Summary

ניתוח והכנת פרוסה הילתית בפיתוח העכבר בלוטת יותרת המוח

Published: November 16, 2017
doi:

Summary

אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתח יותרת ולהכין יותרת המוח מקטעים הילתית מלפתח עכברים.

Abstract

בלוטת יותרת המוח או hypophysis הוא איבר האנדוקרינית חשוב הפרשת הורמונים חיוניים עבור הומאוסטזיס. הוא מורכב שתי בלוטות עם המקורות עובריים נפרד פונקציות – את neurohypophysis ולא את adenohypophysis. בלוטת יותרת המוח המתפתח של העכבר הוא קטן ועדין עם צורה של אליפסה מוארכת. מקטע הילתית הוא העדיף כדי להציג הן adenohypophysis והן neurohypophysis פרוסה אחת של ההיפופיזה העכבר.

המטרה של פרוטוקול זה היא להשיג מקטעים הילתית יותרת המוח תקין עם רקמת שהשתמרו ארכיטקטורות מלפתח עכברים. ב פרוטוקול זה, נתאר בפירוט כיצד לנתח ולעבד יותרת כראוי מלפתח עכברים. ראשית, עכברים נפתרות על-ידי transcardial זלוף פורמלין לפני ניתוח. אז שלוש טכניקות שונות ויבתר מוחלים כדי להשיג שלמות בלוטות יותרת המוח תלוי בגילו של עכברים. עבור עוברי עכברים מגיל 17.5 ימים עובריים (E)-18.5 ו- neonates עד 4 ימים, האזורים סלה כולו לרבות עצם היתד, בלוטה, המשולש העצבים הם גזור. עבור גורים בגילאי כמחנכת ימים (P) 5-14, בלוטות יותרת המוח הקשורים המשולש העצבים הם גזור בכללותה. עבור עכברים מעל בן 3 שבועות, בלוטות יותרת המוח הם בקפידה גזור ללא תשלום מן הרקמות הסובבות. אנחנו גם להציג כיצד להטביע את בלוטות יותרת המוח בכיוון הנכון באמצעות הרקמות הסובבות כמו ציוני דרך כדי להשיג סיפוק מקטעים הילתית. שיטות אלה שימושיים בניתוח תכונות ההתפתחותי היסטולוגית של בלוטות יותרת המוח בפיתוח עכברים.

Introduction

בלוטת יותרת המוח או hypophysis הוא איבר האנדוקרינית חשוב הפרשת הורמונים חיוניים עבור הומאוסטזיס1,2. מבחינה אנטומית, בלוטת יותרת המוח היא מבנה ‘ שני-in-one”הכוללת את neurohypophysis, את adenohypophysis. חלקים אלה יש מקורות עובריים שונים, פונקציה אחרת. Neurohypophysis נגזרת של האאקטודרם עצבית, מפריש אוקסיטוצין, הורמון antidiuretic. Adenohypophysis מקורו נרתיק של ראת’קי, אחראי על השחרור של הורמונים לרבות הורמון גדילה, פרולקטין, תירוטרופין, הורמון מגרה זקיק, הורמון מחלמן, הורמון אדרנוקורטיקוטרופי, ו מלנוציט – הורמון מגרה3,4,5.

בלוטת יותרת המוח נשענת על המשטח הגבי של עצם היתד (אשר) של הגולגולת העכבר ו מחוברת לרצפה של המוח על ידי גבעול שביר. המלון מוקף רוחבית על ידי המשולש העצבים ועל anteriorly ידי הצנטר6,7. בלוטת יש צורה של אליפסה מוארכת עם ציר זמן בניצב לראש. על השטח הגבי שלה, את neurohypophysis, את adenohypophysis יכול בקלות להיות התחום, עם לשעבר הכובש המדיאלי האזור הגבי ולהרחיב את האחרון רוחבית ולא ventrally. במהלך פיתוח כמחנכת, בגודל של יותרת המוח גדל במהירות בחודש הראשון לאחר הלידה8,9. בכל זאת, ההיפופיזה העכבר הוא עדיין קטן מאוד בגודלם במשקל ממוצע של 1.9 מ”ג, קוטר ציר זמן של ~ 3 מ מ למבוגרים10, קוטר ציר זמן של 2-2.5 מ”מ ביום כמחנכת 21 (P21), ולא רק 1-1.5 מ”מ P0.

מקטע הילתית הוא העדיף כדי להציג הן adenohypophysis והן neurohypophysis פרוסה אחת של ההיפופיזה העכבר. עם זאת, כישורים טכניים נדרשים להשיג סיפוק הילתית חלקים ובלוטות יותרת המוח פיתוח עכברים בשל גודל קטן במיוחד שלה האנטומיה ברורה. במאמר זה וידאו, נדגים כיצד לנתח העכבר יותרת ולהכין מקטעים הילתית יותרת המוח בשלבי התפתחות שונים.

Protocol

C57BL/6 עכברים מובאים בתנאים מסוימים ללא הפתוגן. כל שיטות ניסוי בבעלי חיים הם בהתאם להנחיות אושרה על ידי חיה אכפת ועדת האתיקה-השנייה הצבאי לרפואה של אוניברסיטת. 1. דיסקציה של כמחנכת פיתוח בלוטת יותרת המוח לבצע הרדמה: במקום neonatal עכברים (P0 – P5) על קרח כתוש, כדי ליצור היפותרמיה…

Representative Results

פרוטוקול זה מציג שיטה לנתח יותרת מלפתח עכברים. עבור העכבר neonatal, האזורים סלה שלם המכיל את בלוטת יותרת המוח, העצבים המשולש, במסווה עצם היתד היו גזור החוצה מבסיס הגולגולת. בלוטת יותרת המוח קטן ועדין נותרו על כנן במהלך התהליך (איור 1 א’). בלוטות יותרת המוח קשורה ?…

Discussion

לפיתוח מאתר pituitaries, עברו טכנית קשה להשיג מקטעים הילתית נכונה עקב שלהם תכונות זעירים, שברירית, מאפיינים אנטומיים ייחודיים6,8. כמה קבוצות מחקר ולכן בחרה מקטעים מאמצע-הווריד כדי לנתח את המורפולוגיה של עובריים ו neonatal יותרת המוח11,12

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המענקים של הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31201086, 31470759 ו- 31671219) וקרן מדעי הטבע שנגחאי (12ZR1436900).

Materials

Tools/Equipment
Surgical scissors-straight JinZhong J21010 can be purchased from other vendors
Fine scissors-strainght JinZhong WA1010 can be purchased from other vendors
Blunt forceps JinZhong JD1020 can be purchased from other vendors
Fine forceps Dumont RS-5015 for isolation of the pituitary
26G (0.45mm) needle HongDa for transcardial perfusion
Syringe (1 mL) BD 300841 can be purchased from other vendors
Syringe (10 mL) BD can be purchased from other vendors
35mm dish Corning 430165 can be purchased from other vendors
Lens cleaning paper ShuangQuan can be purchased from other vendors
Anatomical microscope OLYMPUS SZX-ILLB2-200 can be purchased from other vendors
Embedding cassette Thermo Fisher 22-272423 can be purchased from other vendors
Tissue embedding console system KEDEE KD-BM11 can be purchased from other vendors
Microtome Thermo Fisher HM315R can be purchased from other vendors
Superfrost-Plus slides Thermo Fisher 22-037-246 can be purchased from other vendors
Cover glass Thermo Fisher 12-543 can be purchased from other vendors
Fluorescence microscope OLYMPUS BH2-RFCA can be purchased from other vendors
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Urethane BBI EB0448
NaCl Sigma S9625 for PBS
KCl Sigma P9541 for PBS
Na2HPO4.12H2O Sigma 71650 for PBS
K2HPO4 Sigma P2222 for PBS
NaNO2 Sigma 237213
Heparin Sodium Injection SPH H31022051 for perfusion saline
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148
Ethanol SCR 10009218
Xylene SCR 10023418
Paraffin Thermo Fisher 8330
Hematoxylin Sigma H9627 for H&E staining
Eosin Y Sigma E4009 for H&E staining
rabbit anti growth hormone (GH) National Hormone for immunostaining
antibody Pituitary Program
Rabbit anti-mouse GFAP antibody Sigma G9269 for immunostaining
Goat anti-rabbit IgG, HRP Jackson 111-035-003 for immunostaining
TSA system NEN Life Science Products NEL700 for immunostaining
Streptavidin, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher S32356 for immunostaining
Anti-FITC Alexa Fluor 488 Thermo Fisher A11090 for immunostaining

References

  1. Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. Hidden face of the anterior pituitary. Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).
  2. Haedo, M. R., et al. Regulation of pituitary function by cytokines. Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).
  3. Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks. Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).
  4. Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. Pituitary gland development: an update. Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).
  5. Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse. Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).
  6. Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa. Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).
  7. Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland. AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).
  8. Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period. Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).
  9. Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification. Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).
  10. Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis. J Vis Exp. (46), (2010).
  11. Budry, L., et al. Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).
  12. Wilson, D. B., Wyatt, D. P. Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice. Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).
  13. Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).
  14. Cao, D., et al. ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification. Nat Commun. 7, 11121 (2016).

Play Video

Cite This Article
Cao, D., Ma, X., Zhang, W. J., Xie, Z. Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland. J. Vis. Exp. (129), e56356, doi:10.3791/56356 (2017).

View Video