Summary
En metode for å få dendrimer-baserte ujevn nanopatterns som tillater nanoskala kontroll av lokale arginine-glycine-aspartic acid (RGD) overflate tetthet er beskrevet og for studier av celle vedheft og chondrogenic differensiering.
Abstract
Mobilnettet vedheft og differensiering er betinget av nanoskala disponeringen av komponentene i ekstracellulær matrix (EFM), med lokale konsentrasjoner har en stor effekt. Her presenterer vi en metode for å få store ujevn nanopatterns arginine-glycine-aspartic syre (RGD)-functionalized dendrimers som tillater nanoskala kontroll av lokale RGD overflaten tetthet. Nanopatterns er dannet ved overflaten adsorpsjon av dendrimers fra løsninger på ulike første konsentrasjoner og er preget av vann kontakt vinkel (CA), røntgen photoelectron spektroskopi (XPS), og skanning sonde mikroskopi teknikker som skanning tunnelering mikroskopi (STM) og atomic force mikroskopi (AFM). Lokale overflaten tettheten av RGD måles ved hjelp av AFM bilder ved hjelp av sannsynlighet konturkart med minimum interparticle avstander og deretter korrelert med celle vedheft respons og differensiering. Metoden nanopatterning presenteres her er en enkel prosedyre som kan skaleres på en enkel måte å store flater. Det er dermed kompatible med celle kultur protokoller og kan brukes på andre ligander at konsentrasjon-avhengige effekter på celler.
Introduction
Her beskriver vi en enkel og allsidig dendrimer-baserte nanopatterning prosedyren for å få celle kultur overflater at kontroll av lokale feste på nanoskala. Nanoskala detaljer om ECM organisasjonen har blitt rapportert,1,2,3 og nanopatterning celle vedheft flater har gitt dyp innsikt i mobilnettet kravene knyttet til vedheft4, 5. Eksperimenter med micellar litografi-baserte nanopatterns avslørte en terskelverdi rundt 70 nm for RGD peptid nanospacing, celleadhesjon blir betydelig forsinket over denne verdien6,7,8 ,9. Disse studiene fremhevet også større påvirkning av lokale enn globale ligand tetthet på celle vedheft9,10,11.
Under morphogenesis utløse celle interaksjon med omgivelsene første differensiering hendelsene, og Fortsett til siste komplekse vev strukturer har blitt dannet. Innen denne rammen har nanopatterned flater blitt brukt til å takle påvirkning av de første celle-overflate samhandlingene på morphogenesis. Litografi-baserte RGD nanopatterns med en lateral avstand på 68 nm i β-type Ti-40Nb legeringer bidra til å opprettholde udifferensierte fenotypen ikke forpliktet stamceller12, mens RGD nanospacings av mellom 95 og 150 nm styrke differensiering av stamceller (MSCs) mot adipogenic/osteogenic13,14,15 og chondrogenic skjebne16. Selv montasje makromolekyler endret signalnettverk komponenter har også vist seg å direkte celleadhesjon og differensiering gir nanoskala arkitektoniske regulering av de signalnettverk stikkord17. I denne forbindelse er at Cospatric av dendrimers med celle-samspill moieties i deres ytre sfære18,19,20 på overflater brukt til å studere celle vedheft21,22, morfologi23,24og migrasjon hendelser25,26. Likevel, mangel på overflaten karakteristikk i disse studiene gjør det vanskelig å etablere noen sammenheng mellom dendrimer overflaten konfigurasjon og celle respons.
Dendrimer nanopatterns med væske-lignende orden og definerte avstand kan oppnås når dendrimers adsorberes lav-ladet overflater fra løsninger med lav ioniske styrke. 27 på grunnlag av denne egenskapen, her presenterer vi en metode for å få store ujevn nanopatterns av RGD-functionalized dendrimers på lav-ladet overflater som tillater nanoskala kontrollen av lokale RGD overflate. Vann kontakt vinkel (CA), røntgen photoelectron spektroskopi (XPS) og skanning sonde mikroskopi teknikker (STM og AFM nanopatterns) viser at lokale ligand tettheter kan justeres å endre den opprinnelige dendrimer konsentrasjonen i løsningen. Lokale RGD overflaten tetthet er kvantifisert fra AFM bilder av sannsynlighet konturkart med minimum interparticle avstander og deretter korrelert med cellen eksperimenter. Sammenlignet med andre nanopatterning teknikker4, dendrimer-baserte nanopatterning er enkelt og kan enkelt skaleres til store flater, dermed er fullt kompatibel med celle kultur programmer. Nanopatterns brukes som bioaktive underlag evaluere effekten av lokale RGD overflaten tetthet på celle vedheft28 og chondrogenic induksjon av voksen menneskelige MSCs29. Våre resultater viser at RGD dendrimer-baserte nanopatterns opprettholde cellevekst og at celleadhesjon forsterkes av høy lokal RGD overflaten tettheter. Differensiering-eksperimenter mellomliggende feste celleområdet til substrater foretrukket MSC kondens og tidlig chondrogenic differensiering. På grunn av brukervennlighet med hvilke dendrimer eksterne grupper kan endres, kan metoden beskrevet her fremme utbygget til andre ECM ligander at konsentrasjon-avhengige effekter på celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. substratet
-
Avspenning 1.4 x 1.1 cm Au(111) på glimmer underlag.
- Plasser Au(111) underlaget på glass-keramisk kokeplate og anneal det med en butan flamme for 3 min. Tillat underlaget og kjølig under en argon atmosfære. Gjenta dette trinnet for hver Au(111) substrat.
Merk: Au(111) underlag bør brukes umiddelbart etter avspenning.
- Plasser Au(111) underlaget på glass-keramisk kokeplate og anneal det med en butan flamme for 3 min. Tillat underlaget og kjølig under en argon atmosfære. Gjenta dette trinnet for hver Au(111) substrat.
-
Utarbeidelse av Poly (L-Lactic Acid) (PLLA)-belagt Glass underlag.
- Kuttet og vask glass lysbilder.
- Kuttet mikroskopi lysbilder i 18 lysbilder på 1,25 cm x 1,25 cm med en diamant-tip kutter. En liten hakk på undersiden av hvert lysbilde, slik at de øvre og nedre sidene kan skilles senere.
- Vask lysbildene med deionisert vann etterfulgt av 96% etanol. Tillate dem å air-dry.
- Forberede 2% PLLA løsning.
- Legge til 200 mg PLLA 10 mL av 1,4-dioxane i et press rør. Legge til en rør bar og Lukk røret tett.
- Legg press røret i glyserin badekar på en varm plate på 60 ° C mild omrøring 24 h, og deretter overføre løsningen til en 15-mL hetteglass.
- Belegg på glass lysbilder med PLLA løsning.
- Plass glass lysbilder og ampullen med PLLA løsning på en ren kokeplate på 60 ° C. Pass på at lysbildene vender oppover og tillate dem å være i minst 10 minutter å nå nødvendig temperaturen.
- Forberede spin-coater og sette programmet som er angitt i tabell 1.
- Plass en av lysbilder ansiktet opp på spin coater, bruker et system. Med en Pasteur pipette, bruke 0,25 mL av PLLA løsningen i lysbildet, sørge for at hele overflaten er dekket. Kjør programmet belegg. Gjenta dette trinnet for hvert lysbilde.
- Kuttet og vask glass lysbilder.
2. Dendrimer Nanopatterning
-
Utarbeidelse av RGD-Functionalized Dendrimer (RGD-Cys-D1) 28 løsninger.
- Oppløse 5 mg dendrimer i 6.494 mL deionisert vann. Dette er løsningen A.
Merk: Bruk dendrimer lagerløsning innen 6 måneder med forberedelser. - Sonicate løsning A for 10 min og utarbeide løsninger B og C følgende tabell 2.
- Sonicate løsning C for 10 min og utarbeide løsninger D, E og F følgende tabell 2.
- Lagre løsninger B, C, D, E og F på 4 ° C før bruk. Løsning A kan lagres på 20 ° C for senere bruk.
- Oppløse 5 mg dendrimer i 6.494 mL deionisert vann. Dette er løsningen A.
-
Nanopatterning av RGD-Cys-D1 Dendrimers på substrater
- I vev kultur hette, sterilisere substrater ved irradiating dem med UV lys i 13 min.
Merk: Dette trinnet er bare nødvendig når nanopatterned underlag skal brukes som celle kultur underlag. I dette tilfellet vedlikehold sterilt betingelsene (vev kultur hette, sterile materialer, løsninger og teknikker) for følgende. - Plass hver underlaget med forsiden opp i brønnene på en plate, håndtering dem nøye med pinsett.
- Sonicate løsninger B, C, D, E og F for 10 min.
- RGD-Cys-D1 dendrimer løsningene passere et 0.22-µm diameter filter bruker en sprøyte direkte i brønnene som inneholder substrater (2 mL/vel). Minst tre replikaer per dendrimer konsentrasjon anbefales. Lukk og forsegle platen og la det ved romtemperatur (RT) for 16 h.
- Fjerne og slette løsninger. Vask substrater sterilt deionisert vann og tørr. Lagre underlag på 4 ° C.
Merk: Protokollen kan pauses her.
- I vev kultur hette, sterilisere substrater ved irradiating dem med UV lys i 13 min.
3. forberedelse av kontroll underlag
Merk: Alle skritt ble utført i et sterilt vev kultur hette og bare sterile materialer, løsninger og teknikker ble brukt. Minst styre seks underlag ble brukt (tre kopier av kontrollen positiv) og tre kopier av kontrollen negative.
- I vev kultur hette, sterilisere substrater ved irradiating dem med UV lys i 13 min.
-
Kontroll underlag for Fibroblast vedheft eksperimentet.
- Bruke flamme-herdet Au(111) underlag som kontrollen negative. Gull har kjente protein-rødsprit effekt som gir anti-klebende egenskaper28. Sonicate alle løsninger og filtrere før substrat inkubasjon.
- Av positive kontrollene, fordype flamme-herdet Au(111) underlag i en løsning av RGD endret PEG thiol, Ac-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp-NH-ethylene glycol mono-11-mercaptoundecanamide (RGD-PEG-SH)30 og triethylene glycol Mono-11-mercaptoundecyl Eter (PEG-SH) i 1: 100 molar forholdet i 96% etanol 16 h på RT.
- Vask underlag i etanol og tørk dem med argon. Lagre underlag på 4 ° C.
-
Kontroll substrater for Chondrogenesis.
- Bruke uberørte PLLA underlag som kontrollen negative. Uten overflate behandling viser PLLA dårlig grensesnitt med levende celler. 31
- Av positive kontrollene, forberede 5 mL 0,1 mg/mL fibronectin i fosfat-bufret saltvann (PBS) og ruge hver PLLA underlaget med 1,6 mL fibronectin løsningen 1t på RT.
- Fjerne forkaste fibronectin løsningen og vaske substrater med PBS. Lagre underlag på 4 ° C.
4. overflate karakteristikk
-
AFM Imaging
- Utføre AFM bildebehandling av PLLA underlag for en grovhet analyse. Siden dendrimers har en diameter på 4-5 nm, grovhetsverdier av 1 nm skal oppnås for riktig visualisering av nanopatterns. Også utføre AFM avbildning av nanopatterns. I begge tilfeller Utfør AFM i å tappe modus i luften.
- Velg en silicon cantilever med en våren konstant k = 40 N/m og en resonansfrekvensen ν = 300 kHz og montere den på AFM utstyret.
- Montere prøven på scenen av atomic force mikroskopet. Avhengig av oppsettet av apparater, kan tuning og imaging spesifikasjoner variere. Se produsentens håndbok.
- Tilnærming prøven med spissen av mikroskopet til kontakten.
- For å bilde PLLA for ruhet analyse, velger du minst fire representant områder på 20 x 20 µm per substrat fra tre uavhengige underlag. Bilde dendrimer nanopatterns, velger du minst tre representant bilder av 5 × 5 µm per substrat fra tre uavhengige underlag per betingelse (første dendrimer konsentrasjon i løsning). For å unngå skade dendrimer lag før bildebehandling, justere settpunkt for å holde styrken på et minimum.
Merk: Valg av tenkelig området avhenger også på arbeider rekke piezoelectric skanneren. Vennligst håndboken instrument i denne forbindelse. - Prosessen AFM høyden bilder ved å plassere hver skanne linje til polynom utjevning funksjoner ved hjelp av proprietær programvare på produsenten av AFM apparatet, og analysere dem fra PLLA til å beregne overflateruhet. Root-mean square (RMS) analyse kan være et egnet alternativ.
-
Lokale RGD overflaten tetthet mål.
- Få bildet tersklene behandlet AFM høyde bilder som velger dendrimers på overflaten.
- Bestemme partikkel stillingene bruker en bildebehandling og bruke dem til å få minimum interparticle avstanden (dmin).
- Tegn dmin verdiene i z til tilsvarende partikkel plasseringene å få konturkart sannsynligheten for dmin. Justere fargeskala av handlingen å visualisere regionene høyeste lokale RGD overflaten tetthet (dmin < 70 nm).
- Kvantifisere området områdene med den høyeste lokale RGD overflate tettheten bruker en bildebehandling. Omfatte områdene dendrimer aggregater i beregningen.
-
STM Imaging.
Merk: STM bildebehandling kan utføres bare for nanopatterns på ledende Au(111) underlag. Mål gjøres i luften.- Plass nanopatterned underlaget i prøven innehaveren av STM utstyret. Sjekk tilkoblingen populasjonsutvalg og holderen med tester.
- Etch en tips av valgte sonde (dvs. PT 0,8: Ir 0,2) med en diameter som sikrer riktig montering på hodet av STM utstyret. Etsing kan utføres ved manuell skjæring eller elektrokjemiske etsning. 32
Merk: Elektrokjemiske etsing gjengir symmetrisk tips. - Montere tipset i hodet av STM utstyret og koble prøven.
- Angi "gjeldende" i tilbakemelding kanalen (i denne typen måling, gjeldende vil være konstant av tilbakemeldinger innstiller). Justere bias spenning og gjeldende settpunkt og skanning nr for å få et godt løst bilde når spissen er engasjert.
Merk: Valg av tenkelig området avhenger også på arbeider rekke piezoelectric skanneren. Vennligst håndboken instrument i denne forbindelse. - Prosessen STM topografiske bildene ved å tilpasse hver skanning linje polynom nivellering fungerer ved hjelp av proprietær programvare på produsenten av STM apparatet.
-
CA målinger.
- Måle CA på nanopatterned substrater av fastsittende-slipp-metoden på tre ulike posisjoner på tre uavhengige underlag per betingelse (første dendrimer konsentrasjon i løsningen) med en optisk CA system.
- Fyll microsyringe med deionisert vann og sette parametre i CA programvaren å produsere dråper 1 µL.
- Plass prøven på scenen slik at overflaten av prøven er tydelig på datamaskinen for bildebehandling.
- Flytt sprøyten med micromanipulator til det blir nær overflaten og dispensere fall på overflaten. Ta bildet rett etter slippverktøy stabilisering.
Merk: I CA mål er det svært viktig å kontrollere fuktighet for å oppnå reproduserbar resultatene. - Analysere CAs målt med proprietære programvare av produsenten av CA apparatet. Metoden passer kan tilpasses brukerkrav. Elliptiske passende metoden kan være et alternativ.
5. celle kultur
Merk: Alle skritt ble utført i en vev kultur hette og bare sterile materialer, løsninger og teknikker ble brukt.
-
Fibroblast vedheft eksperiment.
- Kultur NIH 3T3 mus embryonale fibroblaster fra tidlig passasjer (< 10) på 37 ° C og 4,6% CO2 atmosfære i basale medium med høy glukose supplert med 10% fosterets bovin serum (FBS), 1% L-glutamin, 1% penicillin-streptomycin og 1% natrium pyruvate (vekst medium). MT75 flasker for en total såing av 500.000 celler per kolbe i 10 mL av oppblomstringen medium anbefales.
- Fjerne gamle medium med en 10 mL pipette hver 2 dager og erstatte med 10 mL av nylagde vekst medium.
- Kultur celler i vekst medium før de nå rundt 80% samløpet og deretter fjerne mediet og legge 5 mL av trypsin per kolbe. For å sikre riktig celle løsgjøring fra bunnen av flasken, opprettholde trypsin løsningen i kontakt med cellene for 5 min på 37 ° C.
- Legge til 5 mL av vekstmediet per kolbe og samle cellene i en sentrifuge rør. Sentrifuge cellene 470 x g for 5 min. Fjern nedbryting og resuspend celle pellet i 10 mL av vekst medium. Bestemme konsentrasjonen av celler ved hjelp av en hemocytometer.
- Overføre substrater godt platene ikke behandles for vev kultur (ikke-tilhenger).
- Frø cellene i substrater på en tetthet av 4000 celler/cm2 i vekst medium og ruge dem 4.5 h på 37 ° C og 10% CO2 atmosfære.
-
Chondrogenic induksjon av MSCs.
- Kultur menneskelige MSCs fra tidlig passasjer (< 5) på 37 ° C og 4,6% CO2 atmosfære i MSC vekst medium. MT75 flasker for en total såing av 500.000 celler per kolbe i 10 mL av oppblomstringen medium anbefales.
- Endre medium hver 3 dager (som beskrevet i 5.1.2).
- Trypsinize celler før 80% samløpet er nådd, og virvel og resuspend dem i MSC vekst medium (som beskrevet i 5.1.3). Bestemme konsentrasjonen av celler ved hjelp av en hemocytometer.
- Sentrifuge cellene igjen og resuspend dem i 10 mL av chondrogenesis-inducing medium.
- Overføre substrater fra platene til nye bra plater ikke behandles for vev kultur (ikke-tilhenger). Frø cellene i substrater på en tetthet av 3000 celler/cm2.
- Endre chondrogenic mediet hver 3 dager (som beskrevet i 5.1.2).
6. celle fiksering og immunostai-
Merk: Følgende kan utføres i ikke-sterilt forhold.
- Fjerne media og vask cellene forsiktig med PBS. Fikse dem ved å legge en 10% formalin løsning for 20 min på RT.
- Fjerne formalin og vask cellene med PBS.
- Blokkere gratis aldehyd grupper ved å legge en 50 mM løsning av salmiakk (NH4Cl) i PBS. Lar celler for 20 min rett fjerne NH4Cl løsning og vask cellene med PBS.
Merk: Protokollen kan pauses her. Lagre prøver i PBS på 4 ° C. - Fjerne PBS og permeabilize cellene ved å legge en 0,1% løsning av saponin i blokkering løsningen (1% albumin i PBS) i 10 min på RT. Wash cellene med PBS og overføre prøver til en ny godt plate.
- Inkuber cellene med en løsning av primære antistoffer i blokkering løsningen (tabell 3) 1t på RT. Deretter fjerne den primære antistoff løsningen og vaske cellene med PBS.
- Inkuber cellene med sekundær antistoffer i blokkering løsningen (tabell 3) 1t på RT.
Merk: Unngå lys eksponering. - Fjerne sekundære antistoff løsningen og vask cellene med PBS og tørr.
Merk: Protokollen kan pauses her. Lagre prøvene i PBS på 4 ° C i mørket. - Eksempel montering for mikroskop observasjon: bruker en diamant-tip cutter, skjær coverslips i 1,25 cm x 1,25 cm. bruke 50 µL av mikroskopi montering medium på prøvene og dekke dem forsiktig med den kuttet coverslips.
- Overføre prøvene til en praktisk mottaker, dekke det med aluminiumsfolie og lager i mørket på 4 ° C til observasjon.
7. celle bildebehandling og dataanalyse
Merk: Ugjennomsiktig Au(111) og tykke microslide-baserte underlag, en oppreist mikroskopet må brukes.
-
Fibroblast vedheft eksperiment.
- Bruk en epifluorescence mikroskop utstyrt med et digitalt kamera og lav (dvs. 10 X) og høy (dvs. 40 X) forstørrelse mål. Utføre målinger i luften.
- Plass prøven på scenen og bilde celle kjerner med 10 X målet ved hjelp av en ultrafiolett eksitasjon, longpass utslipp filteret å visualisere Hoechst/DAPI flekken.
- Bildet cellen cytoskjelett og fokal adhesjon (FAs) med 40 X målsettingen, velge mikroskop-filter som samsvarer med de tilsvarende antistoff fluorochrome spesifikasjonene.
- For FA kvantifisering, bruke en bildebehandling for å konvertere bilder til 8-biters filer. Fjerne bakgrunnen og konvertere bilder til binær ved å angi en terskel. Beregn minst 30 bilder per prøve og vurdere FAs 1 µm2 for beregning.
-
Chondrogenic induksjon av MSCs.
- Bilde celle kondensat på den innledende stadiet av chondrogenic induksjon (< 5 dager) med en stående epifluorescence mikroskop utstyrt med et digitalt kamera og en lav (dvs. 10 X) objektiv med høyere forstørring. Bruk ultrafiolett eksitasjon og longpass utslipp filter for å visualisere Hoechst/DAPI flekken.
- For å måle området kondensat, bruk en bildebehandling, konvertere bilder til 8-biters filer, fjerne bakgrunnen og velg en terskel som fremhever samlet konturen. Beregn arealet av partikler.
- Bilde immunostained prøver for FAs cytoskjelett begrepsordbok fiber og brusk-spesifikke collagen type II alfa 1 (COL2A1) med en oppreist AC confocal mikroskopet på forstørring (dvs. 40-60 X). Samle deler et representativt intervall (i.e. 0,5-1 µm).
- Behandle bunken, bruk en bildebehandling. Konvertere bilder til 8-biters filer, fjerne bakgrunnen og gjøre dem binære ved å angi en terskel. Behandle minst tre celle kondensat per betingelse av tre uavhengige prøver.
- Kvantifisere FA protein farget områder fra sonen basale i cellen kondensat og uttrykkes som en tilsvarende prosentandel av området delt på antall celle kjerner i bildet.
- For å måle COL2A1 flekker, bruk AC confocal z-anslag og kvantifisere summen av forventede området (maksimal COL2A1 området per prøve). Normalisere områdeverdien innhentet mot området av tilsvarende Kondensatet.
8. kvantitativ omvendt transkripsjon-polymerase kjedereaksjon (qRT-PCR) analyse
Merk: For å forhindre RNase forurensning, bruke engangs, sterile plast ware og bruke engangshansker under behandling av reagenser og RNA. Alltid bruk riktig mikrobiologisk aseptiske teknikker og bruker riktige dekontaminering løsninger for å fjerne RNase forurensning fra arbeidsflater og ikke-disponible elementer som sentrifuger og pipetter.
- Isolere totale RNA og pulveriser den i en RNA-disrupter. Behandle RNA prøver med DNase og konvertere dem til cDNA med en cDNA syntese kit.
- Gjennomføre qRT PCR primere i transkripsjon faktoren SOX9. Beta-2-microglobulin (B2M) og ribosomal protein L13a (RPL13a) kan brukes som housekeeping gener.
- Beregne uttrykket nivåer og normalisere dem mot kontrollen negative (PLLA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi presenterer en nanopatterning metode som gir overflaten feste håndteres på nanoskala (figur 1). Den kjemiske strukturen til RGD-Cys-D1 vises i figur 1A. Dendrimers ble mønstret på elektrisk ledende Au(111) overflater for høy oppløsning STM karakterisering. Lav dendrimer konsentrasjoner i løsning (opptil 10-5% w/w) gjengitt isolert dendrimers av 4-5 nm i diameter (figur 1B), mens svært pakket dendrimer aggregater dannet på høyere konsentrasjoner (figur 1 c). AFM overflaten karakterisering (Tall 1 D-G, øvre rad) avslørte at overflaten distribusjon av RGD-Cys-D1 dendrimers kan justeres som en funksjon av den første dendrimer konsentrasjonen i løsningen. På konturkart sannsynligheten for dminresulterer dette i forskjellige lokale RGD nanoskala tettheter på overflaten (Tall 1 D-G, nederste raden).
I cellekulturer eksperimenter, celle-membran reseptor integrins rundt 10 nm i diameter anerkjent RGD rekkefølgen på dendrimers periferi. Selv om åtte eksemplarer av denne sekvensen ble gitt per dendrimer, interaksjon bare en dendrimer per integrin målene (4-5 nm målt ved STM; Figur 1B). At gitt hver dendrimer et enkelt nettsted for integrin bindende, og dermed gir en direkte sammenheng dendrimer distribusjon (som sett i AFM bilder) og RGD distribusjon tilgjengelig for celleadhesjon. Videre fant ingen betydelige variasjoner i CA verdiene hentes for forskjellige nanopattern konfigurasjoner som kan påvirke celle vedheft29. Disse egenskapene gjør dendrimer nanopatterns på biokompatible overflater egnet underlag som modulerer og studere celle atferd.
Celle vedheft til nanopatterned Au(111) ble testet med fibroblaster innen de første 24 timer av kultur (figur 2A) og MSCs på nanopatterned PLLA (figur 2B). I begge tilfeller prosentandelen av området farget for FA protein paxillin (personer) økt gradvis med dendrimer konsentrasjon, som gjorde lokale RGD overflaten tetthet (prosent nanopatterned område med dmin under 70-nm terskelen for effektiv celleadhesjon; Tabell 4). For et første dendrimer konsentrasjon på 10-2% w/w og positiv kontroller, prosentandelen av området farget for personer per celle redusert og sammenhengen der nanopatterned område med dmin < 70 nm var tapt.
Prosentandelen av areal av dmin < 70 nm (figur 1 d-G nederste raden og Tabell 4) er en god indikasjon på lokale RGD overflaten tetthet for nanopatterns opp til 10-5% w/w første dendrimer konsentrasjon, men ikke av dem opp til 10-2% w/w, på grunn av dendrimer aggregering. Aggregering produserte svært heterogen prøver i ligand distribusjon, med bare en liten prosentandel av overflaten med dmin verdier under 70-nm terskelen (figur 1 d nederste raden og Tabell 4). XPS resultatene viste at overflatene presentere en global RGD tetthet sammenlignes med 10-5% w/w-avledet nanopatterns28. Denne observasjonen angir at maksimal RGD tetthet ble oppnådd i regioner som inneholder dendrimer-aggregater og at prosentandelen av areal okkupert av dmin < 70 nm er ikke representativt for lokale RGD overflaten tettheten i dette tilfellet.
Observasjon at positiv kontroller (homogen belegg) med maksimal lokale RGD overflaten tetthet ikke vise den forventede økningen i celleadhesjon kan tilskrives en steric hindring effekt. Disse resultatene indikerer at, sammenlignet med tilsvarende homogen overflater brukte i cellekultur, RGD nanopatterns opprettholde celleadhesjon mer effektivt. Dette funnet understreker dermed relevansen av lokale ligand tetthet.
Interaksjon med omgivelsene i morphogenesis aktivere de første cellen differensiering og overføre dem til etableringen av det endelige komplekse vev strukturen. For å evaluere effekten av dendrimer nanopatterns på celleadhesjon og differensiering, brukte vi chondrogenic induksjon av MSCs som modell. Under chondrogenesis er det aktiv matrise remodeling, som spiller en lærerik rolle i regi celler gjennom de forskjellige fasene av brusk formasjon.
MSCs gjennomgikk chondrogenesis på nanopatterns (Figur 3). Chondrogenic differensiering begynner med en celle kondens trinn, som innebærer celle rekruttering å danne tett kondensat, etablering av celle-til-celle kommunikasjon og samtidig endringer i cellen morfologi33. Figur 3A viser at cellen kondens skjedde i alle underlag og at kondensat økte i området med økende dendrimer konsentrasjoner opptil 2,5 ganger 10-8% w/w kondensat området deretter reduseres igjen for en dendrimer konsentrasjon av 10-2% w/w og positiv kontrollen. Celle kondens trinnet i chondrogenesis oppstår gjennom aktive cellen bevegelse og ikke gjennom en økning i celle spredning34. Denne cellen bevegelsen er foretrukket av fleksible vedheft med underlaget: stabil adhesjon skal formes slik at trekkraft styrker flytte celle kroppen, og samtidig, disse adhesjon bør være svak nok å tillate celle utgivelse fra underlaget under bevegelse. Cellen kondens foretrukket av en økning i lokale RGD overflaten tetthet til 2.5x10-8% w/w-avledet nanopatterns, med en god balanse mellom celleadhesjon og celle bevegelse. For 10-2 og positiv kontrollen var lokale RDG overflaten tetthet for høyt, og dermed svekke hendelsen kondens.
Chondrogenic differensiering kommer fra prechondrogenic kondensat: celler i kondensat blir mer avrundet og starte syntesen av brusk spesifikke indikatorer som ECM protein COL2A1 og transkripsjon faktor SOX933, 34 , 35. følgelig underlag med en mellomliggende feste, favoriserer dannelsen av cellen kondensat, viste høyere COL2A1 flekker (figur 3B) og høyere nivåer av SOX9 mRNA uttrykk (Figur 3 c).
Våre resultater markere påvirkning av celle-celle matrix interaksjoner i den tidlige fasen av chondrogenic differensiering. Slike samhandlinger kan tas lett gjennom dendrimer-baserte nanopatterns.
| Trinn | Tid (s) | Hastighet (rpm) | Akselerasjon (rpm/s) |
| 1 | 5 | 500 | 300 |
| 2 | 30 | 3000 | 1500 |
Tabell 1: Spinner programtrinn brukes til coat glass lysbilder med PLLA løsningen. Et første homogenisering ble brukt på 500 rpm med en akselerasjon av 300 rpm/s for 5 s. etterfulgt av en siste trinnet på 3000 rpm med en akselerasjon av 1500 rpm/s for 30 s.
| Løsning | RGD-Cys-D1 (mg/mL) | RGD-Cys-D1 (mg) | MQ vann (µL) |
| A | 0.77 | 5 | 6,494 |
| RGD-Cys-D1 (% w/w) | Løsning en (µL) | ||
| B | 10-2 | 779 | 5,220 |
| C | 10-5 | 0.78 | 6000 |
| Løsning C (µL) | |||
| D | 2,5 x 10-8 | 15,0 | 5,985 |
| E | 10-8 | 6.0 | 5,994 |
| F | 4 x 10-9 | 2.4 | 5,998 |
Tabell 2: Detaljer om utarbeidelse av RGD-Cys-D1 løsningene brukes. En lagerløsning av RGD-Cys-D1 dendrimers var forberedt på en siste konsentrasjon av 0.77 mg/mL (løsning A), som løsninger B og C ble utarbeidet på 10-2 og 10-5% w/w konsentrasjoner. Løsning C med en 10-5% w/w konsentrasjon av RGD-Cys-D1 dendrimer ble brukt til å utarbeide løsninger D, E og F i siste konsentrasjoner av 2.5 x 10-8, 10-8 og 4 x 10-9%w/w, henholdsvis.
| navn | Volum (µL) | Blokkerer buffer (mL) | |
| Primære blanding | Kanin mAb til pax | 65 | 12.870 |
| Musen mAb til COL2A1 | 32,5 | ||
| Sekundær blanding | Alexa Fluor 488 geit anti-mus | 13 | 12.961 |
| Alexa Fluor 568 geit anti-kanin | 13 | ||
| Hoechst løsning | 13 |
Tabell 3: antistoff løsning forberedelse. Det primære antistoff blanding inneholdt monoklonalt antistoffet mot pax produsert i kanin utvannet 1:200 i blokkering løsningen med monoklonalt antistoff mot COL2A1 produsert i mus fortynnet 1:400 i blokkering løsningen. Sekundær antistoff blandingen inneholder cellen kjerner flekken Hoechst og sekundære antistoffer produsert i geit mot musen og kanin henholdsvis (merket med Alexa Fluor 488 og 568 fluorophores, henholdsvis).
Figur 1 : RGD-Cys-D1 dendrimer nanopatterning for nanoskala kontrollen av lokale RGD overflate. (A) RGD-Cys-D1 dendrimer struktur som inneholder opptil åtte kopier av cellen lim RGD peptid. Representant STM bilder (bias = 200 mV, settpunkt = 0,5 nA) av RGD-Cys-D1 nanopatterns på Au(111) fra en innledende vandig løsning 10-8% w/w (skala bar = 3 nm, B) og tilhørende høyde-avstand profil på den stiplede regionen som er angitt i (B)og (C) av 10-2% w/w viser dendrimer samling (skala bar = 20 nm). (D-G) Representant AFM bilder av RGD-Cys-D1 nanopatterns på PLLA innhentet fra tilsvarende dendrimer vandige løsninger på 10-2%, 2,5 x 10-8%, 10-8%og 4 x 10-9% w/w, henholdsvis (skala bar = 1 µm). Tilsvarende interparticle minsteavstand (dmin) sannsynligheten kontur kartet nedenfor hvert AFM bilde, med høy tetthet RGD regioner i mørk rød (dmin < 70 nm). Dendrimers og dendrimer aggregater er avbildet i svart for klarhet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Celle vedheft på RGD-Cys-D1 nanopatterns. Handlingen i andelen området farget for FA protein personer per celle for cellene i kontakt med underlaget (venstre akse) med innledende dendrimer konsentrasjon. Verdier sammenlignes med den lokale RGD overflaten tettheten (prosent av arealet i nanopatterns dmin verdier under 70 nm terskelen) (høyre akse) med 100 og 0 prosent tilordnet positivt (+ kontroll) og negative (- kontroll) kontroller, henholdsvis. (A) Fibroblast vedheft på dendrimer nanopatterns på Au(111) etter 4.5 h kultur. (B) MSC vedheft på dendrimer nanopatterns på PLLA evalueres på dag 1 av chondrogenic induksjon. Verdiene er angitt som gjennomsnittet med standardavviket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| RGD-Cys-D1 (% w/w) | Området (< dmin = 70 nm) (%) på Au(111) | Området (< dmin = 70 nm) (%) på PLLA |
| 10-2 | 5 ± 1 | 2 + 2 |
| 10-5 | 97 ± 2 | |
| 2, 5 x 10-8 | 65 ± 11 | 90 ± 2 |
| 10-8 | 25 ± 16 | 45 ± 7 |
| 4 x 10-9 | 18 ± 11 |
Tabell 4: prosentandel av området med d min verdier under 70 nm oppnådd for RGD-Cys-D1 dendrimer avsettelse på Au(111) og PLLA flater som en funksjon for de første dendrimer brukt.
Figur 3 : Chondrogenic differensiering av MSCs på RGD-Cys-D1-nanopatterns. (A) fukt MSCs kultivert på RGD-Cys-D1 nanopatterns på PLLA etter 5 dager med chondrogenic induksjon. Representant epifluorescence bilder av farget celle kjerner (Hoechst; Skala bar = 300 µm; øvre rad) og plott av cellen kondensat (nederste rad) innhentet på RGD-Cys-D1 nanopatterns fra forskjellige første dendrimer konsentrasjoner. Differensiering provenyet fra cellen kondens trinn med uttrykk for bestemte chondrogenic markører: (B) prosent av COL2A1 flekker normalisert med området celle Kondensatet fra de tilsvarende AC confocal z-anslagene innhentet etter 5 dager med chondrogenic induksjon. (C) Relative SOX9 mRNA uttrykk (mot negative kontroll) etter 3 dager for chondrogenic induksjon. Verdiene er angitt som gjennomsnittet med standardavvik (B) og (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under utviklingen av beskrevet protokollen, bør en rekke viktige tiltak vurderes. Først refererer til nanopattern karakterisering skanning sonde mikroskopi teknikker. For å visualisere nanopatterns, overflaten hvor mønstre er produsert må ha en grovhet verdi under mener diameteren på dendrimers, som er rundt 4 – 5 nm målt ved STM (figur 1B). Det bør også tas i betraktning at høy oppløsning STM imaging er begrenset til ledende underlag, i dette tilfellet Au(111). Noen løfte av polymer fra hjørnene av lysbildet etter spinn-belegget kan rettes ved hjelp av biokompatible lim.
Dendrimer nanopatterning er en prosess der å oppnå kontrollert lokale celle feste på nanoskala. Basert på det selv-montering av dendrimers på overflaten av adsorpsjon, denne teknikken krever ikke komplekse nanopatterning utstyr, dermed kontrastfarge med tidligere beskrevet litografi-baserte metoder36,37, 38. Dendrimer nanopatterning kan enkelt skaleres til store flater og er fullt kompatibel med celle kultur protokoller.
Metoden for dendrimer-nanopatterning beskrevet her kan finne fremtidige anvendelser i regenerativ medisin. Kontroll utøves av dendrimer nanopatterning på cellen feste gjør denne teknikken egnet for Kondisjonering av biologisk materiale før implantasjon, dermed tilrettelegge deres integrering i vert vev. Videre gjør enkelt eksterne moieties kan endres med som dendrimer dendrimer nanopatterning passer for andre ligander at konsentrasjon-avhengige aktivitet på celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne bekrefter Oriol Font-Bach og Albert G. Castaño for deres hjelp i dmin kvantifisering. De erkjenner også avansert Digital mikroskopi enheten ved Institutt for forskning innen biomedisin (IRB Barcelona) la forfatterne ta opp video i lokalet. Dette arbeidet ble støttet av den nettverk Biomedical Research Center (CIBER), Spania. CIBER er et initiativ finansiert av VI National R & D & jeg Plan 2008-2011 Iniciativa Ingenio 2010, consolidar Program, CIBER handlinger og i Instituto de Salud Carlos III, med støtte fra den europeiske Regional Development Fund. Dette arbeidet har vært støttet av Kommisjonen for universiteter og forskning av Institutt for innovasjon, universiteter og Enterprise av Generalitat de Catalunya (2014 SGR 1442). Det var også finansiert av prosjektene OLIGOCODES (nr. MAT2012-38573-C02) og CTQ2013-41339-P, tildelt av det spanske departementet for økonomi og konkurranseevne, i tillegg til INTERREG V-A Spania-Portugal 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E). C.R.P. erkjenner økonomisk støtte fra det spanske departementet for økonomi og konkurranseevne grant (nr. IFI15/00151).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold (111) on mica. 1.4x1.1 cm | Spi Supplies | 466PS-AB | |
| Glass micro slides, plain | Corning | 2947-75x25 | |
| Deionized water | Millipore | 18MΩ cm | |
| Ethanol 96% | PanReac | 131085.1212 | |
| L-Lactide/DL-Lactide copolymer | Corbion | 95/05 molar ratio | |
| 1,4 - dioxane | Sigma-Aldrich | 296309-1L | |
| Silicone oil, high temperature | Acros Organics | 174665000 | |
| Spinner | Laurell | WS-650MZ-23NPP/Lite | |
| Tissue culture laminar flow hood | Telstar | Bio II Advance | Class II biological safety cabinet |
| Filter unit | Millex-GP | SLGP033RB | 0.22 µm |
| Syringe 10 mL | Discardit | 309110 | |
| Atomic Force microscope | Veeco Instruments | Dimension 3000 AFM instrument | |
| Silicon AFM probes | Budget Sensors | Tap300AI-G | Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m |
| Scanning tunneling microscope | Molecular Imaging | PicoSPM microscope | |
| Pt0.8:Ir0.2 wire | Advent | PT671012 | Diameter 0.25 mm |
| WSxM 4.0 software | Nanotec electronica | ||
| Optical contact angle (CA) system | Dataphysics | ||
| SCA20 software | Dataphysics | ||
| X-ray photoelectron spectrometer | Physical Electronics | Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | 1.0 mL solution |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Gibco | 21600-10 | Powder |
| Mouse embryo fibroblasts | ATCC | ATCC CRL-1658 | NIH/3T3 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose | Gibco | 11960044 | liquid high glucose, no glutamine, 500 mL |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | 500 mL |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 200 mM (100X) |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360039 | 100 mL |
| T75 culture flasks | Nunclon | 156499 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25200072 | 0,25% EDTA |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik | Z 206 A | |
| Non-tissue culture treated plate, 12 well | Falcon | 351143 | Non-adherent |
| Adipose-derived hMSCs | ATCC | ATCC PCS-500-011 | Cell vial 1 mL |
| MSC basal medium | ATCC | ATCC PCS-500-030 | |
| MSC growth kit | ATCC | ATCC PCS-500-040 | Low serum |
| Chondrocyte differentiation tool | ATCC | ATCC PCS-500-051 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT5011-15ML | neutral buffered, 10% |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-50G | |
| Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody | Abcam | ab32084 | Diluted 1:200 |
| Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain | Acris Antibodies | AM00212PU-N | Diluted: 1:400 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A10667 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11036 | 2 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 10ML | 10 mg/mL. Diluted 1:1000 |
| Cover glass 24x24 mm | Deltalab | D102424 | |
| Fluoromount | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse E1000 upright microscope | with a CCD camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | Leica SPE Upright Confocal Microscope | |
| ImageJ 1.50g freeware | http://imgej.nih.gov/ij | ||
| MATLAB software | The MATHWORKS, Inc. | ||
| OriginPro 8.5 software | OriginLab Coorporation |
References
- Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148 (3), 268-278 (2004).
- Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), 2243-2254 (2007).
- Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biol. 27 (5), 451-461 (2008).
- Christman, K. L., Enriquez-Rios, V. D., Maynard, H. D. Nanopatterning proteins and peptides. Soft Matter. 2, 928-939 (2006).
- Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Arnold, M., et al. Activation of integrin function by nanopatterned adhesive interfaces. ChemPhysChem. 5 (3), 383-388 (2004).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Lateral spacing of integrin ligands influences cell spreading and focal adhesion assembly. Eur. J. Cell. Biol. 85 (3-4), 219-224 (2006).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys. J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Arnold, M., et al. Cell interactions with hierarchically structured nano-patterned adhesive surfaces. Soft Matter. 5 (1), 72-77 (2009).
- Malmström, J., et al. Large area protein patterning reveals nanoscale control of focal adhesion development. Nano Lett. 10 (2), 686-694 (2010).
- Deeg, J. A., et al. Impact of local versus global ligand density on cellular adhesion. Nano Lett. 11 (4), 1469-1476 (2011).
- Medda, R., et al. Investigation of early cell–surface interactions of human mesenchymal stem cells on nanopatterned β-type titanium-niobium alloy surfaces. Interface Focus. 4, 20130046 (2014).
- Wang, X., et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials. 34 (12), 2865-2874 (2013).
- Wang, X., Ye, K., Li, Z. H., Yan, C., Ding, J. D. Adhesion, proliferation, and differentiation of mesenchymal stem cells on RGD nanopatterns of varied nanospacings. Organogenesis. 9 (4), 280-286 (2013).
- Wang, X., Li, S. Y., Yan, C., Liu, P., Ding, J. D. Fabrication of RGD micro/nanopattern and corresponding study of stem cell differentiation. Nano Lett. 15 (3), 1457-1467 (2015).
- Li, Z. H., et al. Effects of RGD nanospacing on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J. Mater. Chem. B. 3 (12), 5197-5209 (2015).
- Stephanopoulos, N., et al. Bioactive DNA-peptide nanotubes enhance the differentiation of neural stem cells into neurons. Nano Lett. 15 (1), 603-609 (2015).
- Rolland, O., Turrin, C. O., Caminade, A. M., Majoral, J. P. Dendrimers and nanomedicine: Multivalency in action. New J. Chem. 33, 1809-1824 (2009).
- Saovapakhiran, A., D’Emanuele, A., Attwood, D., Penny, J. Surface modification of PAMAM dendrimers modulates the mechanism of cellular internalization. Bioconjug. Chem. 20 (4), 693-701 (2009).
- Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral functionalization of dendrimers regulates internalization and intracellular trafficking in living cells. Bioconjug. Chem. 23 (5), 1059-1068 (2012).
- Mikhail, A. S., Jones, K. S., Sheardown, H. Dendrimer grafted cell adhesion peptide-modified PDMS. Biotechnol. Prog. 24 (4), 938-944 (2008).
- Kino-oka, M., Kim, J., Kurisaka, K., Kim, M. H. Preferential growth of skeletal myoblasts and fibroblasts in co-culture on a dendrimer-immobilized surface. J. Biosci. Bioeng. 115 (1), 96 (2013).
- Kim, M. H., et al. Morphological regulation and aggregate formation of rabbit chondrocytes on dendrimer immobilized surfaces with D-glucose display. J. Biosci. Bioeng. 107 (2), 196-205 (2009).
- Lomba, M., et al. Cell adhesion on surface patterns generated by the photocrosslinking of hyperbranched polyesters with a trisdiazonium salt. React. Funct. Polym. 73 (3), 499-507 (2013).
- Maheshwari, G., Brown, G., Lauffenburger, D. A., Wells, A., Griffith, L. G. Cell adhesion and motility depend on nanoscale RGD clustering. J. Cell Sci. 113 (Pt 10), 1677-1686 (2000).
- Kim, M. H., Kino-oka, M., Kawase, M., Yagi, K., Taya, M. Synergistic effect of D-glucose and epidermal growth factor display on dynamic behaviors of human epithelial cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (5), 428-431 (2007).
- Pericet-Camara, R., Cahill, B. P., Papastavrou, G., Borkovec, M. Nano-patterning of solid substrates by adsorbed dendrimers. Chem. Commun. 3, 266-268 (2007).
- Lagunas, A., et al. Large-scale dendrimer-based uneven nanopatterns for the study of local arginine–glycine–aspartic acid (RGD) density effects on cell adhesion. Nano Res. 7 (3), 399-409 (2014).
- Lagunas, A., et al. Tailoring RGD local surface density at the nanoscale toward adult stem cell chondrogenic commitment. Nano Res. , (2017).
- Prats-Alfonso, E., et al. Effective and Versatile Strategy for the Total Solid-Phase Synthesis of Alkanethiols for Biological Applications. Eur. J. Org. Chem. 2013 (7), 1233-1239 (2013).
- Zhu, Y. B., Gao, C. Y., Liu, X. Y., He, T., Shen, J. C. Immobilization of biomacromolecules onto aminolyzed poly(L-lactic acid) toward acceleration of endothelium regeneration. Tissue Eng. 10 (1-2), 53-61 (2004).
- Güell, A., Díez-Pérez, I., Gorostiza, P., Sanz, F. Preparation of reliable probes for electrochemical tunneling spectroscopy. Anal. Chem. 76 (17), 5218-5222 (2004).
- Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res. C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
- De Lise, A. M., Fisher, L., Tuan, R. S. Cellular interactions and signaling in cartilage development. Osteoarthritis Cartilage. 8 (5), 309-334 (2000).
- Kosher, R. A., Kulyk, W. M., Gay, S. W. Collagen gene expression during limb cartilage differentiation. J. Cell Biol. 102 (4), 1151-1156 (1986).
- Biebricher, A., Paul, A., Tinnefeld, P., Golzhauser, A., Sauer, M. Controlled three-dimensional immobilization of biomolecules on chemically patterned surfaces. J. Biotechnol. 112 (1-2), 97-107 (2004).
- Tinazli, A., Piehler, J., Beuttler, M., Guckenberger, R., Tampé, R. Native protein nanolithography that can write, read and erase. Nat. Nanotechnol. 2, 220-225 (2007).
- Oberhansl, S., et al. Facile Modification of Silica Substrates Provides a Platform for Direct-Writing Surface Click Chemistry. Small. 8 (4), 541-545 (2012).
