Summary
Vi presenterar ett protokoll för att dissekera hypofys och förbereda hypofysen koronalt avsnitt från att utveckla möss.
Abstract
Den hypofysen eller hypofysen är ett viktigt endokrina organ som utsöndrar hormoner som är väsentliga för homeostas. Den består av två körtlar med separat embryonala ursprung och funktioner — neurohypophysis och i adenohypofysen. Utveckla mus hypofysen är mycket liten och delikat med en långsträckt oval form. En koronalt avsnitt föredras att visa både adenohypofysen och neurohypophysis i en enda bit av mus hypofysen.
Målet med detta protokoll är att uppnå korrekt hypofysen koronalt avsnitt med välbevarad vävnad arkitekturer från att utveckla möss. I detta protokoll beskriver vi i detalj hur du dissekera och bearbetar hypofys ordentligt från att utveckla möss. Först, möss har fastställts genom transcardial perfusion av formaldehyd före dissektion. Sedan tillämpas tre olika dissekera tekniker för att erhålla intakt hypofys beroende på ålder av möss. För fostrets möss åldern embryonala dagar (E) 17,5-18,5 och nyfödda upp till 4 dagar, är hela sella regioner inklusive sphenoid benet, körtel och trigeminal nerver dissekeras. För valpar är åldern postnatal dagar (P) 5-14, hypofys ansluten med trigeminal nerver dissekerade som helhet. För möss över 3 veckor gammal, är hypofys noggrant dissekeras fri från de omgivande vävnaderna. Vi visar också hur till bädda in hypofys i en rätt orientering med omgivande vävnader som sevärdheter för att få tillfredsställa koronalt avsnitt. Dessa metoder är användbara i att analysera histologiska och utvecklingsmässiga egenskaper hos hypofys utveckla möss.
Introduction
Den hypofysen eller hypofysen är ett viktigt endokrina organ som utsöndrar hormoner som är väsentliga för homeostas1,2. Anatomiskt, är hypofysen en '' två-i-ett '' struktur bestående av neurohypophysis och i adenohypofysen. Dessa delar har olika embryonala ursprung och funktion mycket olikt. Neurohypophysis härrör från neural ektodermet och utsöndrar oxytocin och Antidiuretiskt hormon. I adenohypofysen påbörjar från Rathkes påse och ansvarar för frisättning av hormoner inklusive tillväxthormon, prolaktin, sköldkörtel - stimulerande hormon, follikelstimulerande hormon, luteiniserande hormon, adrenokortikotropt hormon, och melanocytstimulerande hormon –3,4,5.
Hypofysen vilar på den dorsala ytan av sphenoid benet (sella turcica) mus skallbasen och är kopplad till golvet i hjärnan av en bräcklig stjälk. Det omges sidled av trigeminal nerver och anteriorly av den optiska chiasm6,7. Körteln har en långsträckt oval form med dess längdaxel vinkelrätt mot det av huvudet. På dess dorsala ytan, neurohypophysis och adenohypofysen kan enkelt avgränsas, med den förstnämnda ockuperar dorsala mediala regionen och den senare förlängning sidled och ventralt. Under födsel, storleken på hypofysen ökar snabbt i den första månaden efter födseln8,9. Mus hypofysen är dock fortfarande mycket liten i storlek med en genomsnittlig vikt på 1,9 mg och en lång-axel diameter ~ 3 mm vuxen10, en lång-axel diameter på 2-2,5 mm postnatal dag 21 (P21) och bara 1-1.5 mm på P0.
En koronalt avsnitt föredras att visa både adenohypofysen och neurohypophysis i en enda bit av mus hypofysen. Dock krävs vissa tekniska färdigheter för att få tillfredsställande koronalt avsnitt av hypofys från att utveckla möss på grund av dess exceptionellt små storlek och distinkta anatomi. I denna video artikel visar vi hur du dissekera mus hypofys och förbereda hypofysen koronalt avsnitt vid olika utvecklingsstadier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
C57BL/6 möss föds i specifika patogenfria villkor. Alla djur experimentella metoder är i överensstämmelse med de riktlinjer som godkänts av djur vård och etiska kommittén vid andra militära medicinska universitet.
1. dissektion av Postnatal utveckling hypofysen
- utför anestesi: placera neonatala möss (P0 - P5) på krossad is att inducera hypotermi. För möss äldre än 5 dagar gammal, injicera 5% uretan (30 µL/g kroppsvikt) intraperitonealt inducera anestesi. Bedöma svaren att svansen toe nypor. Fortsätt först efter att musen inte svarar att de skadliga stimuli.
- Säkra musen i ryggläge (liggande på rygg med ansiktet uppåt) genom att försiktigt tejpa framtassarna och hindpaws till en arbetsyta som kan vara fäst (dvs. frigolit) inuti en kemisk spiskåpa.
- Utför transcardial perfusion.
- Klipp mus bröstkorgen med kirurgisk sax att exponera hjärtat (och andra bröstkorgens organ).
- Säkra med bultande hjärta med trubbig pincett och infoga en 26G (0,45 mm) nålen i vänster kammare. Nålen är kopplad till en 10 mL spruta fylld med hepariniserad fosfatbuffrad saltlösning (PBS; kompletteras med 5 mg/mL natriumnitrit och 10 U/mL heparin, pH 7,4, Värm till 37 ° C före användning). Omedelbart klippa höger förmak med fina sax och börja att BEGJUTA kroppen med varm PBS tills vätskan spännande höger förmak är klart.
Obs: Ungefärlig 5-10 mL PBS behövs för neonatala möss och 10-20 mL PBS för vuxna möss. - Hålla nålen på plats och ändra till en annan spruta fylld med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA; pH 7,4). BEGJUTA 10 mL och 20 mL av fixativ för neonatal och P21 mus, respektive.
Varning: PFA är giftiga. Det kan orsaka hud och respiratoriska irritationer och ögonskador. Använd handskar och arbetar under en kemisk huva.
- Halshugga PFA-fast musen och uppskuren skallbenet med sax.
- Lyft försiktigt hindbrain från basen av skallen med liten pincett. Vid första tecken på sella turcica, stop lyft men håll hindbrain, skär hypofysen stjälk och nervfibrer som förbinder till basen av hjärnan med fina sax. Detta steg är avgörande för att säkerställa att hypofysen inte lyfts bort med hjärnan.
- Sedan hålla lyft hjärnan och ta bort hela hjärnan för att exponera hypofysen fullt. Skär hela sella regionen inklusive hypofysen, laterala trigeminal nerver, och den under sphenoid benet med sax (ca 3 x 5 mm 2).
- Sätta dissekerade vävnaden i en 35 mm maträtt eller ett väl 6-well platta innehållande 2 mL kallt 4% PFA (pH 7,4). Fixa vävnaden vid 4 ° C i 40 min för P0 - P7 nekrohypofyser, 1 h för P14 nekrohypofyser, 1,5 h för P21 - P28 nekrohypofyser och 3 h för vuxen nekrohypofyser.
- Ytterligare dissociation av hypofys
- tvätta fasta vävnaden med 10 mL PBS, 5 ändringar, 15 min varje. Neonatal hypofysen tillsammans med dess omgivande vävnader och under sphenoid benet kan bearbetas direkt till uttorkning. Dock hypofys från möss som är äldre än 5 dagar bör särskiljas ytterligare i stereo Mikroskop.
- Sätta fast vävnaden i en 35 mm maträtt innehållande 1 mL PBS. P5 - P14 nekrohypofyser, ta bort de bindväv membran mellan nerver och ben med fin pincett och sax och noggrant isolera hypofysen tillsammans med laterala trigeminal nerver som helhet men lämnar sella turcica. De isolerade körtel och nerver förbinds av bindväv membran med en " H "-gillar utseende ( figur 1B).
- För P21 och vuxen nekrohypofyser, ta bort nerver och bindväv membran runt hypofysen och gratis körteln från de omgivande vävnaderna. Wrap hypofysen vävnaden med linsrengöringsvätska mjukpapper och Lägg den i en inbäddning kassett.
Obs: Inslagning tiny hypofysen med linsrengöringsvätska mjukpapper hjälper till att förhindra potentiella förlust av exemplar och bevara vävnad integritet i följande paraffin-inbäddning. Det kan inte vara nödvändigt att Linda hypofysen om den bearbetas i en liten flaska i förfarandet cryo-inbäddning.
2. Paraffin inbäddning och Sectioning
- torkar exemplaren i inbäddning kassetter med 50%, 65%, 75% och 95% etanol lösningar för 15 min varje. Därefter torka med 3 ändringar av ren etanol, 3 min varje för P0 - P4 körtlar, 4 min varje för P5 - P14 körtlar och 5 min varje för P21 och äldre körtlar. Klart med xylen, 3 ändringar, 3 min varje för P0 - P4 körtlar, 4 min varje för P5 - P14 körtlar och 5 min varje för P21 och äldre körtlar. Infiltrera med smält paraffin vax, 3 förändringar, 7 min varje för P0 - P4 körtlar, och 8 min två gånger följt av 6 min en gång för P5 och äldre körtlar.
Obs: De optimala parametrarna för vävnad bearbetning kan empiriskt justeras. För att få hög kvalitet sektioner, bör otillräcklig eller över dehydrering undvikas. Samma sak gäller för clearing vävnaden med xylen. - Orientering vid inbäddning
- på en vävnad inbäddning konsolen system, ta bort preparatet från kassetten och placera den i en bas mögel halva fylld med smält paraffin vax. Rätt orientering av inbäddning hypofysen är nödvändigt för att tillgodose koronalt avsnitt.
- För P21 och vuxen hypofys, placera hypofysen med dess kort axel vinkelrät mot undersidan av en bas mögel (avsnittsplanet). Använd sphenoid ben trigeminal nerver som anatomiska landmärken för P0 - P4 och P5 - P14 nekrohypofyser, respektive. Orientera exemplar med deras trigeminal nerver eller övergripande lamina av sphenoid ben vinkelrät mot undersidan av en bas mögel.
- Håll försiktigt vävnaden i önskad position med värmde fin pincett tills vaxet blir halvfast på en svalkande tallrik. Fyll formen med smält paraffin vax. Tillåta paraffin blocket svalna tills vaxet är helt stelnat.
Obs: Hypofysen på embryonala dag 18,5 (E18.5) kan behandlas på samma sätt som neonatal hypofysen. Men nekrohypofyser (Rathke ' s påsar) yngre än E16.5 bör vara inbäddade med hela huvudet och orienterade med sagittala axeln (från mun till nackknöl) vinkelrätt mot undersidan av en bas mögel.
- Chill paraffin blocket vid-20 ° C i 10-20 min och skär det i tunna skivor (4 µm tjocklek föredras) med en mikrotom. För att få tillfredsställande koronalt avsnitt, finjustera positionen för paraffinblock vid snittning. Montera vävnad skivor på polylysine-belagda glas diabilder att förhindra avlossning av skivor i följande procedurer.
Obs: Alternativt exemplar kan vara uttorkad i 15%, 30% (W/V) sackaros lösningar (i PBS) vid 4 ° C tills de sjunker till botten, inbäddade i cryo-inbäddning förening med samma orientering metod, och snabbt frusen på torris. Sedan skär fryst vävnad blocken i skivor 8-10 µm med hjälp av en kryostaten. Morfologi av cryo-sektioner, men är ofta sämre än paraffin avsnitt.
3. H & E färgning och immunofluorescens märkning
- varm glasen på en värme blockera vid 55 ° C och dewax med xylen, 2 förändringar, 4 min. Torka av prov med 95% etanol två gånger och 75% etanol två gånger, 3 min varje. Tvätta i bilderna med destillerat vatten för 5 min på en skakapparat.
- För H & E färgning, fläcken avsnitten i Alun hematoxylin lösning för 6 min, skölj i running kranvatten i 2 min, skilja med 0,2% ammoniak vatten för 45 s, och åter skölj i rinnande vatten i 2 min. Sedan torkar avsnitten med 95% etanol för 1 min och fläcken med eosin för 2 min. sekventiellt torkar ut, rensa och montera.
- Immunofluorescens märkning
- behandla avsnitten med metanol som innehåller 3% H 2 O 2 och 0,01% NaN 3 för 20 min i rumstemperatur att inaktivera endogena peroxidaser. Hämta antigener genom kokning sektioner i hämtning bufferten (1 mM EDTA och 1 mM Tris-HCl, pH 7,4) i en tryckkokare i 2 min. Inkubera avsnitten med blockerande buffert (5% get serum i PBS) under 30 minuter vid 37 ° C.
- Inkubera sektioner med kanin anti tillväxthormon (GH) antikroppar (1:2, 000) eller kanin anti-glial fibrillary sura protein (Fredsgenomförande) antikroppar (1:2, 000) utspätt i blockerande buffert över natten vid 4 ° C.
- Inkubera sektioner med sekundär antikropp (get anti kanin IgG-HRP, 1:300 i blockerande buffert) i 35 min på 37 ° C.
- Förstärker signalerna använder Biotinyl Tyramide (1:50 i Tris buffrad koksaltlösning innehållande 0,3% H 2 O 2) under 15 minuter vid rumstemperatur och visualisera med streptividin-Alexa594 eller 488 (1:300 i blockerande buffert, 30 min, 37 ° C).
- Counterstain atomkärnor med DAPI (50 mg/L i PBS) under 5 minuter i rumstemperatur.
Obs: Det kan inte vara nödvändigt att förstärka signalen med Tyramide Signal amplifiering (TSA) system. Alternativt en sekundär fluorescens-konjugerad antikropp kan användas för att visualisera signalen.
- Förvärva bilder med fluorescens Mikroskop utrustat med DAPI, Texas rött och FITC filteruppsättningar, × 4/0,13 till × 40/0,75 mål och 5.0 megapixelkamera. Använda 360, 488 och 594 nm laser våglängder för imaging DAPI, Alexa 488- och Alexa 594-färgade sektioner, respektive. Optimera lasereffekten (0,8 användes allmänt) och exponeringstid till önskade nivåer för varje kanal. Fånga bilden under kontroll av förvärvet bildbehandlingsprogram och overlay fluorescens bilderna därefter med programvara bildbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll presenterar en metod för att dissekera hypofys från att utveckla möss. För neonatal musen, Regionkommittén hela sella som innehåller hypofysen, trigeminusneuralgi nerverna och undersidan sphenoid benet var dissekeras ut från skallbasen. Små och ömtåliga hypofysen förblivit intakt under processen (figur 1A). För möss äldre än 5 dagar, hypofys bifogas laterala trigeminal nerverna då var isolerade. Grov struktur i hypofysen isolerade från P7 mus var väl bevarad (figur 1B). För P21 musen ökades storleken på hypofysen anmärkningsvärt jämfört med neonatal musen. Hypofysen isolerades framgångsrikt med osynliga skador medan du tar bort dess omgivande vävnader (figur 1 c).
Om du vill visa den maximala regionen både adenohypofysen och neurohypophysis i en enda bit av hypofysen, är en koronalt avsnitt att föredra. Dissekerade hypofys orienterades ordentligt att uppnå tillfredsställande koronalt avsnitt. H & E färgning visade väl bevarade morfologi av både adenohypofysen och neurohypophysis i P0, P7 och P21 hypofys (figur 2).
Bearbetade skivor var också kompatibel med immunofluorescens märkning. Som ett exempel, adenohypofysen och den neurohypophysis visade specifika immunolabeling av GH och Fredsgenomförande, respektive (figur 3).
Figur 1: dissekering av postnatal utveckling hypofys. Dorsala över dissekerade hypofys och omgivande vävnader från P0, P7 och P21 möss. A, främre; P, bakre; L, vänster; R, rätt; SB, sphenoid ben; TN, trigeminusnerven; AH, adenohypofysen; NH, neurohypophysis. Skala barer, 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: histologi av mus hypofys. Representant H & E färgning på hypofysen koronalt avsnitt från P0, P7 och P21 möss. (A, Boch C) är låg förstoring utsikt över koronalt nekrohypofyser. (D, Eoch F) är utvidgningen av de inramade i (A, Boch C) respektive. Skala barer = 1 mm i (A, B och C); och 20 µm (D, E och F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representanten Immunofluorescerande färgning på hypofys. (A) GH (röd) uttrycktes specifikt i adenohypofysen från P7 möss. (B) förstorad bild av det inramade området i A. (C) Fredsgenomförande (grön) uttrycktes specifikt i neurohypophysis från P21 möss. (D) förstorad bild av inramade området i C. kärnor var fläckade av DAPI (blå). Skalstapeln = 300 µm (A och C); och 30 µm (B och D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att utveckla murina nekrohypofyser, har det varit tekniskt svårt att få ordentlig koronalt avsnitt på grund av sina små och ömtåliga funktioner och unika anatomiska egenskaper6,8. Vissa forskargrupper valde därför mid-sagittal avsnitt att analysera morfologi av embryonala och neonatal hypofysen11,12. Dock avsnittet mid-sagittal i hypofysen är också kapabel att visar främre, mellanliggande och bakre lober i en cirkelsektor, avsnittet koronalt är mycket föredra som kan visa en maximal överblick av dessa tre lober. I synnerhet för kvantifiering studier, såsom bestämning av volymen och området av hypofysen och räkna antalet apoptotiska och frodas celler, är koronalt avsnitt överlägsna mid-sagittal sektioner i form av deras representant. Här presenterar vi en metod som är användbar att dissekera hypofys och förbereda hypofysen koronalt avsnitt från att utveckla möss.
Undvik att skada hypofysen under processen, har flera tekniker använts i detta protokoll. Först, möss har fastställts genom transcardial perfusion av formaldehyd före dissektion. Detta fixativ hjälper inte bara att bevara organ arkitekturen men också att ta bort röda blodkroppar vilket ofta resulterar i automatisk fluorescens13. Det andra är regionen hela sella dissekeras för att undvika att röra vid hypofysen med någon hård-kirurgiska verktyg. Omgivande vävnader hjälpa till att hålla hypofysen i sin ursprungliga position och även fungera som sevärdheter för inbäddning orientering. Med dessa metoder, kan mindre postnatal nekrohypofyser från yngre djur vara dissekerade samtidigt minska sannolikheten för oönskad skador.
Dissektion förfarandet i detta protokoll gäller även isolera murina hypofysen som inte har åtgärdats före av perfusion. I så fall bör vara mer försiktig att undvika oönskad skada och körteln bör också vara dissekeras så snabbt som möjligt.
Eftersom utvecklingsländerna murina nekrohypofyser är mycket liten i storlek, har det varit mycket svårt att orientera dem ordentligt vid inbäddning. Detta protokoll använder trigeminal nerver eller sphenoid ben som sevärdheter, vilket gör orientering stegen mycket lättare. Korrekt orienterade nekrohypofyser är avgörande för att uppnå tillfredsställande koronalt avsnitt.
Sammanfattningsvis tillhandahåller vi en förbättrad hypofysen dissektion och inbäddning protokollet, som är lämplig för möss på olika utvecklingsstadier. Tillämpningen av dessa förfaranden kan få tillfredsställande koronalt avsnitt av murina hypofys att användas för analys av rutinmässiga histologi, immunohistokemi, i situ hybridisering och utvecklingsmässiga forskning14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av anslag från National Natural Science Foundation Kina (31201086, 31470759 och 31671219) och Shanghai naturvetenskap Foundation (12ZR1436900).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools/Equipment | |||
| Surgical scissors-straight | JinZhong | J21010 | can be purchased from other vendors |
| Fine scissors-strainght | JinZhong | WA1010 | can be purchased from other vendors |
| Blunt forceps | JinZhong | JD1020 | can be purchased from other vendors |
| Fine forceps | Dumont | RS-5015 | for isolation of the pituitary |
| 26G (0.45mm) needle | HongDa | for transcardial perfusion | |
| Syringe (1 mL) | BD | 300841 | can be purchased from other vendors |
| Syringe (10 mL) | BD | can be purchased from other vendors | |
| 35mm dish | Corning | 430165 | can be purchased from other vendors |
| Lens cleaning paper | ShuangQuan | can be purchased from other vendors | |
| Anatomical microscope | OLYMPUS | SZX-ILLB2-200 | can be purchased from other vendors |
| Embedding cassette | Thermo Fisher | 22-272423 | can be purchased from other vendors |
| Tissue embedding console system | KEDEE | KD-BM11 | can be purchased from other vendors |
| Microtome | Thermo Fisher | HM315R | can be purchased from other vendors |
| Superfrost-Plus slides | Thermo Fisher | 22-037-246 | can be purchased from other vendors |
| Cover glass | Thermo Fisher | 12-543 | can be purchased from other vendors |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | BH2-RFCA | can be purchased from other vendors |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Urethane | BBI | EB0448 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | for PBS |
| KCl | Sigma | P9541 | for PBS |
| Na2HPO4.12H2O | Sigma | 71650 | for PBS |
| K2HPO4 | Sigma | P2222 | for PBS |
| NaNO2 | Sigma | 237213 | |
| Heparin Sodium Injection | SPH | H31022051 | for perfusion saline |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Xylene | SCR | 10023418 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 8330 | |
| Hematoxylin | Sigma | H9627 | for H&E staining |
| Eosin Y | Sigma | E4009 | for H&E staining |
| rabbit anti growth hormone (GH) | National Hormone | for immunostaining | |
| antibody | Pituitary Program | ||
| Rabbit anti-mouse GFAP antibody | Sigma | G9269 | for immunostaining |
| Goat anti-rabbit IgG, HRP | Jackson | 111-035-003 | for immunostaining |
| TSA system | NEN Life Science Products | NEL700 | for immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher | S32356 | for immunostaining |
| Anti-FITC Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11090 | for immunostaining |
References
- Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P.
- Haedo, M. R., et al. Regulation of pituitary function by cytokines. Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).
- Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks. Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).
- Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. Pituitary gland development: an update. Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).
- Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse. Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).
- Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa. Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).
- Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland. AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).
- Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period. Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).
- Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification. Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).
- Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis. J Vis Exp. (46), (2010).
- Budry, L., et al. Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).
- Wilson, D. B., Wyatt, D. P. Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice. Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).
- Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).
- Cao, D., et al. ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification. Nat Commun. 7, 11121 (2016).
