Summary
Vi presentiamo un protocollo per sezionare le ghiandole pituitarie e preparare sezioni coronali pituitarie da topi di sviluppo.
Abstract
La ghiandola pituitaria o ipofisi sono un importante organo endocrino che secerne ormoni essenziali per l'omeostasi. Si compone di due ghiandole con origini embrionali separate e funzioni — neurohypophysis e adenohypophysis. Ghiandola pituitaria del mouse in via di sviluppo è molto piccolo e delicato con una forma ovale allungata. Una sezione coronale è preferita per visualizzare sia il adenohypophysis e neurohypophysis in una sola fetta del pituitary del mouse.
L'obiettivo del presente protocollo è quello di ottenere sezioni coronali pituitari corretto con le architetture di tessuto ben conservato da topi di sviluppo. In questo protocollo, descriviamo dettagliatamente come sezionare ed elaborare ghiandole pituitarie correttamente da topi di sviluppo. In primo luogo, topi vengono fissati mediante perfusione perfusione di formaldeide prima della dissezione. Quindi tre diverse tecniche di dissezione vengono applicate per ottenere ghiandole pituitarie intatti a seconda dell'età dei topi. Per topi fetali dai giorni embrionale (E) 17,5-18,5 e neonati fino a 4 giorni, le regioni di sella intera compreso l'osso sfenoidale, ghiandola e nervi di trigeminal vengono sezionate. Per i cuccioli invecchiati giorni postnatali (P) 5-14, ghiandole ipofisi collegati con nervi di trigeminal vengono sezionati nel suo complesso. Per i topi vecchio oltre 3 settimane, le ghiandole pituitaria attentamente vengono sezionate gratis dai tessuti circostanti. Visualizziamo anche come incorporare le ghiandole pituitaria in un orientamento corretto utilizzando i tessuti circostanti come punti di riferimento per ottenere soddisfazione sezioni coronali. Questi metodi sono utili per analizzare le caratteristiche istologiche e dello sviluppo delle ghiandole pituitaria in topi di sviluppo.
Introduction
La ghiandola pituitaria o ipofisi sono un importante organo endocrino che secerne ormoni essenziali per l'omeostasi1,2. Anatomicamente, la ghiandola pituitaria è una struttura di ' due-in-one ' costituita neurohypophysis e adenohypophysis. Queste parti hanno diverse origini embrionali e funzione in modo molto diverso. Neurohypophysis è derivato da ectoderma neurale e secerne l'ormone antidiuretico e l'ossitocina. Adenohypophysis proviene da di Rathke ed è responsabile per il rilascio degli ormoni tra cui l'ormone della crescita, prolattina, ormone stimolante la tiroide, ormone follicolo - stimolante, ormone luteinizzante, ormone adrenocorticotropo, e ormone distimolazione3,4,5.
La ghiandola pituitaria si riposa sulla superficie dorsale dell'osso sfenoidale (sella turcica) del cranio del mouse e viene fissata al pavimento del cervello da un gambo fragile. Lateralmente è circondato dai nervi di trigeminal e anteriormente dal chiasma ottico6,7. La ghiandola ha una forma ovale allungata con il suo asse perpendicolare a quella della testa. Sulla sua superficie dorsale, neurohypophysis e adenohypophysis può facilmente essere delimitate, con l'ex che occupa la regione dorsale mediale e il quest'ultimo che si estende lateralmente e ventralmente. Durante lo sviluppo postnatale, la dimensione della ghiandola pituitaria aumenta rapidamente nel primo mese dopo la nascita8,9. Tuttavia, la ghiandola pituitaria del mouse è ancora molto di piccole dimensioni con un diametro assi lunghi di ~ 3 mm e un peso medio di 1,9 mg in adulti10, diametro assi lunghi 2-2,5 mm al giorno postnatale 21 (P21) e solo l'1-1,5 mm in P0.
Una sezione coronale è preferita per visualizzare sia adenohypophysis e neurohypophysis in una sola fetta del pituitary del mouse. Tuttavia, alcune abilità tecniche sono necessario per ottenere soddisfazione sezioni coronali di ghiandole pituitarie da topi grazie alle sue dimensioni estremamente ridotte e distinta anatomia di sviluppo. In questo articolo dei video, dimostriamo come sezionare ghiandole pituitarie del mouse e preparare sezioni coronali pituitari alle diverse fasi di sviluppo.
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Protocol
topi C57BL/6 sono allevati in condizioni da organismi patogeni specifiche. Tutti i metodi sperimentali animali sono in conformità con le linee guida approvate dal comitato di etica presso Second Military Medical University e cura degli animali.
1. dissezione di postnatale sviluppando ghiandola pituitaria
- eseguire anestesia: posto topi neonatali (P0 - P5) su ghiaccio tritato per indurre ipotermia. Per topi più di 5 giorni di età, iniettare intraperitonealmente 5% uretano (30 µ l/g di peso corporeo) per indurre l'anestesia. Valutare le risposte per coda/tep pizzichi. Procedere solo dopo che il mouse non risponde agli stimoli nocivi.
- Secure il mouse nella posizione supina (sdraiato sulla schiena con la faccia verso l'alto) toccando delicatamente le zampe anteriori e si ad una superficie di lavoro che è capace di essere appuntato (cioè, polistirolo) all'interno di una cappa chimica.
- Eseguire perfusione perfusione.
- Tagliare la gabbia toracica del mouse con forbici chirurgiche per esporre il cuore (e altri organi toracici).
- Fissare il cuore che batte con il forcipe smussato e inserire un ago da 26G (0,45 mm) nel ventricolo di sinistra. L'ago è collegato a una siringa da 10 mL riempita con soluzione fisiologica eparinizzata tampone fosfato (PBS; completati con nitrito di sodio 5 mg/mL e 10 U/mL eparina, pH 7.4, riscaldare a 37 ° C prima dell'uso). Immediatamente tagliare l'atrio destro con forbice e cominciare a irrorare il corpo con il PBS caldo fino a quando il liquido esce l'atrio di destra è chiaro.
Nota: Circa 5-10 mL di PBS è necessario per topi neonatali e 10-20 mL di PBS per topi adulti. - Tenere l'ago in posizione e modificare un'altra siringa riempita con paraformaldeide al 4% (PFA; pH 7.4). Irrorare di 10 mL e 20 mL di fissativo per neonatale e P21 mouse, rispettivamente.
Attenzione: PFA è tossico. Può causare danni agli occhi e irritazioni respiratorie e pelle. Indossare guanti e lavorare sotto una cappa chimica.
- Decapitare il mouse PFA-fisso e tagliare l'osso del cranio aperto con le forbici.
- Sollevare delicatamente il hindbrain dalla base del cranio con piccole pinze. Al primo segno del turcica di sella, fermata di sollevamento, ma tenere il hindbrain, tagliare il gambo pituitario e fibre nervose che collega alla base del cervello con forbice. Questo passaggio è fondamentale per garantire che l'ipofisi non viene sollevato con il cervello.
- Quindi mantenere sollevamento cervello e rimuovere l'intero cervello per esporre completamente la ghiandola pituitaria. Tagliare la regione intera sella compreso la ghiandola pituitaria, i nervi di trigeminal laterali e il sotto osso sfenoidale con le forbici (circa 3 x 5 mm 2).
- Mettere il tessuto dissecato in un piatto di 35 mm o un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti contenenti 2 mL freddo 4% PFA (pH 7.4). Difficoltà il tessuto a 4 ° C per 40 min per P0 - P7 cadaveri, 1h per P14 cadaveri, 1,5 h per P21 - P28 cadaveri e 3 ore per adulti cadaveri.
- Ulteriore dissociazione del pituitary
- lavare il tessuto fisso con 10 mL di PBS, 5 cambi, 15 minuti ciascuno. Ghiandola pituitaria neonatale insieme ai relativi tessuti circostanti e il sotto dello sfenoide possono essere elaborati direttamente alla disidratazione. Tuttavia, dovrebbe essere dissociate ghiandole pituitarie dai topi più di 5 giorni più ulteriormente sotto un microscopio stereo.
- Mettere il tessuto fisso in un piatto di 35 mm contenente 1 mL di PBS. Per P5 - P14 cadaveri, rimuovere le membrane connettive tra i nervi e l'osso con una pinzetta e forbici e isolare accuratamente la ghiandola pituitaria insieme ai nervi di trigeminal laterale come un intero, ma lasciando il turcica di sella. La ghiandola isolata e nervi sono collegati da membrane di tessuto connettive con un " H "-l'aspetto ( Figura 1B).
- Per P21 e adulto cadaveri, rimuovere i nervi e tessuto connettive membrane intorno l'ipofisi e gratuito della ghiandola dai tessuti circostanti. Avvolgere il tessuto pituitario con carta velina di pulizia delle lenti e metterlo in una cassetta incasso.
Nota: Avvolgimento l'ipofisi piccolo con carta velina di pulizia aiuta a prevenire qualsiasi potenziale perdita di esemplari e preservare l'integrità del tessuto nella seguente procedura inclusione in paraffina. Potrebbe non essere necessario per avvolgere l'ipofisi se viene elaborato in una piccola bottiglia nella procedura cryo-incorporamento.
2. Embedding e sezionamento di paraffina
- disidratare gli esemplari in incorporamento cassette con soluzioni di etanolo di 50%, 65%, 75% e 95% per 15 minuti ciascuno. Successivamente disidratare con 3 cambi di etanolo puro, 3 min ciascuno per P0 - P4 ghiandole, 4 min ciascuno per P5 - P14 ghiandole e 5 minuti ciascuno per P21 e ghiandole più anziani. Trasparente con xilene, 3 cambia, 3 min ciascuno per P0 - P4 ghiandole, 4 min ciascuno per P5 - P14 ghiandole e 5 minuti ciascuno per P21 e ghiandole più anziani. Infiltrarsi con cera di paraffina fusa, 3 cambi, 7 min ciascuno per P0 - P4 ghiandole, e 8 min due volte seguito da 6 min una volta per P5 e più grandi ghiandole.
Nota: I parametri ottimali per l'elaborazione del tessuto possono essere regolati empiricamente. Per ottenere sezioni di alta qualità, disidratazione insufficiente o eccedenza dovrebbe essere evitato. Lo stesso vale per la compensazione del tessuto utilizzando xilene. - Orientamento quando si incorpora
- su un tessuto che sistema console, rimuovere il campione dal cassetto e inserirlo in uno stampo base riempito a metà con cera di paraffina fusa. Corretto orientamento della ghiandola pituitaria incorporamento è essenziale per soddisfare le sezioni coronali.
- Per P21 e adulto ghiandole pituitarie, posizionare la ghiandola pituitaria con suo breve asse perpendicolare alla superficie di fondo di uno stampo base (il piano di sezione). Utilizzare sfenoide ossa e nervi di trigeminal come limiti anatomici per P0 - P4 e P5 - P14 cadaveri, rispettivamente. Orientare gli esemplari con i loro nervi di trigeminal o lamina trasversale delle ossa sfenoide perpendicolare alla superficie di fondo di uno stampo base.
- Premere delicatamente il tessuto nella posizione desiderata con una pinzetta riscaldata fino a che la cera diventa semi-solida su una piastra di raffreddamento. Riempire lo stampo con cera di paraffina fusa. Consentire il blocco di paraffina raffreddare fino a quando la cera è completamente solidificata.
Nota: L'ipofisi al giorno embrionale 18,5 (E18.5) può essere trattata nello stesso modo come l'ipofisi neonatale. Ma i cadaveri (Rathke ' sacchetti s) più giovane di E16.5 dovrebbe essere incorporato con l'intera testa e orientato con l'asse sagittale (dalla bocca all'occipite) perpendicolare alla superficie di fondo di uno stampo base.
- Chill il blocco di paraffina a-20 ° C per 10-20 min e poi tagliati in sottili fette (4 µm spessore è preferibile) con un microtomo. Per ottenere sezioni coronali soddisfacente, mettere a punto la posizione dei blocchi di paraffina durante il sezionamento. Montare le fette di tessuto su vetrini polilisina-rivestito per evitare il distacco delle fette nelle procedure seguenti.
Nota: In alternativa, gli esemplari possono essere disidratati in 15%, 30% (P/V) soluzioni di saccarosio (in PBS) a 4 ° C, finché non si depositano sul fondo, incorporato in cryo-incorporamento composto utilizzando lo stesso metodo di orientamento e rapidamente congelato in ghiaccio secco. Quindi tagliare i blocchi di tessuto congelato fette di 8-10 µm utilizzando un criostato. La morfologia del cryo-sezioni, tuttavia, è spesso inferiore a sezioni di paraffina.
3. H & E macchiatura e immunofluorescenza etichettatura
- caldo le diapositive a fuoco bloccano a 55 ° C e Sparaffinatura con xilene, 2 cambi, 4 min. Disidratare i campioni con etanolo al 95% due volte e due volte, etanolo di 75% 3 min ogni. Lavare i vetrini con acqua distillata per 5 minuti su un agitatore.
- Per H & E colorazione, macchia le sezioni in soluzione di ematossilina di allume per 6 min, sciacquare in runnl'acqua del rubinetto ing per 2 min, differenziare con acqua ammoniaca 0,2% per 45 s e ri-sciacquare in acqua corrente per 2 min. Quindi disidratare le sezioni con etanolo al 95% per 1 min e macchia con eosina per 2 min in sequenza disidratare, chiaro e montare.
- Immunofluorescenza etichettatura
- trattare le sezioni con metanolo contenente 3% H 2 O 2 e 0,01% NaN 3 per 20 min a temperatura ambiente per inattivare le perossidasi endogene. Recuperare gli antigeni bollendo sezioni nel buffer di recupero (1 mM EDTA e 1 mM Tris-HCl, pH 7.4) in una pentola a pressione per 2 min. Incubare le sezioni con tampone bloccante (5% di siero di capra in PBS) per 30 min a 37 ° C.
- Incubare sezioni con anticorpo di coniglio anti-somatotropina (GH) (1:2, 000) o anticorpi di coniglio anti-proteina fibrillare acida (GFAP) (1:2, 000) diluiti in tampone bloccante durante la notte a 4 ° C.
- Incubare sezioni con anticorpo secondario (capra anti-coniglio IgG-HRP, 1: 300 in tampone bloccante) 35 min a 37 ° C.
- Amplificare i segnali con Biotinyl Tyramide (01:50 in soluzione salina tamponata Tris contenente 0,3% H 2 O 2) per 15 min a temperatura ambiente e visualizzare con streptavidina-Alexa594 o 488 (1: 300 in blocco buffer, 30 min, 37 ° C).
- Colorante di contrasto i nuclei con DAPI (50 mg/L in PBS) per 5 min a temperatura ambiente.
Nota: Potrebbe non essere necessario amplificare il segnale usando il sistema di amplificazione del segnale di microarray (TSA). In alternativa, un anticorpo secondario coniugato a fluorescenza può essere utilizzato per visualizzare il segnale.
- Acquisire immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di DAPI, Texas Red e set di filtri FITC, × 4/0,13 a × 40/0.75 obiettivi e fotocamera da 5.0 megapixel. Utilizzare il 360, 488 e 594 lunghezze d'onda laser nm per imaging DAPI, Alexa 488 - e sezioni macchiate di Alexa 594, rispettivamente. Ottimizzare la potenza del laser (0.8 è stato utilizzato generalmente) e tempo di esposizione ai livelli desiderati per ogni canale. Acquisire l'immagine sotto il controllo del software di acquisizione immagini e sovrapporre le immagini di fluorescenza successivamente utilizzando software di elaborazione immagine.
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Representative Results
Questo protocollo presenta un metodo per sezionare ghiandole pituitarie da topi di sviluppo. Per il mouse neonatale, le regioni di sella intera che contiene la ghiandola pituitaria, i nervi di trigeminal e la sottostante osso sfenoidale sono stati sezionati fuori dalla base del cranio. La ghiandola pituitaria piccola e delicata rimasto intatta durante il processo (Figura 1A). Per topi più di 5 giorni, le ghiandole pituitaria collegate ai nervi di trigeminal laterali erano quindi isolato. La struttura lorda della ghiandola pituitaria isolata dal P7 mouse è stata ben conservato (Figura 1B). Per il mouse di P21, la dimensione della ghiandola pituitaria è stata aumentata notevolmente rispetto a quella del mouse neonatale. La ghiandola pituitaria è stato correttamente isolata con danni non visibili durante la rimozione relativi tessuti circostanti (Figura 1).
Per visualizzare l'area massima di sia adenohypophysis e neurohypophysis in una sola fetta della ghiandola pituitaria, una sezione coronale è preferita. Le ghiandole pituitarie dissecate erano orientate correttamente per ottenere soddisfazione sezioni coronali. H & E ha mostrato la macchiatura ben conservata morfologia di sia adenohypophysis e neurohypophysis in ghiandole pituitarie P0, P7 e P21 (Figura 2).
Le fette trasformate anche erano compatibili con immunofluorescenza etichettatura. Ad esempio, adenohypophysis e neurohypophysis ha mostrato specifiche immunolabeling di GH e GFAP, rispettivamente (Figura 3).
Figura 1: dissezione delle ghiandole pituitarie sviluppo postnatale. Vista dorsale dissecate ghiandole pituitarie e tessuti circostanti dai topi P0, P7 e P21. A anteriore; P, posteriore; L, sinistra; R, destra; SB, osso sfenoidale; TN, nervo trigemino; AH, adenoipofisi; NH, neurohypophysis. Scala bar, 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: l'istologia dell'ipofisi mouse. Rappresentante H & E macchiatura le sezioni coronali pituitario da topi P0, P7 e P21. (A, Be C) sono viste a basso ingrandimento di cadaveri coronale. (D, Ee F) sono rispettivamente l'allargamento delle zone con cornice in (A, Be C). Scala bar = 1 mm di (A, B e C); e 20 µm (D, E e F). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: macchiatura immunofluorescente rappresentante su ghiandole pituitarie. (A) GH (rosso) specificamente è stata espressa nel adenohypophysis dai topi P7. (B) Magnified immagine della zona con cornice in GFAP A. (C) (verde) è stato specificamente espresso nella neurohypophysis dai topi P21. (D) Magnified immagine della zona con cornice in C. Nuclei sono stati macchiati con DAPI (blu). Barra della scala = 300 µm (A e C); e 30 µm (B e D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Per lo sviluppo di cadaveri murini, è stato tecnicamente difficile ottenere sezioni coronali corretto a causa della loro piccole e fragile caratteristiche e peculiarità anatomiche6,8. Alcuni gruppi di ricerca ha così scelto sagittale sezioni per analizzare la morfologia di embrionale e neonatale pituitario11,12. Però la sezione sagittale del pituitary è anche capace di risultati intermedi, anteriore e posteriori lobi in una sola fetta, sezione corona è altamente preferita come può mostrare una visualizzazione massima di questi tre lobi. In particolare, per gli studi di quantificazione, come determinazione del volume e area della ghiandola pituitaria e contando il numero di apoptosi e proliferazione delle cellule, sezioni coronali sono superiori alle sezioni sagittale in termini di loro rappresentante. Qui, presentiamo un metodo utile per sezionare le ghiandole pituitarie e preparare sezioni coronali pituitarie da topi di sviluppo.
Per evitare di danneggiare le ghiandole pituitaria durante il processo, diverse tecniche sono state utilizzate in questo protocollo. In primo luogo, topi vengono fissati mediante perfusione perfusione di formaldeide prima della dissezione. Questo fissativo non solo aiuta a preservare l'architettura dell'organo, ma anche per rimuovere i globuli rossi che spesso sfociano in auto fluorescenza13. In secondo luogo, la regione di sella intera viene sezionata per evitare di toccare la ghiandola pituitaria con qualsiasi strumento di duro-chirurgica. I tessuti circostanti contribuiscono a mantenere la ghiandola pituitaria nella sua posizione originale e anche servire come punti di riferimento per l'incorporamento di orientamento. Con questi metodi impiegati, più piccolo postnatale cadaveri da animali più giovani possono essere sezionate mentre riducendo la probabilità di danni indesiderati.
La procedura di dissezione in questo protocollo è anche applicabile per isolare pituitario murino che non è stata pre-fissata tramite aspersione. In tal caso, più attenzione dovrebbe essere presa per evitare danni indesiderati e la ghiandola dovrebbe anche essere dissecata nel minor tempo possibile.
Poiché cadaveri murini in via di sviluppo sono di dimensioni molto ridotte, è stato molto difficile ad orientarsi li correttamente quando l'incorporamento. Questo protocollo utilizza i nervi di trigeminal o sfenoide ossa come punti di riferimento, rendendo più facile la procedura di orientamento. Orientato correttamente cadaveri sono essenziali per realizzare sezioni coronali di soddisfare.
In sintesi, forniamo una dissezione pituitaria migliorata e l'incorporamento di protocollo, che è adatto per topi alle diverse fasi di sviluppo. Applicazione di queste procedure può ottenere soddisfazione sezioni coronali di ghiandole pituitarie murine da utilizzare per l'analisi di istologia di routine, immunoistochimica, ibridazione in situ e ricerca inerente allo sviluppo14.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni da National Natural Science Foundation of China (31201086, 31470759 e 31671219) e Shanghai Natural Science Foundation (12ZR1436900).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools/Equipment | |||
| Surgical scissors-straight | JinZhong | J21010 | can be purchased from other vendors |
| Fine scissors-strainght | JinZhong | WA1010 | can be purchased from other vendors |
| Blunt forceps | JinZhong | JD1020 | can be purchased from other vendors |
| Fine forceps | Dumont | RS-5015 | for isolation of the pituitary |
| 26G (0.45mm) needle | HongDa | for transcardial perfusion | |
| Syringe (1 mL) | BD | 300841 | can be purchased from other vendors |
| Syringe (10 mL) | BD | can be purchased from other vendors | |
| 35mm dish | Corning | 430165 | can be purchased from other vendors |
| Lens cleaning paper | ShuangQuan | can be purchased from other vendors | |
| Anatomical microscope | OLYMPUS | SZX-ILLB2-200 | can be purchased from other vendors |
| Embedding cassette | Thermo Fisher | 22-272423 | can be purchased from other vendors |
| Tissue embedding console system | KEDEE | KD-BM11 | can be purchased from other vendors |
| Microtome | Thermo Fisher | HM315R | can be purchased from other vendors |
| Superfrost-Plus slides | Thermo Fisher | 22-037-246 | can be purchased from other vendors |
| Cover glass | Thermo Fisher | 12-543 | can be purchased from other vendors |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | BH2-RFCA | can be purchased from other vendors |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Urethane | BBI | EB0448 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | for PBS |
| KCl | Sigma | P9541 | for PBS |
| Na2HPO4.12H2O | Sigma | 71650 | for PBS |
| K2HPO4 | Sigma | P2222 | for PBS |
| NaNO2 | Sigma | 237213 | |
| Heparin Sodium Injection | SPH | H31022051 | for perfusion saline |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Xylene | SCR | 10023418 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 8330 | |
| Hematoxylin | Sigma | H9627 | for H&E staining |
| Eosin Y | Sigma | E4009 | for H&E staining |
| rabbit anti growth hormone (GH) | National Hormone | for immunostaining | |
| antibody | Pituitary Program | ||
| Rabbit anti-mouse GFAP antibody | Sigma | G9269 | for immunostaining |
| Goat anti-rabbit IgG, HRP | Jackson | 111-035-003 | for immunostaining |
| TSA system | NEN Life Science Products | NEL700 | for immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher | S32356 | for immunostaining |
| Anti-FITC Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11090 | for immunostaining |
References
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