Summary
وكانت النظير الغضاريف والجلد بيوبرينتيد باستخدام بيوينك نانوسيلولوسي-الجينات على أساس. كانت سيلولاريزيد في بيوينكس قبل الطباعة عن طريق وحدة خلط سلبي لخطوة واحدة. وقد عرضت بنيات سيلولاريزيد أن يكون موحدا وصلاحية عالية، ويحمل علامات إيجابية للتمايز.
Abstract
بيوبرينتينج تقنية قوية للتصنيع السريع واستنساخه من بنيات للأنسجة التطبيقات الهندسية. في هذه الدراسة، كانت ملفقة النظير الغضاريف والجلد بعد بريسيلولاريزيشن بيوينك استخدام سلبية رواية خلط تقنية وحدة. ووضعت هذه التقنية بهدف تبسيط الخطوات التي تنطوي عليها خلط من تعليق خلية في بيوينك عالية لزوجة. حل خيوط المودعة من خلال بيوبرينتينج يستلزم ضمان التوحيد في توزيع الخلايا قبل الطباعة لتجنب ترسب المناطق دون خلايا أو الاحتفاظ بكتل الخلايا الكبيرة التي يمكن أن تسد الإبرة. نحن إثبات القدرة على سرعة مزيج تعليق خلية مع بيوينك قبل بيوبرينتينج النظير الغضاريف والجلد. يمكن استزراع كلا النظير الأنسجة لمدة تصل إلى 4 أسابيع. أثبت التحليل النسيجي بقاء الخلية وترسب من علامات محددة المصفوفة خارج الخلية (ECM) الأنسجة مثل الجليكوزامينوجليكان (الكمامات) والكولاجين وأنا على التوالي.
Introduction
في السنوات الأخيرة، أصبحت التكنولوجيا ثلاثية الأبعاد (3D) بيوبرينتينج متاحة للباحثين، وتسمح هذه التقنية أصبحت تستخدم على نطاق واسع لتصنيع النظير الأنسجة. بيوبرينتينج وعود لإحداث ثورة في البحوث الطبية الحيوية بتسهيل تصنيع الأنسجة المتعددة الأوجه بنيات سريع وقابل للتكرار. يضع جوهر التكنولوجيا بيوبرينتينج في القدرة على التحكم بدقة في ترسب المواد الحيوية (المعروفة باسم بيوينكس) في ثلاثة أبعاد. يسمح هذا جيل السقالات المعقدة مع مناطق متميزة من التراكيب مصفوفة والعوامل النشطة بيولوجيا، والخلايا التي يمكن إيجاز أدق بنية الأنسجة الأصلية.
وقد استخدمت بيوبرينتينج لتلفيق ثوابت للعديد من التطبيقات الأنسجة بما في ذلك الغضروف1والجلد2، العضلات3، وعظم4. هذه الأنسجة جذابة بيوبرينتينج بسبب بهم الجوهرية striated الصغرى-أبنية مناسبة للتذكير عن طريق ترسيب طبقة بطبقة. على وجه الخصوص، تمتلك الجلد5هيكل متعدد الطبقات محددة جيدا، ومناسبة للتصنيع من خلال تقنيات ترسيب طبقة بطبقة مثل بيوبرينتينج. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام بيوبرينتينج لإنشاء بنيات التي تملك أبعاد التشريحية اللازمة وعيب الأشكال لإصلاح الأنسجة. القدرة على توليد الحيوية مع المريض محددة الحجم والشكل6 يمكن البدء بمعالجة الطلب على إصلاحات جزئية للعديد من الأنسجة بما في ذلك سبيل المثال لا الحصر تشوهات العظام وتلف الغضروف، والآفات الجلدية القدر الذي يختلف من المريض للمريض.
في هذه الدراسة، كانت ملفقة اثنين النظير الأنسجة (الجلد والغضروف المفصلي) من خلال بيوبرينتينج بيوينكس بريسيلولاريزيد. ضمان كاف في مزج بيوينك مع تعليق خلية يمكن أن تكفل توزيع خلية موحدة مع المحافظة على بقاء الخلية يمكن أن يشكل تحديا. غالباً ما تكون عالية اللزوجة بيوينكس مناسبة بيوبرينتينج عن طريق البثق وتتطلب لذلك خلط واسعة النطاق لضمان مزيج متجانس. يمكن أن تحدث تحت ظروف قاسية خلط الضرر الميكانيكي للخلايا وتؤثر سلبا على استمرارية. وقد أظهرت الدراسات أن معظم موت الخلايا أثناء عملية الطباعة النافثة للحبر يحدث أثناء إعداد مثل خلط7،8. بينما خلط التقليدية مع الانفعالات9 قد تكون كافية للزوجة منخفضة بيوينكس مناسبة ل الطباعة النافثة للحبر10، خلط للخلايا في بيوينك لزوجة عالية أكثر ملاءمة لقذف بيوبرينتينج أكثر صعوبة. التصدي لهذه الحاجة، أصبح استخدام خلط فوهات أكثر شعبية للمزج بين بيوينكس أثناء عملية الطباعة11. هذه خلاطات أيضا تستخدم على نطاق واسع في البحوث ميكروفلويديكس حيث خلط السوائل مع انخفاض عدد رينولدز هو المهم12. تتيح الاستفادة من عملية خلط مستمرة مزيج تعليق خلية في بيوينك للتوحيد أثناء عملية الطباعة. ومع ذلك، منذ تعليق خلية تمتلك اللزوجة منخفضة مقارنة بيوينك، سوف تنشأ صعوبات في منع ترسب الخلايا أثناء الطباعة عملية9،،من1314. بدلاً من ذلك، قد خلط من الخلايا في بيوينك قبل الطباعة إلى معالجة هذه المسألة.
وللحد من موت الخلايا أثناء مزج في بيوينك، قمنا بتطوير تقنية تستند إلى وحدة خلط سلبي لمزج الخلايا في بيوينك في أقل عدد ممكن من الخطوات. خلط الفوضى التي تم إنشاؤها من خلال تدفق المواد عن طريق وحدة خلط غير كافية لتكاثر مزيج هذين العنصرين معا15،16. ووضع هذا الأسلوب أساسا لتبسيط المزج بين أي تعليق خلية مع أي بيوينك أي مناسبة لقذف بيوبرينتينج. تم تصغير عدد الخطوات في عملية خلط للقضاء على التباين المستخدم للمستخدم في الخلط. خطوات خلط المفرطة يمكن أن تكون مضيعة للوقت وغير قابل للتطبيق على جميع بيوينكس، لا سيما عندما يتعلق الأمر بالخلايا. الثانوية، ونحن تهدف إلى تطوير عملية خلط مكتفية ذاتيا الحفاظ على العقم وتقليل الخسائر في عينة.
في هذه المخطوطة، ندلل على المزج بين تعليق خلية مع بيوينك استخدام سلبية خلط تقنية وحدة يقلل من مناولة وينتج عنه توزيع خلية عالية الجدوى وموحدة. وتستخدم هذه بيوينكس بريسيلولاريزيد ثم إلى بيوبرينت بناء الغضروف أو الجلد مع واحد أو اثنين من أنواع الخلايا على التوالي التي تستزرع لمدة تصل إلى 6 أسابيع. بيوينك تستخدم هو مزيج من الجينات-نانوسيلولوسي، الذي سبق قد أظهرت مدى ملاءمتهم بيوبرينتينج1.
Protocol
هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة أخلاقيات البحوث البشرية في جامعة تشالمرز.
ملاحظة: جميع الخطوات التي يتعين القيام بها داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية عقيمة.
1-إعداد المواد الاستهلاكية، وبيوينك، والخلايا
- الحصول على اثنين من المحاقن، وحقنه واحدة (الشكل 1) لتعليق خلية، بينما المحاقن الأخرى بيوينك (الشكل 1ب).
- الحصول على عقيمة سلبي خلط وحدة (الشكل 1ج) التي يمكن أن تقترن بالحقن المزدوج عبر اتصال قفل اللوير.
- الحصول على وحدة الاستغناء عن (الشكل 1د) التي يمكن قذف كمية من المحاقن المعقمة اثنين في أن واحد بمعدل الخاضعة للرقابة.
ملاحظة: نسبة خلط المستخدمة في هذه الدراسة هو 10:1. ولذلك، استخدام المحاقن 12 مل وحقنه 1 مل حسبما تقتضيه وحدة خلط 10:1. - الحصول على خرطوشة عقيمة (الشكل 1ﻫ) وموصل قفل اللوير أنثى والإناث عقيمة إلى مختلطة مباشرة تعليق بيوينك وخلية في.
- الحصول على أو إعداد في بيوينك لمزج مع تعليق خلية.
ملاحظة: استخدمت في هذا البروتوكول، بيوينك نانوسيلولوسي/الجينات على أساس. هذا بيوينك cross-linked عن طريق إضافة حل عقيم 100 مم كاكل2 وظيفة الطباعة. - فصل الخلايا باستخدام حل التربسين/يدتا 0.5% وحساب إجمالي عدد الخلايا باستخدام أسلوب الاستبعاد الأزرق تريبان17.
ملاحظة: في هذا البروتوكول، وقد استخدمت الليفية البشرية. - تحديد كثافة الخلية ما هو المطلوب في بناء المطبوعة النهائية. حساب المعادلات التالية باستخدام تركيز الخلايا المقطوعة التي يجب أن تضعف لتحقيق هذا الهدف الخلية الأخيرة الكثافة.
ملاحظة: في هذا البروتوكول، استخدمت بكثافة خلية الأخيرة من 5 × 106 خلايا/مل.- حدد تركيز خلايا المطلوب للتجارب: جخلية (خلايا/مل).
- حساب كمية اللازمة، بيوينك Vبيوينك، استناداً إلى العدد الإجمالي لثوابت المطلوب:
Vبيوينك = Vبناء × نكونتروكتس
ملاحظة: على سبيل المثال، هو حجم بيوينك لبناء 100 ميليلتر. إذا كان يتم طباعة 30 بنيات، ثم وحدة التخزين بيوينك حاجة 3 مل. - حساب عدد الخلايا المطلوبة:
خلايا من N = Cخلية (× 1.1 Vبيولينك) - ريسوسبيند الخلايا (خلايامن N) في 1/10th حجم بيوينك:
Vتعليق خلية = 0.1 × Vبيولينك
ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كان تبيوينك = 3 مل، ثم الخامستعليق خلية = 0.1 × 3 مل = 0.3 مل
2-خلط تعليق خلية وبيوينك
- نقل تعليق خلية في محقن تعليق خلية.
- نقل بيوينك لحقنه أخرى أو الحصول على حقنه تحتوي على بيوينك.
- سحب المكبس حقنه بيوينك وإدراج المحاقن في الاستغناء عن وحدة. ضع وحدة رأسياً مع نظام قفل الموصل صعودا (الشكل 1f1).
- سحب المكبس المحاقن الخلية مرة أخرى لمدة مماثلة كحقنة بيوينك وإدراج في الاستغناء عن وحدة (f2منالشكل 1).
- إرفاق كل المحاقن وحدة خلط بالتواء الموصلات قفل اللوير (الشكل 1f3).
- رئيس الوزراء نظام الاختلاط عن طريق دفع على الاستغناء عن وحدة لقذف الهواء في المحاقن. وقف فتيلة قبل الحل التوصل إلى قفل اللوير (g4منالشكل 1).
- بعد فتيلة، إرفاق ملء خرطوشة إلى نهاية وحدة خلط عبر موصل قفل اللوير (الشكل 1g5). تأكد من أن المكبس في ملء خرطوشة أسفل قبل الإلحاق.
- ضغط ببطء (الشكل 1h6) الاستغناء عن الوحدة من مزيج تعليق خلية وبيوينك معا في الخرطوشة (الشكل 1i7).
- دفع المكبس في خرطوشة تعبئة إلى الأسفل مع تلميح بيبيت عقيمة الاتصال الخليط خلية بيوينك بعد خلط. الاحتفاظ بصرفها حتى ضغط لضمان ليس هو مقذوف الخليط خلية/بيوينك مرة أخرى إلى وحدة خلط.
- كاب الخرطوشة، واضغط برفق على سطح العمل لنقل أي فقاعات الهواء إلى الجزء العلوي من الخرطوشة (نهاية المكبس).
ملاحظة: عند هذه النقطة، هذا الخليط خلية/بيوينك جاهزة للطباعة. سيتم تخطيط المقاطع التالية تطبيقات محددة وإجراءات الطباعة.
3-تحديد صلاحية الخلية باستخدام وحدة خلط خلط ملعقة اليدوي بالمقارنة
- فصل الليفية البشرية (مرور 7) مع حل التربسين/يدتا 0.5% في التقاء 80% وعدد ريسوسبيند في الثقافة المتوسطة في كثافة الخلية كافية لتحقيق تركيز نهائي بعد المزج مع بيوينك (01:10 نسبة الخلية: بيوينك) من 5 × 10 6 خلايا/مل.
- دمج الخلايا إلى بيوينك استخدام أما السلبي خلط وحدة تقنية (الخطوة 2) أو عن طريق ملعقة لتقييم أثر كل التقنيات على بقاء الخلية.
- تندمج الخلايا في بيوينك استخدام السلبي خلط وحدة تقنية 1، 2، أو 3 مرات قبل صرفها في قالب العابرة للربط باستخدام 100 مم كاكل2.
ملاحظة: لإجراء يمزج إضافية، مزيج الخلية/بيوينك مباشرة في حقنه بدلاً من خرطوشة. ثم ريمكس المزيج من خلال وحدة خلط يتبع البروتوكول السابق لكن بدون عنصر حقنه في الخلية. - تندمج الخلايا في بيوينك منفصلة استخدام دليل الميكانيكية الاختلاط عن طريق ملعقة للمدد الزمنية لنقل س. 30 أو 60 أو 90 الخلائط (لكل وقت خلط) في قالب العابرة للربط باستخدام كاكل 100 مم2.
- نقل العينات إلى لوحة جيدا بعد الانتهاء من العابرة للربط والثقافة تحت الظروف القياسية.
- بعد يوم واحد من الثقافة، يغسل بنيات (n = 3-4 كل مجموعة) في الخلية خالية من المصل الثقافة المتوسطة للحد الأدنى 30 وصمة عار الخلايا في بنيات مع حل المصبوغة (4 ميكرومتر كالسين صباحا، 1 ميكرومتر اثيديوم هوموديمير-1) لمدة 30 دقيقة.
- تغسل مرتين إضافية، واحتضان هذه العينات في مستنبت الخلية خالية من المصل لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
4-بيوبرينتينج النظير الغضروف مع نوع خلية مفردة
- رسم نموذج ثلاثي الأبعاد من الأنسجة المرجوة التناظرية. تحويل إلى ملف جكودي من أجل بيوبرينتينج وتحميل الملف جكودي على بيوبرينتير1.
ملاحظة: في هذا البروتوكول، بنية مربعة بإبعاد 4.8 × 4.8 × 0.9 مم3 تم تصديره كملف STL. تم إنشاء ملف Gcode بنية شعرية باستخدام الإعدادات التالية: سمك طبقة، 0.3 مم؛ بدأت أعمال الحفر نمط، مستقيمة؛ بدأت أعمال الحفر الكثافة، 25 في المائة؛ السرعة، 10 مم/s. - عزل وكريوبريسيرفي الابتدائي الآنف البشرية chondrocytes (hNC) من المرضى بعد البروتوكول المشار إليه1.
- ذوبان الجليد وتوسيع هنكس cryopreserved وتوسيع مرة في ثقافة أحادي الطبقة باستخدام معيار الثقافة المتوسطة عند 37 درجة مئوية. فصل الخلايا عند التقاء 80-90% مع حل التربسين/يدتا 0.5% والاعتماد على استخدام بروتوكول تريبان أزرق استبعاد. جميع التجارب التي أجريت باستخدام هنكس في المقطع 2.
- ريسوسبيند هنكس في 100 × 106 خلايا/مل ضمن 300 ميليلتر متوسطة الثقافة تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين، 1% البنسلين-ستربتوميسين، وحمض الأسكوربيك 50 ميكروغرام/ملليلتر، تحضيرا للمزج مع بيوينك.
- مزيج hNC تعليق خلية في نانوسيلولوسي/الجينات على أساس يلي بيوينك السلبي خلط البروتوكول وحدة بنسبة تعليق bioink:cell 10:1 للحصول على تركيز خلية الأخيرة من 9 × 106 خلايا/مل.
- ضمان هو تعقيم في بيوبرينتير عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية ومسح أسفل مع الإيثانول 70%. الحفاظ على العقم عن طريق وضع في تدفق الصفحي مجلس الوزراء.
- إرفاق فوهات الطباعة العقيمة الخراطيش التي تحتوي على مزيج تعليق بيوينك/خلية وإدراج بيوبرينتير.
- معايرة بيوبرينتير أما يدوياً أو بواسطة البروتوكولات الخاصة بالطابعة.
- بيوبرينت شعرية-منظم، محملة بالخلية بنيات استخدام معلمات الطباعة التالية: ز 25 فوهة مخروطية عند ضغط 25 كيلو باسكال. بيوبرينت الخلية خالية من بنيات (مخلوطة مع المتوسطة الخلية التي تحتوي على أي من الخلايا) كعنصر تحكم.
- تشابك بنيات بإضافة حلاً الأيونية من 100 مم كاكل2 لأدنى 5 شطف بنيات واحتضان في المتوسط الثقافة تحت ظروف الثقافة القياسية (37 درجة مئوية و 5% CO2و 95% رطوبة نسبية). تغيير وسائل الإعلام كل يوم الثاني أو الثالث.
- جمع عينات للتحليل النسيجي في أسابيع 2 و 4. وصمة عار العينات لإنتاج هفوة استخدام وصمة عار أزرق السيان18.
5-بيوبرينتينج النظير الجلد مع نوعين من الخلايا
- رسم نموذج ثلاثي الأبعاد من الأنسجة المرجوة التناظرية وتحويلها إلى ملف جكودي بيوبرينتينج. تحميل الملف جكودي على بيوبرينتير.
ملاحظة: في هذا البروتوكول، بنية مربعة بإبعاد 4.8 × 4.8 × 0.9 مم3 تم تصديره كملف STL. ثم تم إنشاء ملف Gcode بنية شعرية باستخدام الإعدادات التالية: سمك طبقة، 0.3 مم؛ بدأت أعمال الحفر نمط، مستقيمة؛ بدأت أعمال الحفر الكثافة، 25 في المائة؛ السرعة، 10 مم/s. - إعداد الخلايا لمزج في بيوينك بيوبرينتينج. واستخدمت لتصنيع النظير الجلد، نوعين من الخلايا. تم مزج أنواع الخلايا اثنين في بيوينك وبيوبرينتينج.
- الحصول على المركز الثقافي الفرنسي الرئيسي. الحفاظ على هذه الخلايا في وسائط النمو دميم وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين، 1% البنسلين-ستربتوميسين، وحمض الأسكوربيك ميكروغرام/مل 50. فصل الخلايا عند التقاء 80-90% مع الحل التربسين/يدتا 0.5% والعد.
- عزل وكريوبريسيرفي hNC الأولية من المرضى بعد البروتوكول المشار إليه1. ذوبان الجليد وتوسيع cryopreserved هنكس في ثقافة أحادي الطبقة. فصل الخلايا عند التقاء 80-90% مع الحل التربسين/يدتا 0.5% والعد.
- ريسوسبيند كل أنواع الخلايا في 100 × 106 خلايا/مل داخل وسائط النمو. مزيج من تعليق خلية معا بنسبة 1:1 لتحقيق تركيز مجموع نهائي من 100 × 106 خلايا/مل في 300 ميليلتر لوسائل الإعلام.
- يقوم مزيج 50: 50 تعليق خلية HDF و hNC في نانوسيلولوسي/الجينات التالية بيوينك السلبي خلط البروتوكول وحدة بنسبة تعليق bioink:cell 10:1 للحصول على تركيز خلية الأخيرة من 9 × 106 خلايا/مل.
- التأكد من أن بيوبرينتير يتم تعقيمها أو يوضع في تدفق الصفحي مجلس الوزراء للحفاظ على العقم.
- إرفاق فوهات الطباعة العقيمة الخراطيش التي تحتوي على مزيج تعليق بيوينك/خلية وإدراج بيوبرينتير.
- معايرة بيوبرينتير أما يدوياً أو البروتوكولات الخاصة بالطابعة.
- بيوبرينت شعرية-منظم، محملة بالخلية بنيات استخدام معلمات الطباعة التالية: ز 25 فوهة مخروطية عند ضغط 25 كيلو باسكال. بيوبرينت الخلية خالية من بنيات (مخلوطة مع المتوسطة الخلية التي تحتوي على أي من الخلايا) كعنصر تحكم.
- تشابك بنيات بإضافة حلاً الأيونية من 100 مم كاكل2 لأدنى 5 شطف بنيات واحتضان في المتوسط الثقافة تحت ظروف الثقافة القياسية (37 درجة مئوية و 5% CO2و 95% رطوبة نسبية). تغيير وسائل الإعلام كل يوم الثاني أو الثالث.
- جمع عينات للتحليل النسيجي في أسابيع 2 و 4. وصمة عار العينات للكولاجين أنا الإنتاج باستخدام ماسون وصمة عار تريتشرومي19.
Representative Results
النتائج في هذه المخطوطة تنقسم إلى قسمين. أولاً، وقد تم تحليل جدوى الخلية بعد خلط مع أسلوب الميكانيكية أو وحدة خلط السلبي. بعد ذلك، بنيات الغضاريف والجلد مثقف وتحليلها لعلامات نسيجية ذات الصلة.
وبدأ توزيع الخلايا متجانسة في كلتا الحالتين. ومع ذلك، قد عمل خلط باليد باستخدام ملعقة (الشكل 2ب) الفرق أكثر من الاختلاط مع وحدة خلط سلبي (الشكل 2). مدى وسرعة وتقنية خلط مع ملعقة يعتمد اعتماداً كبيرا على المستخدم. ومع ذلك، مزج الخلايا في بيوينك مع وحدة خلط سلبي توحد الاختلاط ويقلل التباين عبر دفعات. وعلاوة على ذلك، 30 و 60 و 90 s خلط الوقت مايو لن تكون كافية لخلط كمية كبيرة من الخلايا إلى كمية كبيرة من بيوينك. قد يكون من الضروري مزج أكثر صرامة من خلال خلط مع ملعقة. وبالمقارنة، الاستعانة بوحدة خلط سلبي أفضل يحافظ على نسبة خلط خلايا إلى بيوينك من خلال مزج ويضمن أن تتم خلط متجانسة. بالإضافة إلى ذلك، فقدان عينة مصدر قلق مع التقنيات التقليدية لخلط حيث يمكن تركها بيوينك في أطباق بتري، أنابيب، وأدوات خلط بسبب تلك اللزوجة العالية. بقاء الخلية كانت عالية بالنسبة لخلط مع وحدة خلط (> 90%) 1 أو 2 أو 3 مرات. عندما استخدمت وحدة خلط السلبي، مزج استغرق حوالي 1 دقيقة بمعدل بطيء ثابت مزج. بينما خلط مع ملعقة أظهرت جدوى عالية بعد الاختلاط ل 30 و 60 ثانية، أكبر من 90 s من خلط أدت إلى انخفاض كبير في جدوى مقارنة بالمجموعات الأخرى (77.9 ± 14 ٪، ف < 0.05) (الشكل 2ج). قد يكون هذا بسبب الاختلاط المفرط الذي يسبب الضرر للخلايا. الطويلة الأجل تلطيخ يعيش الميت بعد أيام 14 و 28 يوما من الثقافة يبين التكميلية الرقم 1. الخلايا تبدأ نشر يوم 14، وتنتشر في عالية قبل يوم 28، وتبين جدوى جيدة.
بعد الثقافة، حللت النظير أنسجة الغضاريف والجلد عن طريق الأنسجة. ويبين تحليل نيات غضروف في الأيام 0 و 14 و 28 زيادة في الكمية والتغطية من الكمامات كما يتبين من خلال وصمة الأزرق السيان (الشكل 3a-3_c). لاحظت غياب وصمة عار في اليوم 0، بينما في يوم 14 تلطيخ يقتصر على مواقع الدانية للخلايا. ومع ذلك، قبل يوم 28 من الثقافة، يتم العثور على الأزرق السيان في جميع أنحاء البناء، مما يدل على تشكيل تشوندروسيتيك إدارة المحتوى في المؤسسة. بيوبرينتيد الجلد بنيات حللت عن طريق تلطيخ نسيجية الكولاجين أنا استخدام ماسون وصمة عار تريتشرومي (الشكل 3د-3f). شبيه بنيات الغضاريف، أظهرت عينات اليوم 0 لا ترسيب الكولاجين. قبل 14 يوم من الثقافة، لوحظت رواسب كبيرة من الكولاجين حول الخلايا وعلى طول سطح بناء. هذا تواصل تعزيز يوم 28، حيث تم العثور على طبقات كثيفة من الكولاجين على سطح بناء وداخل الجزء الأكبر.
الشكل 1 : الخامل خلط نظام الوحدة. () حقنه 1 مل لتعليق خلية، (ب) 12 مل المحاقن مع بيوينك، (ج) الاستغناء عن وحدة، وحدة خلط السلبي (د)، (ه) ملء خرطوشة، والجمعية (f) حقنه بيوينك (1) وخلية تعليق المحاقن (2) في وحدة الاستغناء عن مرفق لوحدة خلط السلبي إلى نهاية كل من المحاقن (3)، (ز) المرفق الموصل بقفل اللوير أنثى والإناث (4) ومرفق لملء خرطوشة (5) يكمل في الجمعية، (ح ) ضغط وحدة صرف رئيس الوزراء خلط وحدة (6)، (أنا) الاستمرار في دفع إلى الأسفل في وحدة الاستغناء عن مزيج من تعليق خلية مع بيوينك والاستغناء عن إلى ملء خرطوشة (7). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الخلية صلاحية الصور والتحليل- صور الممثل تظهر حية (الأخضر) والليفية البشرية الميت (أحمر) بعد خلط مع السلبي خلط وحدة 1 أو 2 أو 3 مرات () أو ملعقة 30 أو 60، 90 ثانية (ب) والثقافة 3D لمدة يوم واحد. تظهر الصور في 4 X التكبير. وتبين أشرطة مقياس 200 ميكرومتر. (ج) بقاء متوسط النسبة المئوية للخلايا الليفية البشرية بعد الاختلاط مع السلبي خلط وحدة أو ملعقة والثقافة 3D لمدة يوم واحد. إظهار أشرطة الخطأ المعياري للوسط، * 0.005. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: ترسب محددة المصفوفة خارج الخلية الأنسجة. بنيات غضروف بيوبرينتيد الملون الجليكوزامينوجليكان استخدام السيان الأزرق في () اليوم 0، (ب) 14، و (ج) 28. الصور التي تم التقاطها في 5 X التكبير. بيوبرينتيد بنيات الجلد الملون للكولاجين الأول باستخدام تريتشرومي ماسون (د) اليوم 0، (ه) 14، و (و) 28. الصور التي تم التقاطها في 5 X التكبير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التكميلية رقم 1: "بقاء الخلية" في يوم 14 ()، ويوم 28 (ب). شريط مقياس 200 ميكرومتر، الأخضر يشير إلى العيش الخلايا، الأحمر يشير إلى خلايا ميتة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
كما هو موضح في هذه المخطوطة، بيوينكس بريسيلولاريزيد بيوبرينتيد لاختلاق أما الغضروف أو الجلد النظير التي تم مثقف لمدة تصل إلى 4 أسابيع. بقاء الخلية بعد المزج بين استخدام السلبي خلط تقنية وحدة كان أعلى من خلط الأساليب التقليدية. بالإضافة إلى ذلك، يقلل من العدد من التعامل مع خطوات تبسيط عملية المزج باستخدام وحدة خلط ويسمح بتناسق أفضل في مدى خلط. وفي نهاية المطاف، وهذا يؤدي في إمكانية تكرار نتائج أفضل في كل خلية التوزيع داخل في بيوينك، وعبر بنيات والمجموعات التجريبية. ترسيب مكونات الأنسجة ECM محددة مثل الكمامات والكولاجين أنا لوحظ للنظير كل من الغضروف والجلد، على التوالي بعد 4 أسابيع ثقافة. يشير هذا إلى المرونة في أسلوب خلط وهندسة بناء الذي تم اختياره اختﻻق أهدافا مختلفة من الأنسجة. تصنيع النظير الغضاريف والجلد أظهرت مرونة استخدام كلا بيوينك نانوسيلولوسي-الجينات وتقنية بيوبرينتينج لأهداف الأنسجة المهندسة المتميزة. وسوف نناقش مكونين من الدراسة أدناه: (1) السلبي خلط وحدة تقنية، والسلوك (2) من الخلايا داخل النظير الغضاريف والجلد.
في التنمية والاستفادة المثلى من تقنية للمزج بين تعليق خلية في بيوينك أمر بالغ الأهمية لتلفيق هذه الثوابت. بخلاف المواد المائية التقليدية اللزوجة منخفضة، أسفرت لزوجة عالية بيوينكس صعوبة في بريسيلولاريزيشن بيوينك قبل الطباعة. كبديل للطريقة التقليدية لدمج الخلية في بيوينك، ووضعت بروتوكولا لخلط خطوة واحدة من تعليق خلية في بيوينك لزج وناقش. بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم التطبيق العملي لهذا الأسلوب خلط في تصنيع الأنسجة بنيات. هذا النهج خطوة واحدة خلط العديد من المزايا التقليدية خلط التقنيات المدرجة التي تسيطر عليها خلط نسبة، والتقليل إلى أدنى حد تشدد القص عالية وغير النظامية، وإغلاق نظام مغلق للقضاء على عينة في خلط السفن. ومع ذلك، هناك العديد من الخطوات الهامة في هذا الأسلوب التأكد من مزاياها أكثر الأساليب التقليدية لمزج الخلايا/بيوينك. أنها حاسمة لضمان وقف الخلايا في خلية المحاقن وتمتزج جيدا قبل المزج. جداً كبير من فجوة زمنية بين رفع ونقل الخلايا في المحاقن وانطلاق عملية خلط يمكن أن يسبب الخلايا للرواسب، مما سيؤدي إلى خلط متفاوتة والتوزيع إلى خيوط مطبوعة. إذا كان الترسيب انعكاس بسيط، ولوحظ (2-3 مرات) للجمعية وحدة خلط السلبي فورا قبل خلط غير كافية ريسوسبيند الخلايا وضمان توزيع موحدة قبل المزج. من المهم أيضا أن فقاعات الهواء في الحقن يتم القضاء أو التقليل من شأنها مسبقة لضمان بقاء نسبة خلط مستمر. إذا ظلت فقاعات الهواء الكبيرة في الخرطوشة بيوينك قبل المزج، من المستحسن أن تشغيل الحل عن طريق وحدة خلط وقت إضافي لضمان خلط دقيق. إذا ظلت فقاعات الهواء، يمكن أن تحل محل التنصت لطيف للخرطوشة الطباعة/المحاقن فقاعات الهواء المتبقية. بالإضافة إلى ذلك، إذا كانت المواد متعددة مزج (عدة خلط الوحدات أو المواد) اللازمة لثوابت أكثر تعقيداً، يجب تعديل تركيزات معلقات بيوينكس/خلية لتكون مختلطة لضمان أن بعد تخفيفها من خلال المزج السليم ويتحقق ما زال التركيز النهائي.
بالمقارنة مع غيرها من تقنيات المزج، وحدة خلط السلبي نهجاً جديداً سيلولاريزي بيوينكس. خلافا لغيرها من التقنيات خلط مثل المحاقن المزدوج الاختلاط، أو التحريك بملعقة أو أداة أخرى، يسمح وحدة خلط السلبي المزيد من الاتساق في مزج عبر المجموعات والمستخدمين. طبيعة أساليب خلط يدوي، مثل خلط ملعقة، ينتج أكبر مستخدم لتباين في مدى ومعدل خلط. بالإضافة إلى ذلك، قد نظم مغلقة مثل السلبي الخلط بين الوحدة وخلط الحقن المزدوج قليلاً إلى أي خسارة عينة مقارنة بدليل الاختلاط داخل طبق بتري أو أنبوب.
كلا النظير الأنسجة ملفقة في هذه المخطوطة تتألف من نوع واحد من بيوينك وواحد أو اثنين من أنواع الخلايا. ومع ذلك، بيوبرينتينج النظير الأنسجة التي تتكون من أبنية تحتوي على مناطق بيوينكس متميزة مع أنواع الخلايا مميزة قد تكون ضرورية لتصنيع أكثر الأنسجة الفسيولوجية بنيات20،21، 22. أكثر تخصصا بيوينكس مع تركيبة فريدة من نوعها، أو قد يتم إنشاء وظائف من خلال المزج بين عدة أنواع من القائمة بيوينكس معا لإنشاء بيوينكس مولتيماتيريال أن يكون متميزاً التراكيب أو وظائف23، 24. قد يكون هذا أهمية خاصة في مناطق الانتقال الأنسجة مثل الجلد إلى طبقة تحت الجلد أو الغضروف إلى المنطقة للأنسجة حيث تدرج بيوينك تكوين،من25إلى26 قد تكون ضرورية لضمان التنمية للعظام هذه المناطق الحرجة في الأنسجة الأصلية27. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام وحدة خلط مزيج في عوامل النمو ومورفوجينس إلى بيوينكس قبل بيوبرينتينج. والقضاء على فقدان عينة مع نظام خلط مغلقة جذابة لاستخدام العوامل النشطة بيولوجيا تركيز باهظة التكلفة ومنخفضة، حيث يمكن أن يؤدي فقدان عينة في تغيير إلى تركزها النهائي داخل بنية بيوبرينتيد، لا سيما عندما وتشارك التدرجات.
حد مع أي تقنية خلط، بما في ذلك السلبي خلط الوحدة المستخدمة في هذه الدراسة، هو خطر الإصابة بضرر لأنواع الخلايا الحساسة ميكانيكيا. على سبيل المثال، عزل هذه الخلايا الجذعية من نخاع العظم أو الجنين، أو الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent أكثر عرضه لأضرار ميكانيكية28،29. قانون الاختلاط يضفي تؤكد الميكانيكية غير طبيعي في الخلايا بسبب القص القوات المشاركة في عملية خلط، وأنها يجب أن تكون متوازنة للحفاظ على بقاء30. بينما أدى استخدام الخلايا الليفية الأولية وتشوندروسيتيس في هذه الدراسة جدوى جيدة (الشكل 2)، يتم إجراء مزيد من الدراسات اللازمة لتحديد معدلات خلط آمنة ونسب لأنواع الخلايا أكثر حساسية. حتى ذلك الحين، من المستحسن أن خلط يجب أداؤها بموجب بمعدل بطيء ثابت تحقيق أقصى قدر من الجدوى. بالإضافة إلى ذلك، كان تحدد كثافة الخلية المختارة في هذه الدراسة استناداً إلى الدراسات السابقة1. قد لا تكون هذه الخلية كثافة مثالية لجميع أنواع الخلايا.على وجه الخصوص، قد يؤدي مزج الخلايا بتركيز أعلى زيادة خلية-خلية الاتصالات التي يمكن أن يحسن بقاء الخلايا والأنسجة تشكيل31،32. على نفس المنوال، وحدة خلط سلبية يمكن أن تنطبق على مزج الماغنيسيوم الخلية أو المجاميع خلية أخرى33 في بيوينكس.
كما اقترحت وأثبت في هذه الدراسة، سلبية خلط نظام وحدة يمكن أن سرعة الذوبان تعليق خلية في بيوينك لزج. في حين لا يزال خطر الضرر الميكانيكي للخلايا، النهج يتيح المزيد من الاتساق في مزج في دراسة واحدة، وعبر المستخدمين. واستخدمت بيوينكس بريسيلولاريزيد استخدام هذا النهج اختﻻق كلا الغضاريف والجلد النظير التي تم مثقف لمدة تصل إلى 4 أسابيع، وأظهرت ترسب الأنسجة محددة ECM علامات. الدراسات المستقبلية ستركز على الاستفادة السلبي خلط نظام الوحدة لمزج بيوينكس المتخصصة من بيوينكس موحدة لتصنيع النظير الأنسجة أكثر تعقيداً.
Disclosures
مؤلفي هذه المخطوطة موظفا من شركة سيلينك.
Acknowledgments
المؤلفين قد لا شكر وتقدير.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| STARTINK Kit | CELLINK | SK0001 | Kit that contained all the elements for the CELLMIXER procedure |
| Live/Dead Kit | Life Technologies | L3224 | Kit for the analysis of cell viability after mixing |
| Masson's Trichrome | Sigma Aldrich | HT15-1KT | Kit for the analysis of collagen I deposition in the skin constructs |
| Alcian Blue | Sigma Aldrich | B8438-250ML | Kit for the analysis of glycosaminoglycan deposition in the skin constructs |
| INKREDIBLE+ bioprinter | CELLINK | Gen1+ | Printer utilized in the study |
| DMEM with Glutamax | Thermofisher | 10566016 | Media for culture of the cells |
| 10% fetal bovine serum | Thermofisher | A3160402 | Media supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | Media supplement |
| live cell imaging solution | thermofisher | A14291DJ | component utilized using live/dead imaging |
| inverted microscope | Olympus | IX73 | microscope utilized |
| a digital color camera | Olympus | XC10 | microscope camera utilized |
| cellSens imaging software | Olympus | n/a | stock software with the microscope |
| ImageJ | NIH | n/a | open source image analysis software |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | n/a | software for statistical analysis |
| Slic3r software (v1.2.9) | Slic3r | n/a | open-source software to convert .stl file to gcode |
| primary adult human dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-012 | cell source for fibroblasts |
References
- Avila, H. M., Schwarz, S., Rotter, N., Gatenholm, P. 3D bioprinting of human chondrocyte-laden nanocellulose hydrogels for patient-specific auricular cartilage regeneration. Bioprinting. 1, 22-35 (2016).
- Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue Eng Part C Methods. 20 (6), 473-484 (2013).
- Costantini, M., et al. Microfluidic-enhanced 3D bioprinting of aligned myoblast-laden hydrogels leads to functionally organized myofibers in vitro and in vivo. Biomaterials. 131, 98-110 (2017).
- Fedorovich, N. E., et al. Biofabrication of Osteochondral Tissue Equivalents by Printing Topologically Defined, Cell-Laden Hydrogel Scaffolds. Tissue Eng Part C Methods. 18 (1), 33-44 (2011).
- Vijayavenkataraman, S., Lu, W. F., Fuh, J. Y. H. 3D bioprinting of skin: a state-of-the-art review on modelling, materials, and processes. Biofabrication. 8 (3), 032001 (2016).
- Peltola, S. M., Melchels, F. P. W., Grijpma, D. W., Kellomäki, M. A review of rapid prototyping techniques for tissue engineering purposes. Ann Med. 40 (4), 268-280 (2008).
- Xu, T., Jin, J., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. Inkjet printing of viable mammalian cells. Biomaterials. 26 (1), 93-99 (2005).
- Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells. Biotechnol Bioeng. 106 (6), 963-969 (2010).
- Parsa, S., Gupta, M., Loizeau, F., Cheung, K. C. Effects of surfactant and gentle agitation on inkjet dispensing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 025003 (2010).
- Derby, B. Inkjet printing of functional and structural materials: fluid property requirements, feature stability, and resolution. Annu Rev Mater Res. 40, 395-414 (2010).
- Colosi, C., et al. Microfluidic Bioprinting of Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low-Viscosity Bioink. Adv Mater. 28 (4), 677-684 (2016).
- Ober, T. J., Foresti, D., Lewis, J. A. Active mixing of complex fluids at the microscale. Proc Natl Acad Sci. 112 (40), 12293-12298 (2015).
- Shabnam, P., Madhuja, G., Frédéric, L., Karen, C. C. Effects of surfactant and gentle agitation on inkjet dispensing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 025003 (2010).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnol Bioeng. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Niu, X., Lee, Y. -K. Efficient spatial-temporal chaotic mixing in microchannels. J Micromech Microeng. 13 (3), 454 (2003).
- Liu, R. H., et al. Passive mixing in a three-dimensional serpentine microchannel. J Microelectromech Syst. 9 (2), 190-197 (2000).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr protoc immunol. , A3. B. 1-A3. B (2001).
- Scott, J., Dorling, J. Differential staining of acid glycosaminoglycans (mucopolysaccharides) by alcian blue in salt solutions. Histochem Cell Biol. 5 (3), 221-233 (1965).
- Garvey, W. Modified elastic tissue-Masson trichrome stain. Stain technol. 59 (4), 213-216 (1984).
- Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. -M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. Complex heterogeneous tissue constructs containing multiple cell types prepared by inkjet printing technology. Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).
- Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
- Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proc Natl Acad Sci. 113 (12), 3179-3184 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Adv Mater. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- KÖpf, M., Campos, D. F. D., Blaeser, A., Sen, K. S., Fischer, H. A tailored three-dimensionally printable agarose-collagen blend allows encapsulation, spreading, and attachment of human umbilical artery smooth muscle cells. Biofabrication. 8 (2), 025011 (2016).
- Gurkan, U. A., et al. Engineering anisotropic biomimetic fibrocartilage microenvironment by bioprinting mesenchymal stem cells in nanoliter gel droplets. Mol Pharm. 11 (7), 2151-2159 (2014).
- Ma, Y., Ji, Y., Huang, G., Ling, K., Zhang, X., Xu, F. Bioprinting 3D cell-laden hydrogel microarray for screening human periodontal ligament stem cell response to extracellular matrix. Biofabrication. 7 (4), 044105 (2015).
- Lu, H. H., Thomopoulos, S. Functional attachment of soft tissues to bone: development, healing, and tissue engineering. Annu Rev Biomed Eng. 15, 201-226 (2013).
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2011).
- Parisi-Amon, A., Mulyasasmita, W., Chung, C., Heilshorn, S. C. Protein-Engineered Injectable Hydrogel to Improve Retention of Transplanted Adipose-Derived Stem Cells. Adv Healthc Mater. 2 (3), 428-432 (2013).
- Qiu, X., De Jesus, J., Pennell, M., Troiani, M., Haun, J. B. Microfluidic device for mechanical dissociation of cancer cell aggregates into single cells. Lab Chip. 15 (1), 339-350 (2015).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14 (5), 633-640 (2002).
- Loessner, D., et al. Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells. Biomaterials. 31 (32), 8494-8506 (2010).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
