على أساس ديندريمير نانوباتيرنس متفاوتة إلى محلياً مراقبة سطح أدهيسيفينيس: أسلوب لتوجيه التمايز تشوندروجينيك
Summary
أسلوب للحصول على نانوباتيرنس متفاوتة على أساس ديندريمير التي تسمح بمراقبة النانو المحلية ارجينين-جليكاين-الأسبارتيك حمض (إدارات) السطحية الكثافة الموصوفة وتطبيقها لدراسة الخلية التمايز الالتصاق وتشوندروجينيك.
Abstract
الالتصاق الخلوي والتمايز مرهون بالتصرف النانو عناصر المصفوفة خارج الخلية (ECM)، مع تركيزات المحلي أثرا كبيرا. هنا نقدم طريقة للحصول على نانوباتيرنس متفاوتة على نطاق واسع من حمض ارجينين-جليكاين-الأسبارتيك (إدارات)-ديندريميرس فونكتيوناليزيد التي تسمح بمراقبة النانو إدارات محلية السطحية الكثافة. نانوباتيرنس هي التي شكلتها الامتزاز السطحي من ديندريميرس من الحلول بتركيزات مختلفة الأولى وتتميز بالمياه زاوية الاتصال (CA)، مطيافية الأشعة السينية النانومترية (XPS)، ومسح التحقيق تقنيات مجهرية مثل الميكروسكوب النفقي المسح (STM) ومجهر القوة الذرية (AFM). يتم قياس كثافة السطحية المحلية إدارات استخدام صور فؤاد عن طريق خرائط كِفافية الاحتمالية للحد الأدنى من المسافات إينتيربارتيكلي وثم يرتبط باستجابة التصاق الخلايا وتمايزها. الأسلوب نانوباتيرنينج المقدمة هنا هو إجراء بسيط يمكن الارتقاء بطريقة مباشرة للمساحات الكبيرة. هكذا هو متوافقة تماما مع خلية ثقافة بروتوكولات ويمكن تطبيقها على يغاندس الأخرى التي تعتمد على تركيز تأثيراً على الخلايا.
Introduction
هنا يصف لنا إجراء نانوباتيرنينج على أساس ديندريمير بسيطة ومرنة للحصول على أسطح ثقافة الخلية التي تتيح التحكم في أدهيسيفينيس المحلية في النانو. سجلت تفاصيل النانو للمنظمة إدارة المحتوى في المؤسسة،1،2،3 ونانوباتيرنينج خلية التصاق الأسطح قدمت رؤى عميقة في متطلبات الخلوية المتصلة بانضمام4، 5. كشفت تجارب ميسيلار نانوباتيرنس على أساس الطباعة الحجرية باستخدام قيمة عتبة لحوالي 70 نانومتر لإدارات الببتيد نانوسباسينج، التصاق الخلية يتأخر كثيرا فوق هذه القيمة6،،من78 ،9. وأبرزت هذه الدراسات أيضا تأثير أكبر من المحلية من كثافة يجند العالمية على خلية التصاق9،،من1011.
خلال morphogenesis، تؤدي التفاعلات الخلية مع البيئة المحيطة أحداث التفرقة الأولى، التي تستمر حتى تم تشكيل هياكل الأنسجة المعقدة النهائية. وفي هذا الإطار، استخدمت الأسطح نانوباتيرنيد للتصدي لتأثير التفاعلات سطح الخلية الأولى في morphogenesis. نانوباتيرنس إدارات القائم على الطباعة الحجرية مع تباعد أفقي من 68 سبائك نانومتر في بيتا من نوع تي-40Nb تساعد على الحفاظ على النمط الظاهري غير متمايزة من الخلايا الجذعية غير ارتكب12، بينما نانوسباسينجس إدارات من بين 95 و 150 نانومتر تعزيز التفريق بين الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) نحو أديبوجينيك/أوستيوجينيك13،،من1415 وتشوندروجينيك الأقدار16. أيضا، أظهرت الذاتي تجميع الجزيئات تعديل مع مكونات إشارات مباشرة التصاق الخلايا والتمايز بتقديم لائحة معمارية نانوية العظة مما يشير إلى17. وفي هذا الصدد، ترسب ديندريميرس مع التفاعل خلية مويتيس في هذه المجال الخارجي18،،من1920 على الأسطح قد استخدمت لدراسة الخلية التصاق21،22، مورفولوجيا23،24، و25،أحداث الهجرة26. ومع ذلك، عدم وجود توصيف السطحية في هذه الدراسات يجعل من الصعب إقامة أي علاقة بين التكوين السطحي dendrimer واستجابة الخلايا.
يمكن الحصول على نانوباتيرنس ديندريمير مع النظام مثل السائل والتباعد المعرفة عند ديندريميرس الجسميات على أسطح مشحونة بالمنخفض من الحلول مع انخفاض القوة الأيونية. 27 على أساس هذه الخاصية، نقدم هنا طريقة للحصول على نانوباتيرنس متفاوتة على نطاق واسع من إدارات فونكتيوناليزيد ديندريميرس على أسطح مشحونة المنخفضة التي تسمح بمراقبة النانو الكثافة السطحية إدارات محلية. زاوية الاتصال المياه (CA)، مطيافية الأشعة السينية النانومترية (XPS) والمسح المسبار المجهري تقنيات (تحقيق الاستقرار والانتساب وفؤاد نانوباتيرنس) إظهار أنه يمكن ضبط كثافات يجند المحلية تعديل تركيز ديندريمير الأولى في حل. الكثافة السطحية إدارات محلية كمياً من صور فؤاد بخرائط كِفافية الاحتمالية للحد الأدنى من المسافات إينتيربارتيكلي وثم يرتبط مع تجارب الخلية. بالمقارنة مع سائر تقنيات نانوباتيرنينج4، نانوباتيرنينج على أساس ديندريمير واضحة ويمكن الارتقاء بسهولة إلى المناطق السطحية الكبيرة، وبالتالي يجري متوافقة تماما مع تطبيقات ثقافة الخلية. نانوباتيرنس تستخدم كركائز النشطة بيولوجيا لتقييم تأثير الكثافة السطحية إدارات محلية في خلية التصاق28 وتعريفهم تشوندروجينيك الكبار البشرية MSCs29. إظهار النتائج التي توصلنا إليها أن نانوباتيرنس على أساس ديندريمير إدارات الحفاظ على نمو الخلايا وأن تعززه التصاق الخلايا عالية الكثافة السطحية إدارات محلية. في تجارب التمايز، يفضل أدهيسيفينيس الوسيطة من الخلايا إلى ركائز MSC التكثيف والتمايز تشوندروجينيك المبكر. نظراً للسهولة مع ديندريمير التي يمكن تعديل الفئات الهامشية، الأسلوب الموصوفة هنا ويمكن تمديد لغيرها يغاندس إدارة المحتوى في المؤسسة التي تعتمد على تركيز تأثيراً على الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
أثناء تطوير البروتوكول وصف، ينبغي اتخاذ عدد من الخطوات الحاسمة. الأول يشير إلى توصيف نانوباتيرن مع المسبار المجهري تقنيات المسح. تصور نانوباتيرنس، يجب أن يكون السطح حيث يتم إنتاج الزخرفة قيمة خشونة أدناه القطر يعني من ديندريميرس، وحول 4-5 نانومتر مقاسا بتحقيق الاستقرار والانتساب (الش…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يعترف أوريول الخط-باخ وألبرت زاي كاستانيو للمساعدة في مددقيقة التحديد الكمي. وهي تعترف أيضا “وحدة الفحص المجهري رقمية متقدمة” في معهد للبحوث في الطب الحيوي (برشلونة مجلس الهجرة واللاجئين) للسماح للمؤلفين تسجيل الفيديو في أماكن عملهم. وأيد هذا العمل بالشبكات الطبية الحيوية البحوث مركز (سيبير)، إسبانيا. سيبير مبادرة تمولها R الوطني السادس & د & أنا خطة الفترة 2008-2011، Iniciativa إنجينيو 2010، تدعيم الإجراءات سيبير والبرنامج دي معهد الصحة كارلوس الثالث، بالدعم من “الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية”. تم دعم هذا العمل من خلال لجنة الجامعات والبحوث إدارة الابتكار، والجامعات، والمؤسسة من محافظة في كاتالونيا (2014 SGR 1442). وقد مولت أيضا مشاريع أوليجوكوديس (رقم MAT2012-38573-C02) و CTQ2013-41339-P، تمنحها وزارة الاقتصاد الإسبانية، والقدرة التنافسية، بالإضافة إلى ذلك إلى الأقاليمي فى إسبانيا والبرتغال عام 2014-2020 “بوكتيب” (0245_IBEROS_1_E). C.R.P. وتسلم الدعم المالي من المنحة الإسبانية وزارة الاقتصاد والقدرة التنافسية (رقم IFI15/00151).
Materials
| Gold (111) on mica. 1.4×1.1 cm | Spi Supplies | 466PS-AB | |
| Glass micro slides, plain | Corning | 2947-75×25 | |
| Deionized water | Millipore | 18MΩ cm | |
| Ethanol 96% | PanReac | 131085.1212 | |
| L-Lactide/DL-Lactide copolymer | Corbion | 95/05 molar ratio | |
| 1,4 – dioxane | Sigma-Aldrich | 296309-1L | |
| Silicone oil, high temperature | Acros Organics | 174665000 | |
| Spinner | Laurell | WS-650MZ-23NPP/Lite | |
| Tissue culture laminar flow hood | Telstar | Bio II Advance | Class II biological safety cabinet |
| Filter unit | Millex-GP | SLGP033RB | 0.22 µm |
| Syringe 10 mL | Discardit | 309110 | |
| Atomic Force microscope | Veeco Instruments | Dimension 3000 AFM instrument | |
| Silicon AFM probes | Budget Sensors | Tap300AI-G | Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m |
| Scanning tunneling microscope | Molecular Imaging | PicoSPM microscope | |
| Pt0.8:Ir0.2 wire | Advent | PT671012 | Diameter 0.25 mm |
| WSxM 4.0 software | Nanotec electronica | ||
| Optical contact angle (CA) system | Dataphysics | ||
| SCA20 software | Dataphysics | ||
| X-ray photoelectron spectrometer | Physical Electronics | Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | 1.0 mL solution |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Gibco | 21600-10 | Powder |
| Mouse embryo fibroblasts | ATCC | ATCC CRL-1658 | NIH/3T3 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose | Gibco | 11960044 | liquid high glucose, no glutamine, 500 mL |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | 500 mL |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 200 mM (100X) |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360039 | 100 mL |
| T75 culture flasks | Nunclon | 156499 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25200072 | 0,25% EDTA |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik | Z 206 A | |
| Non-tissue culture treated plate, 12 well | Falcon | 351143 | Non-adherent |
| Adipose-derived hMSCs | ATCC | ATCC PCS-500-011 | Cell vial 1 mL |
| MSC basal medium | ATCC | ATCC PCS-500-030 | |
| MSC growth kit | ATCC | ATCC PCS-500-040 | Low serum |
| Chondrocyte differentiation tool | ATCC | ATCC PCS-500-051 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT5011-15ML | neutral buffered, 10% |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-50G | |
| Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody | Abcam | ab32084 | Diluted 1:200 |
| Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain | Acris Antibodies | AM00212PU-N | Diluted: 1:400 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A10667 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11036 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 10ML | 10 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Cover glass 24×24 mm | Deltalab | D102424 | |
| Fluoromount | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse E1000 upright microscope | with a CCD camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | Leica SPE Upright Confocal Microscope | |
| ImageJ 1.50g freeware | http://imgej.nih.gov/ij | ||
| MATLAB software | The MATHWORKS, Inc. | ||
| OriginPro 8.5 software | OriginLab Coorporation |
References
- Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148 (3), 268-278 (2004).
- Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), 2243-2254 (2007).
- Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biol. 27 (5), 451-461 (2008).
- Christman, K. L., Enriquez-Rios, V. D., Maynard, H. D. Nanopatterning proteins and peptides. Soft Matter. 2, 928-939 (2006).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Arnold, M., et al. Activation of integrin function by nanopatterned adhesive interfaces. ChemPhysChem. 5 (3), 383-388 (2004).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Lateral spacing of integrin ligands influences cell spreading and focal adhesion assembly. Eur. J. Cell. Biol. 85 (3-4), 219-224 (2006).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys. J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Arnold, M., et al. Cell interactions with hierarchically structured nano-patterned adhesive surfaces. Soft Matter. 5 (1), 72-77 (2009).
- Malmström, J., et al. Large area protein patterning reveals nanoscale control of focal adhesion development. Nano Lett. 10 (2), 686-694 (2010).
- Deeg, J. A., et al. Impact of local versus global ligand density on cellular adhesion. Nano Lett. 11 (4), 1469-1476 (2011).
- Medda, R., et al. Investigation of early cell–surface interactions of human mesenchymal stem cells on nanopatterned β-type titanium-niobium alloy surfaces. Interface Focus. 4, 20130046 (2014).
- Wang, X., et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials. 34 (12), 2865-2874 (2013).
- Wang, X., Ye, K., Li, Z. H., Yan, C., Ding, J. D. Adhesion, proliferation, and differentiation of mesenchymal stem cells on RGD nanopatterns of varied nanospacings. Organogenesis. 9 (4), 280-286 (2013).
- Wang, X., Li, S. Y., Yan, C., Liu, P., Ding, J. D. Fabrication of RGD micro/nanopattern and corresponding study of stem cell differentiation. Nano Lett. 15 (3), 1457-1467 (2015).
- Li, Z. H., et al. Effects of RGD nanospacing on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J. Mater. Chem. B. 3 (12), 5197-5209 (2015).
- Stephanopoulos, N., et al. Bioactive DNA-peptide nanotubes enhance the differentiation of neural stem cells into neurons. Nano Lett. 15 (1), 603-609 (2015).
- Rolland, O., Turrin, C. O., Caminade, A. M., Majoral, J. P. Dendrimers and nanomedicine: Multivalency in action. New J. Chem. 33, 1809-1824 (2009).
- Saovapakhiran, A., D’Emanuele, A., Attwood, D., Penny, J. Surface modification of PAMAM dendrimers modulates the mechanism of cellular internalization. Bioconjug. Chem. 20 (4), 693-701 (2009).
- Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral functionalization of dendrimers regulates internalization and intracellular trafficking in living cells. Bioconjug. Chem. 23 (5), 1059-1068 (2012).
- Mikhail, A. S., Jones, K. S., Sheardown, H. Dendrimer grafted cell adhesion peptide-modified PDMS. Biotechnol. Prog. 24 (4), 938-944 (2008).
- Kino-oka, M., Kim, J., Kurisaka, K., Kim, M. H. Preferential growth of skeletal myoblasts and fibroblasts in co-culture on a dendrimer-immobilized surface. J. Biosci. Bioeng. 115 (1), 96 (2013).
- Kim, M. H., et al. Morphological regulation and aggregate formation of rabbit chondrocytes on dendrimer immobilized surfaces with D-glucose display. J. Biosci. Bioeng. 107 (2), 196-205 (2009).
- Lomba, M., et al. Cell adhesion on surface patterns generated by the photocrosslinking of hyperbranched polyesters with a trisdiazonium salt. React. Funct. Polym. 73 (3), 499-507 (2013).
- Maheshwari, G., Brown, G., Lauffenburger, D. A., Wells, A., Griffith, L. G. Cell adhesion and motility depend on nanoscale RGD clustering. J. Cell Sci. 113 (Pt 10), 1677-1686 (2000).
- Kim, M. H., Kino-oka, M., Kawase, M., Yagi, K., Taya, M. Synergistic effect of D-glucose and epidermal growth factor display on dynamic behaviors of human epithelial cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (5), 428-431 (2007).
- Pericet-Camara, R., Cahill, B. P., Papastavrou, G., Borkovec, M. Nano-patterning of solid substrates by adsorbed dendrimers. Chem. Commun. 3, 266-268 (2007).
- Lagunas, A., et al. Large-scale dendrimer-based uneven nanopatterns for the study of local arginine–glycine–aspartic acid (RGD) density effects on cell adhesion. Nano Res. 7 (3), 399-409 (2014).
- Lagunas, A., et al. Tailoring RGD local surface density at the nanoscale toward adult stem cell chondrogenic commitment. Nano Res. , (2017).
- Prats-Alfonso, E., et al. Effective and Versatile Strategy for the Total Solid-Phase Synthesis of Alkanethiols for Biological Applications. Eur. J. Org. Chem. 2013 (7), 1233-1239 (2013).
- Zhu, Y. B., Gao, C. Y., Liu, X. Y., He, T., Shen, J. C. Immobilization of biomacromolecules onto aminolyzed poly(L-lactic acid) toward acceleration of endothelium regeneration. Tissue Eng. 10 (1-2), 53-61 (2004).
- Güell, A., Díez-Pérez, I., Gorostiza, P., Sanz, F. Preparation of reliable probes for electrochemical tunneling spectroscopy. Anal. Chem. 76 (17), 5218-5222 (2004).
- Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res. C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
- De Lise, A. M., Fisher, L., Tuan, R. S. Cellular interactions and signaling in cartilage development. Osteoarthritis Cartilage. 8 (5), 309-334 (2000).
- Kosher, R. A., Kulyk, W. M., Gay, S. W. Collagen gene expression during limb cartilage differentiation. J. Cell Biol. 102 (4), 1151-1156 (1986).
- Biebricher, A., Paul, A., Tinnefeld, P., Golzhauser, A., Sauer, M. Controlled three-dimensional immobilization of biomolecules on chemically patterned surfaces. J. Biotechnol. 112 (1-2), 97-107 (2004).
- Tinazli, A., Piehler, J., Beuttler, M., Guckenberger, R., Tampé, R. Native protein nanolithography that can write, read and erase. Nat. Nanotechnol. 2, 220-225 (2007).
- Oberhansl, S., et al. Facile Modification of Silica Substrates Provides a Platform for Direct-Writing Surface Click Chemistry. Small. 8 (4), 541-545 (2012).
