Nanopatterns inégale dendrimère-basé à localement gouvernes adhésivité : une méthode pour diriger la différenciation chondrogéniques
Summary
Une méthode pour obtenir nanopatterns inégale dendrimère-basé qui permettent le contrôle de l’échelle nanométrique d’arginine-glycine-aspartique acide (RGD) surface densité locale est décrite et appliquée pour l’étude de la différenciation cellulaire adhésion et chondrogéniques.
Abstract
Différenciation et adhésion cellulaire est conditionnée par la disposition de l’échelle nanométrique des composants de la matrice extracellulaire (MEC), avec des concentrations locales ayant un effet majeur. Nous présentons ici une méthode pour obtenir des nanopatterns inégales à grande échelle d’arginine-glycine-aspartique acide (RGD)-fonctionnalisés dendrimères qui permettent le contrôle de l’échelle nanométrique de RGD local grammage. Nanopatterns sont formés par adsorption en surface de dendrimères de solutions à différentes concentrations initiales et sont caractérisées par l’angle de contact de l’eau (CA), spectrométrie de photoélectrons (XPS), et scanning probe techniques de microscopie tels que microscopie à effet tunnel (STM) balayage et microscopie à force atomique (AFM). La densité de surface locale de RGD est mesurée en utilisant des images de l’AFM au moyen de cartes de contour de probabilité des distances minimales d’interparticulaires et puis en corrélation avec la différenciation et la réponse d’adhérence cellulaire. La méthode de structuration présentée ici est une procédure simple qui peut évoluer vers le haut d’une manière simple de grandes surfaces. Il est donc entièrement compatible avec les protocoles de culture de cellules et peut être appliqué aux autres ligands qui exercent des effets sur les cellules de concentration-dépendante.
Introduction
Ici, nous décrivons une procédure simple et polyvalent basé sur dendrimère durcie pour obtenir des surfaces de culture de cellules qui permettent le contrôle des locaux de l’adhérence à l’échelle nanométrique. Nanoscale détails d’organisation de l’ECM ont été signalés,1,2,3 et la structuration de l’adhérence cellulaire a permis de mieux comprendre profondément les exigences cellulaires associés à adhérence4, 5. Expériences utilisant micellaire nanopatterns axée sur la lithographie a révélé un seuil à environ 70 nm pour nanospacing de peptide RGD, adhésion cellulaire retardée significativement supérieur à cette valeur6,7,8 ,9. Ces études ont aussi souligné le plus d’influence des locaux que la densité globale de ligand sur cell adhesion9,10,11.
Au cours de la morphogenèse, interactions cellulaires avec le milieu environnant déclenchent les premières manifestations de différenciation, qui continuent jusqu’à ce que les structures tissulaires complexe final ont été formés. Dans ce cadre, des surfaces de nanopatterned ont été utilisés pour lutter contre l’influence des interactions cellule-surface initiales sur la morphogenèse. Axée sur la lithographie RGD nanopatterns avec un espacement latéral de 68 nm en β-type Ti-40Nb alliages aident à maintenir le phénotype indifférencié de cellules de tige non engagés12, tandis que nanospacings RGD entre 95 et 150 nm améliorer la différenciation des cellules souches mésenchymateuses (CSM) vers adipocytaire/ostéogénique13,14,15 et chondrogéniques fates16. Auto-assemblage macromolécules modifiés avec signalisation composants montrent également, pour diriger l’adhésion cellulaire et la différenciation en fournissant nanométriques règlement architectural des indices signalisation17. À cet égard, la déposition de dendrimères avec interaction cellule moitiés dans leur sphère extérieure18,19,20 , sur des surfaces a été utilisée pour étudier les cellules adhérence21,22, morphologie23,24et migration des événements25,26. Néanmoins, l’absence de caractérisation de surface dans ces études rend difficile d’établir une quelconque corrélation entre dendrimère configuration surface et réponse de la cellule.
Dendrimère nanopatterns avec ordre de liquide et l’espacement défini peut être obtenue quand dendrimères s’adsorber sur les surfaces à faible charge de solutions avec faibles forces ioniques. 27 sur la base de cette propriété, nous présentons une méthode pour obtenir à grande échelle nanopatterns inégale des dendrimères fonctionnalisés RGD sur des surfaces très basse-chargées qui permettent le contrôle de l’échelle nanométrique de masse surfacique RGD local. Angle de contact de l’eau (CA), spectrométrie de photoélectrons (XPS) et scanning probe microscopy techniques (STM et AFM nanopatterns) Voir la que la densité locale de ligand peut être ajustée en modifiant la concentration initiale dendrimère en solution. La densité de surface locale RGD est quantifiée des images de l’AFM en cartes de contour de probabilité des distances minimales d’interparticulaires et puis en corrélation avec des expériences de cellules. Par rapport aux autres techniques de structuration4, axée sur les dendrimère durcie est simple et peut être facilement transposé aux larges surfaces, étant donc entièrement compatible avec les applications de culture de cellules. Nanopatterns sont utilisés comme substrats bioactifs pour évaluer l’effet de la densité locale de surface RGD sur cell adhesion28 et sur l’induction chondrogéniques de l’adulte humain MSCs29. Nos résultats montrent que RGD dendrimère-basé nanopatterns soutenir la croissance des cellules et qu’adhésion cellulaire est renforcée par la forte densité de surface locale RGD. Dans les expériences de différenciation, intermédiaires de l’adhérence des cellules aux substrats favorisée condensation MSC et différenciation chondrogéniques précoce. Étant donné la facilité avec laquelle dendrimère groupes périphériques peuvent être modifiées, la méthode décrite ici peut être étendue aux autres ligands ECM qui exercent des effets sur les cellules de concentration-dépendante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lors de l’élaboration du protocole décrit, on envisagera un certain nombre d’étapes critiques. Le premier se réfère à la caractérisation de nanostructures avec techniques de microscopie de sonde à balayage. Pour visualiser la nanopatterns, la surface où la structuration est produite doit avoir une valeur de rugosité au-dessous du diamètre moyen des dendrimères, qui est d’environ 4 à 5 nm tel que mesuré par la STM (Figure 1 b). En outre, il devrait tenir compte du fait que l’imagerie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent Oriol Font-Bach et Albert G. Castaño pour leur aide dans la quantificationmin d. Ils reconnaissent également l’unité de microscopie numérique avancé à l’Institut de recherche en biomédecine (IRB Barcelona) pour laisser les auteurs à enregistrer la vidéo dans leurs locaux. Ce travail a été soutenu par le réseautage Biomedical Research Centre (CIBER), Espagne. CIBER est qu’une initiative financée par le VI National R & D & i Plan 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, programme de Consolider, CIBER Actions et l’Instituto de Salud Carlos III, avec le soutien du Fonds européen de développement régional. Ce travail a été soutenu par le Conseil des universités et de la Ministère de l’Innovation, des universités et entreprises de la Generalitat de Catalunya (2014 SGR / 1442). Il a également été financée par les projets OLIGOCODES (no. MAT2012-38573-C02) et CTQ2013-41339-P, décerné par le ministère espagnol de l’économie et la compétitivité, en outre à INTERREG V-A Espagne-Portugal 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E). La CRP reconnaît le soutien financier de la subvention espagnole du ministère de l’économie et la compétitivité (no IFI15/00151).
Materials
| Gold (111) on mica. 1.4×1.1 cm | Spi Supplies | 466PS-AB | |
| Glass micro slides, plain | Corning | 2947-75×25 | |
| Deionized water | Millipore | 18MΩ cm | |
| Ethanol 96% | PanReac | 131085.1212 | |
| L-Lactide/DL-Lactide copolymer | Corbion | 95/05 molar ratio | |
| 1,4 – dioxane | Sigma-Aldrich | 296309-1L | |
| Silicone oil, high temperature | Acros Organics | 174665000 | |
| Spinner | Laurell | WS-650MZ-23NPP/Lite | |
| Tissue culture laminar flow hood | Telstar | Bio II Advance | Class II biological safety cabinet |
| Filter unit | Millex-GP | SLGP033RB | 0.22 µm |
| Syringe 10 mL | Discardit | 309110 | |
| Atomic Force microscope | Veeco Instruments | Dimension 3000 AFM instrument | |
| Silicon AFM probes | Budget Sensors | Tap300AI-G | Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m |
| Scanning tunneling microscope | Molecular Imaging | PicoSPM microscope | |
| Pt0.8:Ir0.2 wire | Advent | PT671012 | Diameter 0.25 mm |
| WSxM 4.0 software | Nanotec electronica | ||
| Optical contact angle (CA) system | Dataphysics | ||
| SCA20 software | Dataphysics | ||
| X-ray photoelectron spectrometer | Physical Electronics | Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | 1.0 mL solution |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Gibco | 21600-10 | Powder |
| Mouse embryo fibroblasts | ATCC | ATCC CRL-1658 | NIH/3T3 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose | Gibco | 11960044 | liquid high glucose, no glutamine, 500 mL |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | 500 mL |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 200 mM (100X) |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360039 | 100 mL |
| T75 culture flasks | Nunclon | 156499 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25200072 | 0,25% EDTA |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik | Z 206 A | |
| Non-tissue culture treated plate, 12 well | Falcon | 351143 | Non-adherent |
| Adipose-derived hMSCs | ATCC | ATCC PCS-500-011 | Cell vial 1 mL |
| MSC basal medium | ATCC | ATCC PCS-500-030 | |
| MSC growth kit | ATCC | ATCC PCS-500-040 | Low serum |
| Chondrocyte differentiation tool | ATCC | ATCC PCS-500-051 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT5011-15ML | neutral buffered, 10% |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-50G | |
| Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody | Abcam | ab32084 | Diluted 1:200 |
| Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain | Acris Antibodies | AM00212PU-N | Diluted: 1:400 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A10667 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11036 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 10ML | 10 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Cover glass 24×24 mm | Deltalab | D102424 | |
| Fluoromount | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse E1000 upright microscope | with a CCD camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | Leica SPE Upright Confocal Microscope | |
| ImageJ 1.50g freeware | http://imgej.nih.gov/ij | ||
| MATLAB software | The MATHWORKS, Inc. | ||
| OriginPro 8.5 software | OriginLab Coorporation |
References
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