Summary

Dissecação e preparação Coronal fatia de desenvolver Mouse hipófise

Published: November 16, 2017
doi:

Summary

Apresentamos um protocolo para dissecar as glândulas pituitárias e preparar na hipófise coronais seções de desenvolvimento de ratos.

Abstract

A glândula pituitária ou hipófise é um importante órgão endócrino secreção de hormônios essenciais para a homeostase. É constituída por duas glândulas com funções e origens embrionárias distintas — a neuro-hipófise e a adenohipófise. A desenvolvimento do mouse hipófise é minúsculo e delicado com uma forma oval alongada. Uma secção coronal é preferida para exibir tanto a adenohipófise e neuro-hipófise em uma única fatia da hipófise do mouse.

O objetivo do presente protocolo é conseguir a adequada da hipófise secções coronais com arquiteturas de tecido bem preservado de desenvolver ratos. Neste protocolo, descrevemos em detalhe como dissecar e processo hipófises corretamente de desenvolvimento de ratos. Primeiro, os ratos são fixos por perfusão transcardial de formaldeído antes da dissecação. Em seguida, três diferentes técnicas de dissecação são aplicadas para obter intactas as glândulas pituitárias, dependendo da idade dos ratos. Para ratos fetais entre embrionários dias (E) 17,5-18.5 e neonatos acima de 4 dias, as regiões de sella inteira, incluindo o osso esfenoide, glândulas e nervos trigêmeo são dissecadas. Para filhotes idade pós-natal dias (P) 5-14, as glândulas pituitária conectados com os nervos trigêmeo são dissecados como um todo. Para ratos mais de 3 semanas de idade, as glândulas pituitária são cuidadosamente dissecadas de graça os tecidos circundantes. Também exibimos como incorporar as glândulas pituitária em uma orientação correta usando os tecidos circunvizinhos como Marcos para obter satisfação secções coronais. Esses métodos são úteis na análise de características histológicas e do desenvolvimento das glândulas pituitária no desenvolvimento de ratos.

Introduction

A glândula pituitária ou hipófise é um importante órgão endócrino secreção de hormônios essenciais para a homeostase1,2. Anatomicamente, a glândula pituitária é uma estrutura ‘ dois-em-um ‘ da neuro-hipófise e a adenohipófise. Estas peças têm a função e diferentes origens embrionárias muito diferentemente. A neuro-hipófise é derivada do ectoderma neural e segrega ocitocina e hormônio antidiurético. A adenohipófise origina-se de bolsa de Rathke e é responsável para a liberação de hormônios, incluindo o hormônio do crescimento, prolactina, hormônio estimulante da tireoide, hormônio folículo estimulante, hormônio luteinizante, hormônio adrenocorticotrófico, e melanócito – estimulante hormônio3,4,5.

A glândula pituitária baseia-se na superfície dorsal do osso esfenoide (sella turcica) do crânio do mouse e é ligada ao pavimento do cérebro por um frágil caule. Está rodeada lateralmente pelos nervos trigêmeo e anteriormente pelo quiasma óptico6,7. A glândula tem uma forma oval alongada com seu longo eixo perpendicular a isso da cabeça. Em sua superfície dorsal, a neuro-hipófise e a adenohipófise podem facilmente ser demarcadas, com a primeira ocupando a região dorsal medial e o último estendendo lateralmente e ventralmente. Durante o desenvolvimento pós-natal, o tamanho da hipófise aumenta rapidamente no primeiro mês após o nascimento de8,9. Não obstante, a hipófise de rato ainda é muito pequena em tamanho, com um peso médio de 1,9 mg e long-eixo de ~ 3 mm de diâmetro em adulto10, um diâmetro de eixo longo de 2-2,5 mm no pós-Natal dia 21 (P21) e apenas de 1-1,5 mm em P0.

Uma secção coronal é preferida para exibir ambos adenohipófise e neuro-hipófise em uma única fatia da hipófise do mouse. No entanto, algumas habilidades técnicas são necessárias para obter a satisfação secções coronais de glândulas pituitárias de desenvolver ratos devido ao seu tamanho extremamente pequeno e anatomia distinta. Neste artigo de vídeo, demonstramos como dissecar as glândulas pituitárias de rato e preparar secções coronais da hipófise em diferentes estágios de desenvolvimento.

Protocol

camundongos C57BL/6 são criados em condições específicas isentos de organismos patogénicos. Todos os métodos experimentais animais estejam em conformidade com as diretrizes aprovadas pelo Comitê de ética na Universidade de medicina militar de segundo e cuidado Animal. 1. dissecação de pós-natal desenvolvendo hipófise realizar anestesia: Coloque gelo picado para induzir hipotermia neonatais ratos (P0 – P5). Para os ratos mais de 5 dias de idade, injete intraperitonealmen…

Representative Results

Este protocolo apresenta um método para dissecar as glândulas pituitárias de desenvolver ratos. Para o mouse neonatal, as regiões de sella inteira que contém a glândula pituitária, os nervos trigêmeo e parte de baixo osso esfenoide foram dissecados para fora da base do crânio. A glândula pituitária pequena e delicada permaneceu intacta durante o processo (figura 1A). Para os ratos mais de 5 dias, as glândulas pituitária anexadas aos nervos trigê…

Discussion

Para o desenvolvimento de murino pituitaries, tem sido difícil tecnicamente obter as seções coronais adequadas, devido a suas características de pequenas e frágil e características anatômicas únicas6,8. Alguns grupos de pesquisa assim escolhi meados-sagital seções para analisar a morfologia do embrionário e neonatal na hipófise11,12. Embora a meados-sagital da hipófise também é capaz de mos…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelas concessões do Nacional Natural Science Foundation da China (31201086, 31470759 e 31671219) e a Fundação de ciência Natural de Shanghai (12ZR1436900).

Materials

Tools/Equipment
Surgical scissors-straight JinZhong J21010 can be purchased from other vendors
Fine scissors-strainght JinZhong WA1010 can be purchased from other vendors
Blunt forceps JinZhong JD1020 can be purchased from other vendors
Fine forceps Dumont RS-5015 for isolation of the pituitary
26G (0.45mm) needle HongDa for transcardial perfusion
Syringe (1 mL) BD 300841 can be purchased from other vendors
Syringe (10 mL) BD can be purchased from other vendors
35mm dish Corning 430165 can be purchased from other vendors
Lens cleaning paper ShuangQuan can be purchased from other vendors
Anatomical microscope OLYMPUS SZX-ILLB2-200 can be purchased from other vendors
Embedding cassette Thermo Fisher 22-272423 can be purchased from other vendors
Tissue embedding console system KEDEE KD-BM11 can be purchased from other vendors
Microtome Thermo Fisher HM315R can be purchased from other vendors
Superfrost-Plus slides Thermo Fisher 22-037-246 can be purchased from other vendors
Cover glass Thermo Fisher 12-543 can be purchased from other vendors
Fluorescence microscope OLYMPUS BH2-RFCA can be purchased from other vendors
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Urethane BBI EB0448
NaCl Sigma S9625 for PBS
KCl Sigma P9541 for PBS
Na2HPO4.12H2O Sigma 71650 for PBS
K2HPO4 Sigma P2222 for PBS
NaNO2 Sigma 237213
Heparin Sodium Injection SPH H31022051 for perfusion saline
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148
Ethanol SCR 10009218
Xylene SCR 10023418
Paraffin Thermo Fisher 8330
Hematoxylin Sigma H9627 for H&E staining
Eosin Y Sigma E4009 for H&E staining
rabbit anti growth hormone (GH) National Hormone for immunostaining
antibody Pituitary Program
Rabbit anti-mouse GFAP antibody Sigma G9269 for immunostaining
Goat anti-rabbit IgG, HRP Jackson 111-035-003 for immunostaining
TSA system NEN Life Science Products NEL700 for immunostaining
Streptavidin, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher S32356 for immunostaining
Anti-FITC Alexa Fluor 488 Thermo Fisher A11090 for immunostaining

References

  1. Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. Hidden face of the anterior pituitary. Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).
  2. Haedo, M. R., et al. Regulation of pituitary function by cytokines. Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).
  3. Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks. Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).
  4. Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. Pituitary gland development: an update. Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).
  5. Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse. Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).
  6. Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa. Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).
  7. Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland. AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).
  8. Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period. Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).
  9. Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification. Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).
  10. Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis. J Vis Exp. (46), (2010).
  11. Budry, L., et al. Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).
  12. Wilson, D. B., Wyatt, D. P. Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice. Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).
  13. Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).
  14. Cao, D., et al. ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification. Nat Commun. 7, 11121 (2016).

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Cite This Article
Cao, D., Ma, X., Zhang, W. J., Xie, Z. Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland. J. Vis. Exp. (129), e56356, doi:10.3791/56356 (2017).

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