Ministeriet for økonomi og konkurrenceevne grant (nr. IFI15/00151).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold (111) on mica. 1.4x1.1 cm | Spi Supplies | 466PS-AB | |
| Glass micro slides, plain | Corning | 2947-75x25 | |
| Deionized water | Millipore | 18MΩ cm | |
| Ethanol 96% | PanReac | 131085.1212 | |
| L-Lactide/DL-Lactide copolymer | Corbion | 95/05 molar ratio | |
| 1,4 - dioxane | Sigma-Aldrich | 296309-1L | |
| Silicone oil, high temperature | Acros Organics | 174665000 | |
| Spinner | Laurell | WS-650MZ-23NPP/Lite | |
| Tissue culture laminar flow hood | Telstar | Bio II Advance | Class II biological safety cabinet |
| Filter unit | Millex-GP | SLGP033RB | 0.22 µm |
| Syringe 10 mL | Discardit | 309110 | |
| Atomic Force microscope | Veeco Instruments | Dimension 3000 AFM instrument | |
| Silicon AFM probes | Budget Sensors | Tap300AI-G | Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m |
| Scanning tunneling microscope | Molecular Imaging | PicoSPM microscope | |
| Pt0.8:Ir0.2 wire | Advent | PT671012 | Diameter 0.25 mm |
| WSxM 4.0 software | Nanotec electronica | ||
| Optical contact angle (CA) system | Dataphysics | ||
| SCA20 software | Dataphysics | ||
| X-ray photoelectron spectrometer | Physical Electronics | Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | 1.0 mL solution |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Gibco | 21600-10 | Powder |
| Mouse embryo fibroblasts | ATCC | ATCC CRL-1658 | NIH/3T3 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose | Gibco | 11960044 | liquid high glucose, no glutamine, 500 mL |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | 500 mL |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 200 mM (100X) |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360039 | 100 mL |
| T75 culture flasks | Nunclon | 156499 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25200072 | 0,25% EDTA |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik | Z 206 A | |
| Non-tissue culture treated plate, 12 well | Falcon | 351143 | Non-adherent |
| Adipose-derived hMSCs | ATCC | ATCC PCS-500-011 | Cell vial 1 mL |
| MSC basal medium | ATCC | ATCC PCS-500-030 | |
| MSC growth kit | ATCC | ATCC PCS-500-040 | Low serum |
| Chondrocyte differentiation tool | ATCC | ATCC PCS-500-051 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT5011-15ML | neutral buffered, 10% |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-50G | |
| Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody | Abcam | ab32084 | Diluted 1:200 |
| Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain | Acris Antibodies | AM00212PU-N | Diluted: 1:400 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A10667 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11036 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 10ML | 10 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Cover glass 24x24 mm | Deltalab | D102424 | |
| Fluoromount | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse E1000 upright microscope | with a CCD camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | Leica SPE Upright Confocal Microscope | |
| ImageJ 1.50g freeware | http://imgej.nih.gov/ij | ||
| MATLAB software | The MATHWORKS, Inc. | ||
| OriginPro 8.5 software | OriginLab Coorporation |
References
- Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148 (3), 268-278 (2004).
- Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), 2243-2254 (2007).
- Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biol. 27 (5), 451-461 (2008).
- Christman, K. L., Enriquez-Rios, V. D., Maynard, H. D. Nanopatterning proteins and peptides. Soft Matter. 2, 928-939 (2006).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Arnold, M., et al. Activation of integrin function by nanopatterned adhesive interfaces. ChemPhysChem. 5 (3), 383-388 (2004).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Lateral spacing of integrin ligands influences cell spreading and focal adhesion assembly. Eur. J. Cell. Biol. 85 (3-4), 219-224 (2006).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys. J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Arnold, M., et al. Cell interactions with hierarchically structured nano-patterned adhesive surfaces. Soft Matter. 5 (1), 72-77 (2009).
- Malmström, J., et al. Large area protein patterning reveals nanoscale control of focal adhesion development. Nano Lett. 10 (2), 686-694 (2010).
- Deeg, J. A., et al. Impact of local versus global ligand density on cellular adhesion. Nano Lett. 11 (4), 1469-1476 (2011).
- Medda, R., et al. Investigation of early cell–surface interactions of human mesenchymal stem cells on nanopatterned β-type titanium-niobium alloy surfaces. Interface Focus. 4, 20130046 (2014).
- Wang, X., et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials. 34 (12), 2865-2874 (2013).
- Wang, X., Ye, K., Li, Z. H., Yan, C., Ding, J. D. Adhesion, proliferation, and differentiation of mesenchymal stem cells on RGD nanopatterns of varied nanospacings. Organogenesis. 9 (4), 280-286 (2013).
- Wang, X., Li, S. Y., Yan, C., Liu, P., Ding, J. D. Fabrication of RGD micro/nanopattern and corresponding study of stem cell differentiation. Nano Lett. 15 (3), 1457-1467 (2015).
- Li, Z. H., et al. Effects of RGD nanospacing on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J. Mater. Chem. B. 3 (12), 5197-5209 (2015).
- Stephanopoulos, N., et al. Bioactive DNA-peptide nanotubes enhance the differentiation of neural stem cells into neurons. Nano Lett. 15 (1), 603-609 (2015).
- Rolland, O., Turrin, C. O., Caminade, A. M., Majoral, J. P. Dendrimers and nanomedicine: Multivalency in action. New J. Chem. 33, 1809-1824 (2009).
- Saovapakhiran, A., D’Emanuele, A., Attwood, D., Penny, J. Surface modification of PAMAM dendrimers modulates the mechanism of cellular internalization. Bioconjug. Chem. 20 (4), 693-701 (2009).
- Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral functionalization of dendrimers regulates internalization and intracellular trafficking in living cells. Bioconjug. Chem. 23 (5), 1059-1068 (2012).
- Mikhail, A. S., Jones, K. S., Sheardown, H. Dendrimer grafted cell adhesion peptide-modified PDMS. Biotechnol. Prog. 24 (4), 938-944 (2008).
- Kino-oka, M., Kim, J., Kurisaka, K., Kim, M. H. Preferential growth of skeletal myoblasts and fibroblasts in co-culture on a dendrimer-immobilized surface. J. Biosci. Bioeng. 115 (1), 96 (2013).
- Kim, M. H., et al. Morphological regulation and aggregate formation of rabbit chondrocytes on dendrimer immobilized surfaces with D-glucose display. J. Biosci. Bioeng. 107 (2), 196-205 (2009).
- Lomba, M., et al. Cell adhesion on surface patterns generated by the photocrosslinking of hyperbranched polyesters with a trisdiazonium salt. React. Funct. Polym. 73 (3), 499-507 (2013).
- Maheshwari, G., Brown, G., Lauffenburger, D. A., Wells, A., Griffith, L. G. Cell adhesion and motility depend on nanoscale RGD clustering. J. Cell Sci. 113 (Pt 10), 1677-1686 (2000).
- Kim, M. H., Kino-oka, M., Kawase, M., Yagi, K., Taya, M. Synergistic effect of D-glucose and epidermal growth factor display on dynamic behaviors of human epithelial cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (5), 428-431 (2007).
- Pericet-Camara, R., Cahill, B. P., Papastavrou, G., Borkovec, M. Nano-patterning of solid substrates by adsorbed dendrimers. Chem. Commun. 3, 266-268 (2007).
- Lagunas, A., et al. Large-scale dendrimer-based uneven nanopatterns for the study of local arginine–glycine–aspartic acid (RGD) density effects on cell adhesion. Nano Res. 7 (3), 399-409 (2014).
- Lagunas, A., et al. Tailoring RGD local surface density at the nanoscale toward adult stem cell chondrogenic commitment. Nano Res. , (2017).
- Prats-Alfonso, E., et al. Effective and Versatile Strategy for the Total Solid-Phase Synthesis of Alkanethiols for Biological Applications. Eur. J. Org. Chem. 2013 (7), 1233-1239 (2013).
- Zhu, Y. B., Gao, C. Y., Liu, X. Y., He, T., Shen, J. C. Immobilization of biomacromolecules onto aminolyzed poly(L-lactic acid) toward acceleration of endothelium regeneration. Tissue Eng. 10 (1-2), 53-61 (2004).
- Güell, A., Díez-Pérez, I., Gorostiza, P., Sanz, F. Preparation of reliable probes for electrochemical tunneling spectroscopy. Anal. Chem. 76 (17), 5218-5222 (2004).
- Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res. C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
- De Lise, A. M., Fisher, L., Tuan, R. S. Cellular interactions and signaling in cartilage development. Osteoarthritis Cartilage. 8 (5), 309-334 (2000).
- Kosher, R. A., Kulyk, W. M., Gay, S. W. Collagen gene expression during limb cartilage differentiation. J. Cell Biol. 102 (4), 1151-1156 (1986).
- Biebricher, A., Paul, A., Tinnefeld, P., Golzhauser, A., Sauer, M. Controlled three-dimensional immobilization of biomolecules on chemically patterned surfaces. J. Biotechnol. 112 (1-2), 97-107 (2004).
- Tinazli, A., Piehler, J., Beuttler, M., Guckenberger, R., Tampé, R. Native protein nanolithography that can write, read and erase. Nat. Nanotechnol. 2, 220-225 (2007).
- Oberhansl, S., et al. Facile Modification of Silica Substrates Provides a Platform for Direct-Writing Surface Click Chemistry. Small. 8 (4), 541-545 (2012).
