Summary
Brusk og huden analogs var bioprinted med en nanocellulose-alginate basert bioink. Bioinks var cellularized før utskrift via en enkelt trinn passiv blande enhet. Sammensetningene ble vist å være jevnt cellularized har høy levedyktighet og utstillingen gunstige markører for differensiering.
Abstract
Bioprinting er en kraftfull teknikk for rask og reproduserbar fabrikasjon av konstruksjoner for tissue engineering programmer. I denne studien var både brusk og huden analogs fremstille etter bioink pre-cellularization utnytte en roman passiv blander enhet teknikk. Denne teknikken ble utviklet med sikte på å forenkle trinnene involvert i blanding av en celle suspensjon i en svært tyktflytende bioink. Oppløsningen av filamenter avsatt gjennom bioprinting nødvendiggjør forsikring av ensartethet i cellen distribusjon før utskrift å unngå avsetning av regionene uten celler eller oppbevaring av store celle klumper som kan tette nålen. Vi demonstrere evnen til å raskt blande en celle hjuloppheng med en bioink før bioprinting av både brusk og huden analogs. Begge vev analogs kunne bli kultivert 4 uker. Histologiske analysen viste både celle levedyktighet og deponering av vev bestemt ekstracellulær matrix (EFM) markører som glycosaminoglycans (GAGs) og kollagen jeg henholdsvis.
Introduction
De siste årene, har tredimensjonale (3D) bioprinting teknologi blitt mer tilgjengelig for forskere, slik at teknikken for å bli mer benyttet for fabrikasjon av vev analogs. Bioprinting lover å revolusjonere biomedisinsk forskning ved å tilrettelegge rapid og repeterbare fabrikasjon av mangefasettert vev konstruksjoner. Crux av bioprinting teknologien ligger i evnen til å kontrollere nøyaktig avsetning av biologisk materiale (kalt bioinks) i tre dimensjoner. Dette tillater generering av komplekse stillaser med atskilte områder av matrix komposisjoner, bioaktive faktorer og celler som kan mer nøyaktig recapitulate innfødt vevet struktur.
Bioprinting har blitt benyttet til fabrikasjon av konstruksjoner for mange vev programmer inkludert brusk1, hud2, muskel3og bein4. Disse vevsprøvene er attraktivt for bioprinting på grunn av sine iboende striated mikro-arkitektur som er egnet for recapitulation via lag-på-lag deponering. Spesielt besitter hud en veldefinert flerlags struktur5, som er egnet for fabrikasjon gjennom lag-på-lag deponering teknikker som bioprinting. Dessuten bioprinting kan brukes til å generere konstruksjoner som har de nødvendige anatomiske dimensjonene og figurer å reparere vevet defekt. Muligheten til å generere biologisk materiale med pasient-spesifikk form og størrelse6 kan begynne å møte etterspørselen etter delvis reparasjoner av mange vev inkludert men begrenset ikke til bein feil og skader brusk hudlesjoner som grad varierer fra pasient til pasient.
I denne studien ble to vev analogs (articular brusk og hud) fabrikkert gjennom bioprinting av pre-cellularized bioinks. Sikre tilstrekkelig blanding av et bioink med cellen suspensjon som kan sikre ensartet celle distribusjon mens bevare celle levedyktighet kan være en utfordring. Bioinks egnet for bioprinting via ekstrudering er ofte svært tyktflytende og krever derfor omfattende blanding for å sikre en homogen blanding. Mekanisk skade celler kan oppstå under miksing værharde og negativt påvirke levedyktighet. Studier har vist at de fleste celledød i inkjet utskriftsprosessen oppstår under forberedelse som blander7,8. Mens tradisjonelle blande med agitasjon9 kan være tilstrekkelig for lav viskositet bioinks egnet for inkjet utskrift10, er blanding av celler i en høy viskositet bioink mer egnet for ekstrudering bioprinting vanskeligere. Adressering dette behovet, har bruk av miksing dysene blitt mer populært for blanding av bioinks under utskrift prosessen11. Disse blandebatterier har også vært mye benyttet i microfluidics forskning hvor blanding av væsker med lavt Reynolds tall er viktig12. Bruken av en kontinuerlig miksing prosessen å blande en celle suspensjon i en bioink ville tillate for ensartethet i utskriftsprosessen. Men siden cellen suspensjoner har lav viskositet sammenlignet en bioink, vil problemer oppstå i å forebygge sedimentering cellene under den utskrift prosess9,13,14. Alternativt kan blanding av celler i et bioink før du skriver ut løse dette problemet.
For å minimere celledød under inn i en bioink, utviklet vi en teknikk basert på en passiv blande enhet å blande celler i en bioink i minimal antall trinn. Kaotisk blanding generert gjennom flyten av materialer gjennom miksing enhet er tilstrekkelig reproduserbar blanding to komponenter sammen15,16. Denne metoden ble først og fremst utviklet for å forenkle blanding av noen celle hjuloppheng med noen bioink som passer for ekstrudering bioprinting. Antall trinn i miksing prosessen ble minimert for å eliminere bruker-til-bruker variasjon i blande. Overdreven blande trinnene kan være tidkrevende og ikke gjelder for alle bioinks, spesielt når celler er involvert. Sekundær, vi som mål å utvikle et miksing prosessen som var selvforsynt både bevare sterilitet og minimere eksempel tap.
I dette manuskriptet viser vi blending av en celle suspensjon med en bioink bruker en passiv blander enhet teknikk som minimerer håndtering og resulterer i høyt levedyktighet og uniform fordeling. Disse pre-cellularized bioinks benyttes så å bioprint en brusk eller hud konstruere med ett eller to celletyper, henholdsvis som er kultivert 6 uker. Bioink benyttes er en alginate-nanocellulose-blanding, som tidligere har vist egnethet for bioprinting1.
Protocol
Denne protokollen følger retningslinjene i Chalmers University's human forskning etikk.
Merk: Alle trinnene er utføres i et sterilt biosikkerhet kabinett.
1. utarbeidelse av forbruksvarer, Bioink og celler
- Få to sprøyter, en sprøyte (figur 1en) for cellen suspensjon, mens andre sprøyten er for bioink (figur 1b).
- Få en steril passiv blande enhet (figur 1c) som kan kombineres med to sprøyter en Luer-lock-tilkobling.
- Få en dispensering enhet (figur 1d) som kan extrude et volum fra to sterile sprøyter samtidig i en kontrollert hastighet.
Merk: Blande forholdet benyttet i denne studien er 10:1. Derfor bruk en 12 mL sprøyte og en 1 mL sprøyte som kreves av 10:1 blanding. - Få en steril patron (figur 1e) og en steril kvinne-hunn Luer lock å koble direkte blandet bioink og celle suspensjon i.
- Skaffe eller lage bioink blandet med en celle suspensjon.
Merk: I denne protokollen, en nanocellulose/alginate basert bioink ble benyttet. Denne bioink er krysskoblet gjennom tillegg av en steril 100 mM CaCl2 løsning innlegg utskrift. - Koble celler ved hjelp av en 0,5% trypsin/EDTA løsning og teller antall celler med trypan blå utelukkelse metoden17.
Merk: I denne protokollen, menneskelig fibroblaster utnyttet. - Bestemme hvilken celle tetthet er ønsket i den endelige trykte konstruere. Beregne bruker følgende ligningene konsentrasjonen av høstet cellene må fortynnes for å oppnå dette målet siste celle tetthet.
Merk: I denne protokollen, en siste celle tetthet 5 x 106 celler/ml ble benyttet.- Velg en ønsket celle konsentrasjon for eksperimenter: C-cellen (celler/mL).
- Beregne mengden bioink nødvendig Vbioink, basert på antall konstruksjoner ønsket:
Vbioink = Vkonstruere × NContructs
Merk: For eksempel volumet av bioink per konstruksjon er 100 µL. Hvis 30 konstruksjoner skrives ut, er det bioink volumet nødvendig 3 mL. - Beregn antall celler nødvendig:
Nceller = C-cellen (1.1 × Vbiolink) - Resuspend cellene (Nceller) i 1/10th volumet av bioink:
Vcelle suspensjon = 0,1 × Vbiolink
Merk: For eksempel hvis Vbioink = 3 mL, vil Vcelle suspensjon = 0,1 × 3 mL = 0,3 mL
2. blanding av cellen fjæring og Bioink
- Overføre celle suspensjon i cellen suspensjon sprøyten.
- Overføre til bioink til en annen sprøyte eller få en sprøyte som inneholder bioink.
- Skyv bioink sprøytestempelet og Legg sprøyten i dispensering enheten. Plasser enheten loddrett med Luer lås koblingen oppover (figur 1f1).
- Dra stempelet av cellen tilbake til samme lengde som bioink sprøyten og sett inn dispensering enheten (figur 1f2).
- Koble begge sprøyter til miksing enheten ved å vri Luer-lock-koblinger (figur 1f3).
- Prime blande systemet ved å trykke på enheten for dispensering extrude luft i sprøyten. Stopp grunning før løsningen nå Luer-lock (figur 1g4).
- Etter grunningen knytte fylle kassetten til slutten av miksing enheten via Luer-lock kontakt (figur 1g5). Kontroller at stempelet i fylle kassetten er nederst før vedlegg.
- Sakte komprimere (figur 1h6) dispensering enheten å blande bioink og celle suspensjon sammen inn i kassetten (figur 1i7).
- Skyv stempelet i fylle kassetten nedover med sterilt Pipetter tips til kontakt bioink-celle blandingen etter blanding. Holde utlevering til komprimert slik celle/bioink blandingen ikke er ekstrudert tilbake til miksing enheten.
- Cap kassetten og lett trykk på arbeidsflaten flytte eventuelle luftbobler til toppen av kassetten (stempelet slutten).
Merk: På dette punktet, celle/bioink blandingen er klart for utskrift. Avsnittene nedenfor vil skissere bestemte programmer og utskrift prosedyrer.
3. fastsettelse av cellen levedyktighet bruker en blanding enhet i forhold til manuelle slikkepott miksing
- Koble menneskelig fibroblaster (passasje 7) med en 0,5% trypsin/EDTA løsning på 80% samløpet telle antall og resuspend kultur medium på cellen tettheten å oppnå en siste konsentrasjon etter blanding med bioink (1:10 celle: bioink forhold) på 5 x 10 6 celler/mL.
- Blanding celler i bioink bruker enten passiv blander enhet teknikk (trinn 2) eller via slikkepott til å evaluere effekten av begge teknikkene på cellen levedyktighet.
- Blanding cellene i bioink ved hjelp av passiv blander enhet teknikk 1, 2 eller 3 ganger før utlevering i mold for cross-linking bruker 100 mM CaCl2.
Merk: For å utføre flere himmel, bland cellen/bioink direkte inn i en sprøyte i stedet for en patron. Deretter remix blanding gjennom miksing enheten etter den forrige protokollen men uten komponenten celle sprøyten. - Blanding cellene i en separat bioink ved hjelp av manuell mekanisk miksing via en slikkepott for varigheten av 30, 60, eller 90 s. overføring blandinger (for hver blande tid) i mold for cross-linking bruker 100 mM CaCl2.
- Overføre prøvene til en frisk plate etter ferdigstillelse av cross-linking og kultur under standard betingelser.
- 1 dag kultur, vaskes sammensetningene (n = 3-4 per gruppe) i serum-free celle kultur medium for 30 min. flekken cellene i konstruksjoner med en flekker løsning (4 µM Calcein AM, 1 µM Ethidium homodimer-1) for 30 min.
- Vask to ganger, og ruge eksemplene i serum-free celle kultur medium for totalt 1 h på 37 ° C.
4. Bioprinting av brusk Analogs med en enkelt celle
- Tegne en 3D-modell av ønsket vev analoge. Konvertere til en Gcode-fil for bioprinting og laste filen Gcode på bioprinter1.
Merk: I denne protokollen, et kvadrat struktur med dimensjoner 4.8 x 4.8 x 0,9 mm3 ble eksportert som en STL-filen. En Gcode-fil ble generert gitteret struktur med følgende innstillinger: lagtykkelse, 0.3 mm; infill mønster, rettlinjet; infill tetthet, 25%. hastighet, 10 mm/s. - Isolere og cryopreserve primære menneskelige nese chondrocytes (hNC) fra pasienter etter den refererte protokoll1.
- Tine og utvider cryopreserved hNCs og en gang i monolayer kultur ved hjelp av standard kultur medium på 37 ° C. Koble celler på 80-90% samløpet med en 0,5% trypsin/EDTA løsning og regne med en blå Utelatelsesprotokoll for trypan. Alle eksperimentene ble utført med hNCs på passage 2.
- Resuspend hNCs på 100 x 106 celler/mL innen 300 µL av kultur medium med 10% fosterets bovin serum og 1% penicillin-streptomycin 50 µg/mL askorbinsyre, i forberedelse til å blande med bioink.
- Blanding hNC celle suspensjon i en nanocellulose/alginate basert bioink følgende passiv blande enheten protokollen i 10:1 bioink:cell suspensjon forholdet å få en siste celle konsentrasjon av 9 x 106 celler/mL.
- Kontroller at bioprinter er sterilisert via UV-stråling og tørke ned med 70% etanol. Opprettholde sterilitet ved å plassere i en laminær strømning kabinett.
- Knytte sterilt utskrift dyser til kassetter som inneholder de bioink/cell suspensjon blandingene og inn i bioprinter.
- Kalibrere bioprinter enten manuelt eller ved protokollene som er knyttet til skriveren.
- Bioprint gitter-strukturert, celle-laden konstruksjoner med de følgende parameterne for utskrift: 25G konisk dysen med et trykk på 25 kPa. Bioprint cellen gratis konstruksjoner (blandet med cellen medium som inneholder ingen celler) som en kontroll.
- Link sammensetningene ved å legge en ionisk løsning av 100 mM CaCl2 til 5 min. skyll konstruerer og ruge kultur medium under standard kultur forhold (37 ° C, 5% CO2og 95% relativ fuktighet). Endre media hver andre eller tredje dag.
- Innhente prøver for histologiske analyse i uke 2 og 4. Flekken prøver for GAG produksjonen ved hjelp av en Alcian blå flekken18.
5. Bioprinting av hud Analogs med to celletyper
- Tegne en 3D-modell av ønsket vev analoge og konvertere til en Gcode-fil for bioprinting. Last filen Gcode på bioprinter.
Merk: I denne protokollen, et kvadrat struktur med dimensjoner 4.8 x 4.8 x 0,9 mm3 ble eksportert som en STL-filen. Så en Gcode-fil ble generert gitteret struktur med følgende innstillinger: lagtykkelse, 0.3 mm; infill mønster, rettlinjet; infill tetthet, 25%. hastighet, 10 mm/s. - Forberede cellene inn i bioink for bioprinting. Til fabrikasjon av huden analogs utnyttet to celletyper. De to celletyper ble blandet inn i bioink og bioprinting.
- Få primære HDF. Opprettholde disse cellene i DMEM vekst medier med 10% fosterets bovin serum og 1% penicillin-streptomycin 50 µg/mL askorbinsyre. Koble celler på 80-90% samløpet med 0,5% trypsin/EDTA løsning og antall.
- Isolere og cryopreserve primære hNC fra pasienter etter den refererte protokoll1. Tine og utvide cryopreserved hNCs i monolayer kultur. Koble celler på 80-90% samløpet med 0,5% trypsin/EDTA løsning og antall.
- Resuspend begge celletyper på 100 x 106 celler/mL i vekst medier. Blande av cellen suspensjon sammen på en 1:1 ratio å oppnå en siste totale konsentrasjonen av 100 x 106 celler/mL i 300 µL av media.
- Blanding 50/50 celle suspensjon av HDF og hNC i en nanocellulose/alginate basert bioink følgende passiv blande enheten protokollen i 10:1 bioink:cell suspensjon forholdet å få en siste celle konsentrasjon av 9 x 106 celler/mL.
- Sikre bioprinter er sterilisert eller plasseres i en laminær strømning regjering å opprettholde sterilitet.
- Knytte sterilt utskrift dyser til kassetter som inneholder de bioink/cell suspensjon blandingene og inn i bioprinter.
- Kalibrere bioprinter enten manuelt eller protokollene knyttet til skriveren.
- Bioprint gitter-strukturert, celle-laden konstruksjoner med de følgende parameterne for utskrift: 25G konisk dysen med et trykk på 25 kPa. Bioprint cellen gratis konstruksjoner (blandet med cellen medium som inneholder ingen celler) som en kontroll.
- Link sammensetningene ved å legge en ionisk løsning av 100 mM CaCl2 til 5 min. skyll konstruerer og ruge kultur medium under standard kultur forhold (37 ° C, 5% CO2og 95% relativ fuktighet). Endre media hver andre eller tredje dag.
- Innhente prøver for histologiske analyse i uke 2 og 4. Flekken prøver for kollagen jeg produksjonen ved hjelp av en Masson trichrome flekken19.
Representative Results
Resultater i dette manuskriptet er delt i to deler. Først ble celle levedyktigheten analysert etter blande metoden mekanisk eller passiv blande enheten. Deretter ble brusk og huden sammensetningene kultivert og analysert for relevante histologiske markører.
Cellen distribusjon dukket homogen i begge tilfeller. Handlingen med å blande for hånd med en slikkepott (figur 2b) har imidlertid flere varians enn å blande med en passiv blande enhet (figur 2en). Grad, hastigheten og blande teknikken med en slikkepott er svært avhengig av brukeren. Men blending celler i en bioink med en passiv blande enhet standardiserer miksing og minimerer variasjon over bunker. Videre, 30, 60 og 90 s blande tid kanskje ikke være tilstrekkelig for blanding av et stort antall celler i et stort antall bioink. Strengere blanding gjennom miksing med en slikkepott kan være nødvendig. Sammenligning utnytte en passiv blande enhet bedre opprettholder blande forholdet mellom cellene til bioink under blanding og sikrer at en homogen blanding er utført. Dessuten er prøve tap et problem med tradisjonelle blander teknikker der bioink kan bli igjen i Petri retter, rør og miksing verktøy på grunn av høy viskositet. Cellen levedyktigheten var høy for å blande med en blande enhet (> 90%) 1, 2 eller 3 ganger. Når passiv blande enheten ble benyttet, tok blending ca 1 min treg blending jevnt. Mens blander med en slikkepott utstilt høy levedyktighet etter miksing i 30 og 60 s, større enn 90 s blande resulterte i en betydelig reduksjon i levedyktighet sammenlignet med de andre gruppene (77.9 ± 14%, p < 0,05) (figur 2c). Dette kan skyldes overdreven blanding som forårsaker skade til cellene. Langsiktig live/døde flekker etter 14 dager og 28 dager kultur vises i supplerende figur 1. Celler begynne å spre dag 14, spres svært av dag 28 og angi god levedyktighet.
Etter kultur, ble både brusk og huden vev analogs analysert gjennom histology. Analyse av brusk konstruksjoner dager 0, 14 og 28 viser en økning i antall og dekning av GAGs som vist gjennom en Alcian blå flekker (Figur 3a-3_c). Fravær av flekken er merket på dag 0, mens på dag 14 flekker er begrenset til steder proksimale til cellene. Men dag 28 kultur, er Alcian blue funnet gjennom Konstruer, demonstrere dannelsen av en chondrocytic ECM. Bioprinted hud konstruksjoner ble analysert gjennom histologiske farging av kollagen jeg bruker en Masson Trichrome flekk (Figur 3d-3f). Ligner brusk konstruksjoner, dag 0 prøver utstilt ingen avleiring av kollagen. Dag 14 av kultur, var betydelig forekomster av kollagen bemerket rundt cellene og langs overflaten av Konstruer. Dette ble ytterligere forbedret dag 28, mens tett kollagen lag ble funnet på konstruere overflaten og bulk.
Figur 1 : Passive blande enhetssystemet. (et) 1 mL sprøyte for cellen suspensjon, (b) 12 mL sprøyte med bioink, (c) dispensering enhet, (d) passiv blande enhet, (e) fylle kassetten, (f) montering av bioink sprøyten (1) og celle suspensjon sprøyten (2) i dispensering enheten, vedlegg av passiv miksing til slutten av både sprøyter (3), (g) vedlegg av kvinne-hunn Luer lås kontakten (4) og feste fylle kassetten (5) fullfører montering, (h ) komprimere dispensering enheten for å prime det blande enhet (6), (jeg) fortsetter å presse på dispensering enheten å blande celle suspensjon med bioink og støte inn i fylle kassetten (7). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Levedyktighet bilder og analyse. Representant bilder viser live (grønn) og døde (rød) menneskelig fibroblaster etter blanding med passiv miksing enhet 1, 2 eller 3 ganger (en) eller spatula 30, 60, eller 90 sekunder (b) og 3D kultur for 1 dag. Bilder på 4 X forstørrelse vises. Skala stolper angir 200 µm. (c) prosent gjennomsnittlig levedyktighet av menneskelig fibroblaster etter blanding med passiv blande enhet eller spatula og 3D kultur for 1 dag. Viser standardavviket for mener, * 0.005. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: vev bestemt ekstracellulær Matrix deponering. Bioprinted brusk konstruksjoner farget for glycosaminoglycans utnytte Alcian blå på (en) dag 0, (b) 14, og (c) 28. Bilder tatt på 5 X forstørrelse. Bioprinted hud konstruksjoner farget for kollagen jeg bruker Masson's Trichrome (d) dag 0, (e) 14, og (f) 28. Bilder tatt på 5 X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: cellen levedyktighet på dag 14 (en), og dag 28 (b). Skala bar er 200 μm, grønn refererer til levende celler, rød refererer til døde celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Som vist i dette manuskriptet, var pre-cellularized bioinks bioprinted å dikte enten brusk eller hud analogs som ble kultivert 4 uker. Celle levedyktighet etter blanding med passiv blander enhet teknikk var høyere enn tradisjonelle blande metoder. I tillegg forenkling av blending prosessen ved hjelp av miksing enheten minimerer antall håndtering trinn og gir bedre konsistens i omfanget av miksing. Til slutt, dette resulterer i bedre reproduserbarhet i begge celle distribusjon av bioink og konstruksjoner og eksperimentelle grupper. Deponering av vev bestemte ECM komponenter som GAGs og kollagen jeg ble observert for både brusk og huden analogs, henholdsvis etter 4 uker kultur. Dette angir fleksibilitet både det å blande teknikken og valgte konstruere geometri å dikte ulike vev mål. Fabrikasjon av både brusk og huden analogs utstilt fleksibilitet både bruk av en nanocellulose-alginate bioink og bioprinting teknikken for forskjellige utviklet vev mål. Vi vil diskutere to komponenter av studien nedenfor: (1) passiv enhet teknikk, og (2) atferd av celler i brusk og huden analogs.
Utvikling og optimalisering av en teknikk for blending av en celle suspensjon i en bioink var avgjørende for fabrikasjon av disse konstruksjoner. I motsetning til tradisjonelle lav viskositet hydrogel materialer resulterte på høy viskositet av bioinks i vanskeligheter i pre-cellularization av en bioink før du skriver ut. Som et alternativ til den tradisjonelle metoden for cellen innlemmelse i en bioink, ble en protokoll for ettrinns blanding av en celle suspensjon i en tyktflytende bioink utviklet og diskutert. I tillegg ble praktisk anvendelse av denne blande teknikken i produksjon av vev konstruksjoner evaluert. Denne ettrinns blande tilnærmingen har flere fordeler sammenlignet med tradisjonelle blander teknikker inkludert kontrollert blanding forhold, minimering av høy og uregelmessig skjær påkjenninger, og et lukket system å eliminere eksempel Lukk i miksing skip. Det er imidlertid flere avgjørende skritt i denne teknikken å sikre dens fordeler fremfor tradisjonelle metoder for cellen/bioink blanding. Det er viktig å sikre at cellene i cellen sprøyten er suspendert og godt blandet før blending. For stor av en tidsforskjell mellom løfte og overføring av cellene i sprøyten og start miksing prosessen kan forårsake cellene sedimenter og som vil resultere i ujevn miksing og distribusjon i en trykt filament. Hvis Sedimentasjon er observert, enkle inversjon (2 - 3 ganger) av er den passive blande enhet umiddelbart før blande tilstrekkelig til å resuspend cellene og sikre en jevn distribusjon før blending. Det er også viktig at luftbobler i sprøyter er eliminert eller minimert før for å sikre at blande forholdet forblir konstant. Hvis store luftbobler forblir i bioink kassetten før blending, anbefales det at løsningen skal kjøres gjennom miksing enhet en ekstra tid for å sikre grundig blande. Hvis luftbobler forblir, kan milde tappe av utskrift kassett/sprøyten fortrenge gjenværende luftbobler. I tillegg, hvis flere materiale blanding (flere blande enheter eller materiale) er nødvendig for mer komplisert konstruerer, må konsentrasjonen av bioinks/cell suspensjoner skal blandes justeres for å sikre at etter fortynne gjennom blander, riktig siste konsentrasjon oppnås fortsatt.
I forhold til andre blander teknikker er passiv blande enheten en roman tilnærming til cellularize bioinks. I motsetning til andre blander teknikker som dobbelt sprøyte miksing, eller under omrøring med en spatel og andre verktøy, kan passiv blande enheten mer konsistens i blanding på tvers av grupper og brukere. Natur manuell blander teknikker, for eksempel en slikkepott miksing, fører til større bruker-til-bruker variasjoner i omfanget av og frekvensen av miksing. I tillegg har lukkede systemer som passiv enhet og dobbelt sprøyte blande liten eller ingen prøve tap i forhold til manuell blanding i en Petriskål eller rør.
Begge vev analogs fabrikkert i dette manuskriptet besto av én type bioink og én eller to celletyper. Bioprinting av vev analogs som består av arkitekturer som inneholder områder av forskjellige bioinks med forskjellige celletyper kan imidlertid være nødvendig for fabrikasjon av flere fysiologiske vev konstruksjoner20,21, 22. Mer spesialisert bioinks med unike komposisjoner eller funksjonaliteten kan genereres gjennom blanding av flere typer eksisterende bioinks sammen for å skape multimaterial bioinks som har forskjellige komposisjoner eller funksjonaliteten23, 24. Dette kan være spesielt viktig vev overgang regioner som huden subcutaneous lag eller brusken til bein regionen en vev hvor en forløpning bioink sammensetning25,26 kan være nødvendig for å sikre utvikling av disse kritiske områdene i eget vev27. I tillegg kan en blanding enhet utnyttes for å blande i vekst faktorer og morphogens i bioinks før bioprinting. Eliminering av prøven tap med lukket blande system er attraktivt for bruk av dyre og lav konsentrasjon bioaktive faktorer, hvor prøven tap kan resultere i en endring til deres endelige konsentrasjon i den bioprinted konstruksjonen, spesielt når graderinger er involvert.
En begrensning med noen miksing teknikk, inkludert passiv blande enhet benyttet i denne studien, er risikoen for skade på mekanisk følsom celletyper. For eksempel isolert stamceller slik de fra benmarg eller fosteret, eller indusert pluripotent stamceller er mer utsatt for mekaniske28,29. Loven av miksing formidler unormale mekaniske påkjenninger på cellene på grunn av skjær krefter involvert i miksing, og de må være balansert for å bevare levedyktighet30. Mens bruken av primære fibroblaster og chondrocytes i denne studien resulterte i god levedyktighet (figur 2), er flere studier nødvendig for å fastslå trygt blande priser og prosenter for mer følsomme celletyper. Inntil da anbefales det at miksing utføres under langsom jevnt å maksimere levedyktighet. I tillegg var celle tetthet valgt i denne studien bestemt basert på tidligere studier1. Denne cellen tetthet kanskje ikke ideelt for alle celletyper.Spesielt kan blending celler i en høyere konsentrasjon resultere i økt celle-celle kontakter forbedre celle levedyktighet og vev formasjonen31,32. På samme måte, kan passiv blande enheten være gjelder blending celle spheroids eller andre cellen aggregater33 i bioinks.
Som foreslått og vist i denne studien, en passiv blande enhetssystemet kan raskt blande en celle suspensjon i en flytende bioink. Mens risikoen for mekanisk skade cellene fortsatt, gjør tilnærming mer konsistens i blanding innen en enkelt studie og over brukere. Pre-cellularized bioinks bruker denne tilnærmingen ble brukt til å dikte både brusk og huden analogs som ble kultivert 4 uker, og viste deponering av vev bestemt ECM markører. Fremtidige studier vil fokusere på bruken av passiv blande enhetssystemet for å blande spesialiserte bioinks fra standardiserte bioinks til fabrikasjon av mer komplekse vev analogs.
Disclosures
Forfatterne av dette manuskriptet er ansatte i CELLINK LLC.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen takk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| STARTINK Kit | CELLINK | SK0001 | Kit that contained all the elements for the CELLMIXER procedure |
| Live/Dead Kit | Life Technologies | L3224 | Kit for the analysis of cell viability after mixing |
| Masson's Trichrome | Sigma Aldrich | HT15-1KT | Kit for the analysis of collagen I deposition in the skin constructs |
| Alcian Blue | Sigma Aldrich | B8438-250ML | Kit for the analysis of glycosaminoglycan deposition in the skin constructs |
| INKREDIBLE+ bioprinter | CELLINK | Gen1+ | Printer utilized in the study |
| DMEM with Glutamax | Thermofisher | 10566016 | Media for culture of the cells |
| 10% fetal bovine serum | Thermofisher | A3160402 | Media supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | Media supplement |
| live cell imaging solution | thermofisher | A14291DJ | component utilized using live/dead imaging |
| inverted microscope | Olympus | IX73 | microscope utilized |
| a digital color camera | Olympus | XC10 | microscope camera utilized |
| cellSens imaging software | Olympus | n/a | stock software with the microscope |
| ImageJ | NIH | n/a | open source image analysis software |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | n/a | software for statistical analysis |
| Slic3r software (v1.2.9) | Slic3r | n/a | open-source software to convert .stl file to gcode |
| primary adult human dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-012 | cell source for fibroblasts |
References
- Avila, H. M., Schwarz, S., Rotter, N., Gatenholm, P. 3D bioprinting of human chondrocyte-laden nanocellulose hydrogels for patient-specific auricular cartilage regeneration. Bioprinting. 1, 22-35 (2016).
- Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue Eng Part C Methods. 20 (6), 473-484 (2013).
- Costantini, M., et al. Microfluidic-enhanced 3D bioprinting of aligned myoblast-laden hydrogels leads to functionally organized myofibers in vitro and in vivo. Biomaterials. 131, 98-110 (2017).
- Fedorovich, N. E., et al. Biofabrication of Osteochondral Tissue Equivalents by Printing Topologically Defined, Cell-Laden Hydrogel Scaffolds. Tissue Eng Part C Methods. 18 (1), 33-44 (2011).
- Vijayavenkataraman, S., Lu, W. F., Fuh, J. Y. H. 3D bioprinting of skin: a state-of-the-art review on modelling, materials, and processes. Biofabrication. 8 (3), 032001 (2016).
- Peltola, S. M., Melchels, F. P. W., Grijpma, D. W., Kellomäki, M. A review of rapid prototyping techniques for tissue engineering purposes. Ann Med. 40 (4), 268-280 (2008).
- Xu, T., Jin, J., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. Inkjet printing of viable mammalian cells. Biomaterials. 26 (1), 93-99 (2005).
- Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells. Biotechnol Bioeng. 106 (6), 963-969 (2010).
- Parsa, S., Gupta, M., Loizeau, F., Cheung, K. C. Effects of surfactant and gentle agitation on inkjet dispensing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 025003 (2010).
- Derby, B. Inkjet printing of functional and structural materials: fluid property requirements, feature stability, and resolution. Annu Rev Mater Res. 40, 395-414 (2010).
- Colosi, C., et al. Microfluidic Bioprinting of Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low-Viscosity Bioink. Adv Mater. 28 (4), 677-684 (2016).
- Ober, T. J., Foresti, D., Lewis, J. A. Active mixing of complex fluids at the microscale. Proc Natl Acad Sci. 112 (40), 12293-12298 (2015).
- Shabnam, P., Madhuja, G., Frédéric, L., Karen, C. C. Effects of surfactant and gentle agitation on inkjet dispensing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 025003 (2010).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnol Bioeng. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Niu, X., Lee, Y. -K. Efficient spatial-temporal chaotic mixing in microchannels. J Micromech Microeng. 13 (3), 454 (2003).
- Liu, R. H., et al. Passive mixing in a three-dimensional serpentine microchannel. J Microelectromech Syst. 9 (2), 190-197 (2000).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr protoc immunol. , A3. B. 1-A3. B (2001).
- Scott, J., Dorling, J. Differential staining of acid glycosaminoglycans (mucopolysaccharides) by alcian blue in salt solutions. Histochem Cell Biol. 5 (3), 221-233 (1965).
- Garvey, W. Modified elastic tissue-Masson trichrome stain. Stain technol. 59 (4), 213-216 (1984).
- Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. -M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. Complex heterogeneous tissue constructs containing multiple cell types prepared by inkjet printing technology. Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).
- Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
- Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proc Natl Acad Sci. 113 (12), 3179-3184 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Adv Mater. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- KÖpf, M., Campos, D. F. D., Blaeser, A., Sen, K. S., Fischer, H. A tailored three-dimensionally printable agarose-collagen blend allows encapsulation, spreading, and attachment of human umbilical artery smooth muscle cells. Biofabrication. 8 (2), 025011 (2016).
- Gurkan, U. A., et al. Engineering anisotropic biomimetic fibrocartilage microenvironment by bioprinting mesenchymal stem cells in nanoliter gel droplets. Mol Pharm. 11 (7), 2151-2159 (2014).
- Ma, Y., Ji, Y., Huang, G., Ling, K., Zhang, X., Xu, F. Bioprinting 3D cell-laden hydrogel microarray for screening human periodontal ligament stem cell response to extracellular matrix. Biofabrication. 7 (4), 044105 (2015).
- Lu, H. H., Thomopoulos, S. Functional attachment of soft tissues to bone: development, healing, and tissue engineering. Annu Rev Biomed Eng. 15, 201-226 (2013).
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2011).
- Parisi-Amon, A., Mulyasasmita, W., Chung, C., Heilshorn, S. C. Protein-Engineered Injectable Hydrogel to Improve Retention of Transplanted Adipose-Derived Stem Cells. Adv Healthc Mater. 2 (3), 428-432 (2013).
- Qiu, X., De Jesus, J., Pennell, M., Troiani, M., Haun, J. B. Microfluidic device for mechanical dissociation of cancer cell aggregates into single cells. Lab Chip. 15 (1), 339-350 (2015).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14 (5), 633-640 (2002).
- Loessner, D., et al. Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells. Biomaterials. 31 (32), 8494-8506 (2010).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
