Dendrimer-baserte ujevn Nanopatterns til lokalt kontroll overflaten feste: en metode for å direkte Chondrogenic differensiering
Summary
En metode for å få dendrimer-baserte ujevn nanopatterns som tillater nanoskala kontroll av lokale arginine-glycine-aspartic acid (RGD) overflate tetthet er beskrevet og for studier av celle vedheft og chondrogenic differensiering.
Abstract
Mobilnettet vedheft og differensiering er betinget av nanoskala disponeringen av komponentene i ekstracellulær matrix (EFM), med lokale konsentrasjoner har en stor effekt. Her presenterer vi en metode for å få store ujevn nanopatterns arginine-glycine-aspartic syre (RGD)-functionalized dendrimers som tillater nanoskala kontroll av lokale RGD overflaten tetthet. Nanopatterns er dannet ved overflaten adsorpsjon av dendrimers fra løsninger på ulike første konsentrasjoner og er preget av vann kontakt vinkel (CA), røntgen photoelectron spektroskopi (XPS), og skanning sonde mikroskopi teknikker som skanning tunnelering mikroskopi (STM) og atomic force mikroskopi (AFM). Lokale overflaten tettheten av RGD måles ved hjelp av AFM bilder ved hjelp av sannsynlighet konturkart med minimum interparticle avstander og deretter korrelert med celle vedheft respons og differensiering. Metoden nanopatterning presenteres her er en enkel prosedyre som kan skaleres på en enkel måte å store flater. Det er dermed kompatible med celle kultur protokoller og kan brukes på andre ligander at konsentrasjon-avhengige effekter på celler.
Introduction
Her beskriver vi en enkel og allsidig dendrimer-baserte nanopatterning prosedyren for å få celle kultur overflater at kontroll av lokale feste på nanoskala. Nanoskala detaljer om ECM organisasjonen har blitt rapportert,1,2,3 og nanopatterning celle vedheft flater har gitt dyp innsikt i mobilnettet kravene knyttet til vedheft4, 5. Eksperimenter med micellar litografi-baserte nanopatterns avslørte en terskelverdi rundt 70 nm for RGD peptid nanospacing, celleadhesjon blir betydelig forsinket over denne verdien6,7,8 ,9. Disse studiene fremhevet også større påvirkning av lokale enn globale ligand tetthet på celle vedheft9,10,11.
Under morphogenesis utløse celle interaksjon med omgivelsene første differensiering hendelsene, og Fortsett til siste komplekse vev strukturer har blitt dannet. Innen denne rammen har nanopatterned flater blitt brukt til å takle påvirkning av de første celle-overflate samhandlingene på morphogenesis. Litografi-baserte RGD nanopatterns med en lateral avstand på 68 nm i β-type Ti-40Nb legeringer bidra til å opprettholde udifferensierte fenotypen ikke forpliktet stamceller12, mens RGD nanospacings av mellom 95 og 150 nm styrke differensiering av stamceller (MSCs) mot adipogenic/osteogenic13,14,15 og chondrogenic skjebne16. Selv montasje makromolekyler endret signalnettverk komponenter har også vist seg å direkte celleadhesjon og differensiering gir nanoskala arkitektoniske regulering av de signalnettverk stikkord17. I denne forbindelse er at Cospatric av dendrimers med celle-samspill moieties i deres ytre sfære18,19,20 på overflater brukt til å studere celle vedheft21,22, morfologi23,24og migrasjon hendelser25,26. Likevel, mangel på overflaten karakteristikk i disse studiene gjør det vanskelig å etablere noen sammenheng mellom dendrimer overflaten konfigurasjon og celle respons.
Dendrimer nanopatterns med væske-lignende orden og definerte avstand kan oppnås når dendrimers adsorberes lav-ladet overflater fra løsninger med lav ioniske styrke. 27 på grunnlag av denne egenskapen, her presenterer vi en metode for å få store ujevn nanopatterns av RGD-functionalized dendrimers på lav-ladet overflater som tillater nanoskala kontrollen av lokale RGD overflate. Vann kontakt vinkel (CA), røntgen photoelectron spektroskopi (XPS) og skanning sonde mikroskopi teknikker (STM og AFM nanopatterns) viser at lokale ligand tettheter kan justeres å endre den opprinnelige dendrimer konsentrasjonen i løsningen. Lokale RGD overflaten tetthet er kvantifisert fra AFM bilder av sannsynlighet konturkart med minimum interparticle avstander og deretter korrelert med cellen eksperimenter. Sammenlignet med andre nanopatterning teknikker4, dendrimer-baserte nanopatterning er enkelt og kan enkelt skaleres til store flater, dermed er fullt kompatibel med celle kultur programmer. Nanopatterns brukes som bioaktive underlag evaluere effekten av lokale RGD overflaten tetthet på celle vedheft28 og chondrogenic induksjon av voksen menneskelige MSCs29. Våre resultater viser at RGD dendrimer-baserte nanopatterns opprettholde cellevekst og at celleadhesjon forsterkes av høy lokal RGD overflaten tettheter. Differensiering-eksperimenter mellomliggende feste celleområdet til substrater foretrukket MSC kondens og tidlig chondrogenic differensiering. På grunn av brukervennlighet med hvilke dendrimer eksterne grupper kan endres, kan metoden beskrevet her fremme utbygget til andre ECM ligander at konsentrasjon-avhengige effekter på celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under utviklingen av beskrevet protokollen, bør en rekke viktige tiltak vurderes. Først refererer til nanopattern karakterisering skanning sonde mikroskopi teknikker. For å visualisere nanopatterns, overflaten hvor mønstre er produsert må ha en grovhet verdi under mener diameteren på dendrimers, som er rundt 4 – 5 nm målt ved STM (figur 1B). Det bør også tas i betraktning at høy oppløsning STM imaging er begrenset til ledende underlag, i dette tilfellet Au(111). Noen løfte av polymer fra hj…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne bekrefter Oriol Font-Bach og Albert G. Castaño for deres hjelp i dmin kvantifisering. De erkjenner også avansert Digital mikroskopi enheten ved Institutt for forskning innen biomedisin (IRB Barcelona) la forfatterne ta opp video i lokalet. Dette arbeidet ble støttet av den nettverk Biomedical Research Center (CIBER), Spania. CIBER er et initiativ finansiert av VI National R & D & jeg Plan 2008-2011 Iniciativa Ingenio 2010, consolidar Program, CIBER handlinger og i Instituto de Salud Carlos III, med støtte fra den europeiske Regional Development Fund. Dette arbeidet har vært støttet av Kommisjonen for universiteter og forskning av Institutt for innovasjon, universiteter og Enterprise av Generalitat de Catalunya (2014 SGR 1442). Det var også finansiert av prosjektene OLIGOCODES (nr. MAT2012-38573-C02) og CTQ2013-41339-P, tildelt av det spanske departementet for økonomi og konkurranseevne, i tillegg til INTERREG V-A Spania-Portugal 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E). C.R.P. erkjenner økonomisk støtte fra det spanske departementet for økonomi og konkurranseevne grant (nr. IFI15/00151).
Materials
| Gold (111) on mica. 1.4×1.1 cm | Spi Supplies | 466PS-AB | |
| Glass micro slides, plain | Corning | 2947-75×25 | |
| Deionized water | Millipore | 18MΩ cm | |
| Ethanol 96% | PanReac | 131085.1212 | |
| L-Lactide/DL-Lactide copolymer | Corbion | 95/05 molar ratio | |
| 1,4 – dioxane | Sigma-Aldrich | 296309-1L | |
| Silicone oil, high temperature | Acros Organics | 174665000 | |
| Spinner | Laurell | WS-650MZ-23NPP/Lite | |
| Tissue culture laminar flow hood | Telstar | Bio II Advance | Class II biological safety cabinet |
| Filter unit | Millex-GP | SLGP033RB | 0.22 µm |
| Syringe 10 mL | Discardit | 309110 | |
| Atomic Force microscope | Veeco Instruments | Dimension 3000 AFM instrument | |
| Silicon AFM probes | Budget Sensors | Tap300AI-G | Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m |
| Scanning tunneling microscope | Molecular Imaging | PicoSPM microscope | |
| Pt0.8:Ir0.2 wire | Advent | PT671012 | Diameter 0.25 mm |
| WSxM 4.0 software | Nanotec electronica | ||
| Optical contact angle (CA) system | Dataphysics | ||
| SCA20 software | Dataphysics | ||
| X-ray photoelectron spectrometer | Physical Electronics | Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | 1.0 mL solution |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Gibco | 21600-10 | Powder |
| Mouse embryo fibroblasts | ATCC | ATCC CRL-1658 | NIH/3T3 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose | Gibco | 11960044 | liquid high glucose, no glutamine, 500 mL |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | 500 mL |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 200 mM (100X) |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360039 | 100 mL |
| T75 culture flasks | Nunclon | 156499 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25200072 | 0,25% EDTA |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik | Z 206 A | |
| Non-tissue culture treated plate, 12 well | Falcon | 351143 | Non-adherent |
| Adipose-derived hMSCs | ATCC | ATCC PCS-500-011 | Cell vial 1 mL |
| MSC basal medium | ATCC | ATCC PCS-500-030 | |
| MSC growth kit | ATCC | ATCC PCS-500-040 | Low serum |
| Chondrocyte differentiation tool | ATCC | ATCC PCS-500-051 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT5011-15ML | neutral buffered, 10% |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-50G | |
| Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody | Abcam | ab32084 | Diluted 1:200 |
| Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain | Acris Antibodies | AM00212PU-N | Diluted: 1:400 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A10667 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11036 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 10ML | 10 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Cover glass 24×24 mm | Deltalab | D102424 | |
| Fluoromount | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse E1000 upright microscope | with a CCD camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | Leica SPE Upright Confocal Microscope | |
| ImageJ 1.50g freeware | http://imgej.nih.gov/ij | ||
| MATLAB software | The MATHWORKS, Inc. | ||
| OriginPro 8.5 software | OriginLab Coorporation |
References
- Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148 (3), 268-278 (2004).
- Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), 2243-2254 (2007).
- Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biol. 27 (5), 451-461 (2008).
- Christman, K. L., Enriquez-Rios, V. D., Maynard, H. D. Nanopatterning proteins and peptides. Soft Matter. 2, 928-939 (2006).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Arnold, M., et al. Activation of integrin function by nanopatterned adhesive interfaces. ChemPhysChem. 5 (3), 383-388 (2004).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Lateral spacing of integrin ligands influences cell spreading and focal adhesion assembly. Eur. J. Cell. Biol. 85 (3-4), 219-224 (2006).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys. J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Arnold, M., et al. Cell interactions with hierarchically structured nano-patterned adhesive surfaces. Soft Matter. 5 (1), 72-77 (2009).
- Malmström, J., et al. Large area protein patterning reveals nanoscale control of focal adhesion development. Nano Lett. 10 (2), 686-694 (2010).
- Deeg, J. A., et al. Impact of local versus global ligand density on cellular adhesion. Nano Lett. 11 (4), 1469-1476 (2011).
- Medda, R., et al. Investigation of early cell–surface interactions of human mesenchymal stem cells on nanopatterned β-type titanium-niobium alloy surfaces. Interface Focus. 4, 20130046 (2014).
- Wang, X., et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials. 34 (12), 2865-2874 (2013).
- Wang, X., Ye, K., Li, Z. H., Yan, C., Ding, J. D. Adhesion, proliferation, and differentiation of mesenchymal stem cells on RGD nanopatterns of varied nanospacings. Organogenesis. 9 (4), 280-286 (2013).
- Wang, X., Li, S. Y., Yan, C., Liu, P., Ding, J. D. Fabrication of RGD micro/nanopattern and corresponding study of stem cell differentiation. Nano Lett. 15 (3), 1457-1467 (2015).
- Li, Z. H., et al. Effects of RGD nanospacing on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J. Mater. Chem. B. 3 (12), 5197-5209 (2015).
- Stephanopoulos, N., et al. Bioactive DNA-peptide nanotubes enhance the differentiation of neural stem cells into neurons. Nano Lett. 15 (1), 603-609 (2015).
- Rolland, O., Turrin, C. O., Caminade, A. M., Majoral, J. P. Dendrimers and nanomedicine: Multivalency in action. New J. Chem. 33, 1809-1824 (2009).
- Saovapakhiran, A., D’Emanuele, A., Attwood, D., Penny, J. Surface modification of PAMAM dendrimers modulates the mechanism of cellular internalization. Bioconjug. Chem. 20 (4), 693-701 (2009).
- Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral functionalization of dendrimers regulates internalization and intracellular trafficking in living cells. Bioconjug. Chem. 23 (5), 1059-1068 (2012).
- Mikhail, A. S., Jones, K. S., Sheardown, H. Dendrimer grafted cell adhesion peptide-modified PDMS. Biotechnol. Prog. 24 (4), 938-944 (2008).
- Kino-oka, M., Kim, J., Kurisaka, K., Kim, M. H. Preferential growth of skeletal myoblasts and fibroblasts in co-culture on a dendrimer-immobilized surface. J. Biosci. Bioeng. 115 (1), 96 (2013).
- Kim, M. H., et al. Morphological regulation and aggregate formation of rabbit chondrocytes on dendrimer immobilized surfaces with D-glucose display. J. Biosci. Bioeng. 107 (2), 196-205 (2009).
- Lomba, M., et al. Cell adhesion on surface patterns generated by the photocrosslinking of hyperbranched polyesters with a trisdiazonium salt. React. Funct. Polym. 73 (3), 499-507 (2013).
- Maheshwari, G., Brown, G., Lauffenburger, D. A., Wells, A., Griffith, L. G. Cell adhesion and motility depend on nanoscale RGD clustering. J. Cell Sci. 113 (Pt 10), 1677-1686 (2000).
- Kim, M. H., Kino-oka, M., Kawase, M., Yagi, K., Taya, M. Synergistic effect of D-glucose and epidermal growth factor display on dynamic behaviors of human epithelial cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (5), 428-431 (2007).
- Pericet-Camara, R., Cahill, B. P., Papastavrou, G., Borkovec, M. Nano-patterning of solid substrates by adsorbed dendrimers. Chem. Commun. 3, 266-268 (2007).
- Lagunas, A., et al. Large-scale dendrimer-based uneven nanopatterns for the study of local arginine–glycine–aspartic acid (RGD) density effects on cell adhesion. Nano Res. 7 (3), 399-409 (2014).
- Lagunas, A., et al. Tailoring RGD local surface density at the nanoscale toward adult stem cell chondrogenic commitment. Nano Res. , (2017).
- Prats-Alfonso, E., et al. Effective and Versatile Strategy for the Total Solid-Phase Synthesis of Alkanethiols for Biological Applications. Eur. J. Org. Chem. 2013 (7), 1233-1239 (2013).
- Zhu, Y. B., Gao, C. Y., Liu, X. Y., He, T., Shen, J. C. Immobilization of biomacromolecules onto aminolyzed poly(L-lactic acid) toward acceleration of endothelium regeneration. Tissue Eng. 10 (1-2), 53-61 (2004).
- Güell, A., Díez-Pérez, I., Gorostiza, P., Sanz, F. Preparation of reliable probes for electrochemical tunneling spectroscopy. Anal. Chem. 76 (17), 5218-5222 (2004).
- Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res. C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
- De Lise, A. M., Fisher, L., Tuan, R. S. Cellular interactions and signaling in cartilage development. Osteoarthritis Cartilage. 8 (5), 309-334 (2000).
- Kosher, R. A., Kulyk, W. M., Gay, S. W. Collagen gene expression during limb cartilage differentiation. J. Cell Biol. 102 (4), 1151-1156 (1986).
- Biebricher, A., Paul, A., Tinnefeld, P., Golzhauser, A., Sauer, M. Controlled three-dimensional immobilization of biomolecules on chemically patterned surfaces. J. Biotechnol. 112 (1-2), 97-107 (2004).
- Tinazli, A., Piehler, J., Beuttler, M., Guckenberger, R., Tampé, R. Native protein nanolithography that can write, read and erase. Nat. Nanotechnol. 2, 220-225 (2007).
- Oberhansl, S., et al. Facile Modification of Silica Substrates Provides a Platform for Direct-Writing Surface Click Chemistry. Small. 8 (4), 541-545 (2012).
