Summary
उपास्थि और त्वचा के अनुरूप एक nanocellulose-alginate आधारित bioink का उपयोग कर मुद्रित किया गया । स्याही एक एकल कदम निष्क्रिय मिश्रण इकाई के माध्यम से मुद्रण से पहले सेलुलर थे । निर्माण के लिए समान रूप से सेलुलर हो प्रदर्शन किया गया, उच्च व्यवहार्यता है, और भेदभाव के अनुकूल मार्करों का प्रदर्शन ।
Abstract
प्रिंटिंग ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए निर्माण के तेजी से और प्रतिलिपि निर्माण के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है । इस अध्ययन में, दोनों उपास्थि और त्वचा के अनुरूप bioink पूर्व cellularization एक उपंयास निष्क्रिय मिश्रण इकाई तकनीक का उपयोग करने के बाद गढ़े गए थे । इस तकनीक को एक उच्च चिपचिपा bioink में एक सेल निलंबन के मिश्रण में शामिल कदम को सरल बनाने के उद्देश्य के साथ विकसित किया गया था । आवश्यक के माध्यम से जमा रेशा का समाधान मुद्रण से पहले सेल वितरण में एकरूपता के आश्वासन को कोशिकाओं या बड़े सेल के झुरमुट कि सुई रोकना कर सकते है की अवधारण के बिना क्षेत्रों के जमाव से बचने के लिए । हम तेजी से दोनों उपास्थि और त्वचा के अनुरूप के लिए एक bioink से पहले एक सेल निलंबन मिश्रण करने की क्षमता का प्रदर्शन । दोनों ऊतक अनुरूप अप करने के लिए 4 सप्ताह के लिए संस्कृति हो सकता है । ऊतकीय विश्लेषण दोनों सेल व्यवहार्यता और ऊतक विशिष्ट extracellular मैट्रिक्स (ECM) मार्करों जैसे glycosaminoglycans (परिहास) और कोलेजन मैं क्रमशः के रूप में प्रदर्शन किया ।
Introduction
हाल के वर्षों में, तीन आयामी (3 डी) प्रिंटिंग प्रौद्योगिकी और अधिक शोधकर्ताओं के लिए सुलभ हो गया है, की अनुमति तकनीक और अधिक व्यापक रूप से ऊतक सादृश्य के निर्माण के लिए उपयोग किया जाता है । प्रिंटिंग के लिए बहुमुखी ऊतक के निर्माण की तेजी से और दोहराया निर्माण की सुविधा के द्वारा जैव चिकित्सा अनुसंधान में क्रांतिकारी बदलाव का वादा किया । इस तरह के प्रिंटिंग तकनीक की जड़ में तीन आयामों में (एक स्याही के रूप में जाना जाता है) के लिए ठीक से जमाव को नियंत्रित करने की क्षमता में देता है । यह मैट्रिक्स रचनाओं, सक्रिय कारकों के विभिंन क्षेत्रों के साथ जटिल पाड़ों की पीढ़ी की अनुमति देता है, और कोशिकाओं है कि और अधिक सही देशी ऊतक संरचना दोहराऊंगा कर सकते हैं ।
प्रिंटिंग उपास्थि1, त्वचा2, मांसपेशी3, और हड्डी4सहित कई ऊतक अनुप्रयोगों के लिए निर्माण के लिए उपयोग किया गया है । इन ऊतकों को अपने आंतरिक धारीदार सूक्ष्म आर्किटेक्चर है कि परत द्वारा recapitulation के लिए उपयुक्त है द्वारा परत के कारण प्रिंटिंग के लिए आकर्षक हैं । विशेष रूप से, त्वचा के पास एक अच्छी तरह से परिभाषित multilayered संरचना5, जो परत के माध्यम से निर्माण के लिए उपयुक्त है, द्वारा परत इस तरह के रूप में प्रिंटिंग तकनीक । इसके अतिरिक्त, प्रिंटिंग के लिए उत्पादन है कि आवश्यक संरचनात्मक आयामों और आकार के अधिकारी के लिए ऊतक दोष की मरंमत का उपयोग किया जा सकता है । रोगी-विशिष्ट आकार और आकार6 के साथ सामग्री उत्पन्न करने की क्षमता सहित कई ऊतकों की आंशिक मरम्मत की मांग को संबोधित करने के लिए शुरू कर सकते हैं लेकिन अस्थि दोषों को सीमित नहीं, उपास्थि क्षति, और त्वचा के घावों जिनकी हद से भिन्न होता है मरीज को रोगी ।
इस अध्ययन में, दो ऊतक के अनुरूप (जोड़दार उपास्थि और त्वचा) पूर्व के प्रिंटिंग-सेल् फी इंक के माध्यम से गढ़े गए थे । सेल के निलंबन के साथ एक bioink के पर्याप्त सम्मिश्रण सुनिश्चित करना है कि कोशिका व्यवहार्यता के संरक्षण जबकि वर्दी सेल वितरण सुनिश्चित कर सकते हैं एक चुनौती हो सकती है । बाहर निकालना के माध्यम से प्रिंटिंग के लिए उपयुक्त स्याही अक्सर अत्यधिक चिपचिपा रहे है और इसलिए एक समरूप मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए व्यापक मिश्रण की आवश्यकता है । कोशिकाओं को यांत्रिक क्षति कठोर मिश्रण शर्तों के तहत हो सकता है और नकारात्मक व्यवहार्यता को प्रभावित । अध्ययनों से पता चला है कि inkjet मुद्रण प्रक्रिया के दौरान सबसे सेल मौत7,8मिश्रण के रूप में तैयारी के दौरान होता है । जबकि पारंपरिक आंदोलन के साथ9 मिश्रण inkjet मुद्रण10के लिए उपयुक्त कम चिपचिपापन स्याही के लिए पर्याप्त हो सकता है, एक उच्च चिपचिपापन bioink में कोशिकाओं के मिश्रण अधिक बाहर निकालना के लिए उपयुक्त है प्रिंटिंग अधिक कठिन है । इस जरूरत को संबोधित करते हुए, मिश्रण नलिका का उपयोग प्रिंटिंग प्रक्रिया के दौरान11के दौरान स्याही के सम्मिश्रण के लिए और अधिक लोकप्रिय हो गया है । इन मिक्सर भी व्यापक रूप से microfluidics अनुसंधान में उपयोग किया गया है, जहां कम रेनॉल्ड्स संख्या के साथ तरल पदार्थ के मिश्रण महत्वपूर्ण है12. एक सतत मिश्रण प्रक्रिया के उपयोग के लिए एक bioink में एक सेल निलंबन मिश्रण मुद्रण प्रक्रिया के दौरान एकरूपता के लिए अनुमति होगी । हालांकि, के बाद से सेल सस्पेंशन एक bioink की तुलना में कम चिपचिपापन अधिकारी, कठिनाइयों मुद्रण प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं के अवसाद को रोकने में पैदा होगा9,13,14। वैकल्पिक रूप से, मुद्रण करने से पहले एक bioink में कक्षों के मिश्रण इस समस्या को हल कर सकते हैं ।
एक bioink में सम्मिश्रण के दौरान कोशिका मृत्यु को कम करने के लिए, हम कदम की न्यूनतम संख्या में एक bioink में कोशिकाओं मिश्रण करने के लिए एक निष्क्रिय मिश्रण इकाई पर आधारित एक तकनीक विकसित की है. मिश्रण इकाई के माध्यम से सामग्री के प्रवाह के माध्यम से उत्पन्न अराजक मिश्रण reproducibly करने के लिए पर्याप्त है एक साथ दो घटक मिश्रण15,16. यह विधि मुख्य रूप से किसी भी bioink कि बाहर निकालना के लिए उपयुक्त के साथ किसी भी सेल निलंबन के सम्मिश्रण को सरल बनाने के लिए विकसित किया गया था । मिश्रण प्रक्रिया में कदम की संख्या मिश्रण में उपयोगकर्ता के लिए उपयोगकर्ता भिन्नता को खत्म करने के लिए कम किया गया था. अत्यधिक मिश्रण कदम समय लगता है और सभी स्याही के लिए लागू नहीं हो सकता है, विशेष रूप से जब कोशिकाओं को शामिल कर रहे हैं । माध्यमिक, हम एक मिश्रण प्रक्रिया है कि स्वयं दोनों को समाहित किया गया था विकसित करने के उद्देश्य से बाँझ की रक्षा और नमूना हानि को कम ।
इस पांडुलिपि में, हम एक निष्क्रिय मिश्रण इकाई तकनीक है कि हैंडलिंग और उच्च कोशिका व्यवहार्यता और वर्दी वितरण में परिणाम को कम करता है का उपयोग कर एक bioink के साथ एक सेल निलंबन के सम्मिश्रण का प्रदर्शन । इन पूर्व सेलुलर स्याही तो या तो एक उपास्थि या त्वचा एक या दो प्रकार के सेल के साथ निर्माण, क्रमशः है कि 6 सप्ताह तक के लिए संस्कृति रहे है प्रिंट का उपयोग कर रहे हैं । bioink का उपयोग एक alginate-nanocellulose मिश्रण है, जो पहले1प्रिंट करने के लिए उपयुक्तता दिखाया गया है ।
Protocol
यह प्रोटोकॉल Chalmers विश्वविद्यालय की मानव अनुसंधान आचार समिति के दिशानिर्देशों का पालन करता है ।
नोट: सभी कदम एक बाँझ सुरक्षा कैबिनेट के भीतर प्रदर्शन किया जा करने के लिए कर रहे हैं.
1. उपभोग्य सामग्रियों, Bioink, और कोशिकाओं की तैयारी
- दो सीरिंज प्राप्त करें, एक सिरिंज (चित्रा 1ए) सेल निलंबन के लिए है, जबकि अन्य सिरिंज bioink (चित्रा 1बी) के लिए है.
- एक बाँझ निष्क्रिय मिश्रण इकाई (चित्रा 1ग) एक Luer ताला कनेक्शन के माध्यम से दोहरी सीरिंज के साथ युग्मित किया जा सकता है कि प्राप्त करें ।
- एक वितरण इकाई (चित्रा 1डी) प्राप्त करें कि दो बाँझ सीरिंज से एक मात्रा एक साथ एक नियंत्रित दर पर बाहर निकालना कर सकते हैं ।
नोट: इस अध्ययन में उपयोग मिश्रण अनुपात 10:1 है । इसलिए, एक 12 मिलीलीटर सिरिंज और एक 1 एमएल सिरिंज 10:1 मिश्रण इकाई द्वारा की आवश्यकता के रूप में उपयोग करें । - एक बाँझ कारतूस प्राप्त करें (चित्रा 1ई) और एक बाँझ महिला-महिला Luer ताला कनेक्टर सीधे bioink और सेल निलंबन में मिश्रित करने के लिए.
- प्राप्त करें या एक सेल निलंबन के साथ सम्मिश्रण के लिए bioink तैयार.
नोट: इस प्रोटोकॉल में, एक nanocellulose/alginate आधारित bioink का उपयोग किया गया था । इस bioink पार एक बाँझ १०० mM CaCl2 समाधान पोस्ट मुद्रण के अलावा के माध्यम से जुड़ा हुआ है । - ०.५% trypsin/EDTA समाधान का उपयोग करके कक्षों को अलग करें और trypan नीली बहिष्करण विधि17का उपयोग करके कक्षों की कुल संख्या की गणना करे ।
नोट: इस प्रोटोकॉल में, मानव fibroblasts का उपयोग किया गया । - निर्धारित क्या सेल घनत्व अंतिम मुद्रित निर्माण में वांछित है । निम्नलिखित समीकरणों का उपयोग करके परिकलित करें कि इस लक्ष्य अंतिम कोशिका घनत्व को प्राप्त करने के लिए काटा गया कोशिकाओं की एकाग्रता को पतला किया जाना चाहिए.
नोट: इस प्रोटोकॉल में, 5 x 106 कोशिकाओं की एक अंतिम कोशिका घनत्व/- प्रयोगों के लिए एक वांछित कोशिका एकाग्रता का चयन करें: Cकक्ष (कक्ष/
- वांछित निर्माण की कुल संख्या के आधार पर bioink आवश्यक, Vbioinkकी राशि की गणना करें:
vbioink = vconstruct ion × NContructs
नोट: उदाहरण के लिए, प्रति निर्माण bioink की मात्रा १०० µ l है । अगर 30 कंस् प्रिंटेड है तो bioink वॉल्यूम की जरूरत 3 mL है । - आवश्यक कक्षों की संख्या परिकलित करें:
Nकक्ष = Cकक्ष (१.१ × Vलिंक) - 1/10वें bioink की मात्रा में कोशिकाओं (एनकोशिकाओं) reसस्पेंड:
vcell suspension = ०.१ × vअपलिंक
नोट: उदाहरण के लिए, यदि vbioink = 3 ml, तब vकक्ष निलंबन = ०.१ × 3 मिलीलीटर = ०.३ ml
2. सेल सस्पेंशन और Bioink का मिश्रण
- सेल निलंबन सिरिंज में कक्ष निलंबन स्थानांतरण ।
- एक और सिरिंज के लिए bioink स्थानांतरण या एक bioink युक्त सिरिंज प्राप्त करते हैं.
- bioink सिरिंज सवार वापस खींचो और औषधालय इकाई में सिरिंज डालें. इकाई को अनुलंब रूप से Luer lock कनेक्टर ऊपर की ओर (चित्र 1f1) के साथ स्थित है ।
- सेल के सवार खींचो bioink सिरिंज और वितरण इकाई में डालने के रूप में एक समान लंबाई के लिए वापस सिरिंज (चित्रा 1f2).
- मिश्रण इकाई को Luer lock connectors (चित्रा 1f3) घुमा द्वारा दोनों सीरिंज संलग्न ।
- प्रधानमंत्री वितरण इकाई पर धकेलने के लिए सिरिंज में हवा बाहर निकालना द्वारा मिश्रण प्रणाली । Luer लॉक (चित्रा 1g4) तक पहुंचने के समाधान से पहले भड़काना बंद करो ।
- भड़काने के बाद, Luer ताला संबंधक के माध्यम से मिश्रण इकाई के अंत करने के लिए भरने कारतूस संलग्न (चित्रा 1g5) । सुनिश्चित करें कि भरने कारतूस में सवार लगाव से पहले नीचे है ।
- धीरे सेक (चित्रा 1h6) वितरण इकाई कारतूस (चित्रा 1i7) में एक साथ bioink और सेल निलंबन मिश्रण करने के लिए ।
- एक बाँझ प्लास्टिक टिप के साथ नीचे भरने कारतूस में सवार पुश करने के लिए मिश्रण के बाद bioink-सेल मिश्रण से संपर्क करें । कोशिका/bioink मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए संकुचित जब तक वितरण मिश्रण इकाई में वापस नहीं किया जाता है रखें ।
- कारतूस टोपी और धीरे काम की सतह पर नल कारतूस (पिस्टन अंत) के शीर्ष करने के लिए किसी भी हवा के बुलबुले को स्थानांतरित करने के लिए ।
नोट: इस बिंदु पर, कक्ष/bioink मिश्रण मुद्रण के लिए तैयार है । निंन अनुभागों विशिष्ट अनुप्रयोगों और मुद्रण कार्यविधियों को बाह्यरेखांकित करेगा ।
3. मैनुअल रंग मिश्रण की तुलना में एक मिश्रण इकाई का उपयोग कर सेल व्यवहार्यता का निर्धारण
- अलग मानव fibroblasts (7 गद्यांश) के साथ एक ०.५% trypsin/EDTA समाधान पर ८०% संगम, संख्या गिनती, और पर्याप्त कोशिका घनत्व पर संस्कृति माध्यम में reसस्पैंड bioink (1:10 सेल: bioink अनुपात) के साथ सम्मिश्रण के बाद एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 5 x 10 6 कोशिकाएं एमएल/
- सेल व्यवहार्यता पर दोनों तकनीकों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए या तो निष्क्रिय मिश्रण इकाई तकनीक (चरण 2) या via रंग का उपयोग कर bioink में कोशिकाओं मिश्रण ।
- निष्क्रिय मिश्रण इकाई तकनीक 1, 2, या 3 बार पार के लिए एक मोल्ड में वितरण करने से पहले का उपयोग कर bioink में कोशिकाओं मिश्रण-१०० mM CaCl2का उपयोग कर जोड़ने ।
नोट: अतिरिक्त मिश्रणों प्रदर्शन करने के लिए, सेल/bioink सीधे एक सिरिंज में बजाय एक कारतूस का मिश्रण । तो पिछले प्रोटोकॉल के बाद मिश्रण इकाई के माध्यम से मिश्रण रीमिक्स लेकिन सेल सिरिंज घटक के बिना. - 30, ६०, या ९० s की अवधि के लिए एक रंग के माध्यम से एक अलग bioink मैनुअल यांत्रिक मिश्रण का उपयोग कर में कोशिकाओं मिश्रण-पार के लिए एक सांचे में ढालना में मिश्रण (प्रत्येक मिश्रण समय के लिए) १०० mM CaCl का उपयोग कर जोड़ने2।
- मानक शर्तों के तहत पार से जोड़ने और संस्कृति के पूरा होने के बाद नमूनों को एक अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें ।
- संस्कृति के 1 दिन बाद, निर्माणों को धो लें (n = 3-4 प्रति समूह) सीरम-मुक्त सेल संस्कृति मध्यम में 30 min. दाग के लिए एक धुंधला समाधान के साथ निर्माण में कोशिकाओं (4 µ एम Calcein AM, 1 µ एम Ethidium homodimer-1) 30 मिनट के लिए ।
- धो दो अतिरिक्त समय, और सीरम मुक्त सेल संस्कृति माध्यम में नमूनों की एक कुल के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे की मशीन ।
4. एक एकल कोशिका प्रकार के साथ उपास्थि अनुरूप का मुद्रण
- वांछित ऊतक एनालॉग के एक 3 डी मॉडल ड्रा. एक Gcode फाइल को प्रिंटिंग के लिए कन्वर्ट करें और Gcode फाइल को रिप्रिंटर1पर लोड करे ।
नोट: इस प्रोटोकॉल में, आयाम ४.८ x ४.८ x ०.९ mm3 के साथ एक वर्ग संरचना एक STL फ़ाइल के रूप में निर्यात किया गया था । एक Gcode फ़ाइल निम्न सेटिंग्स का उपयोग कर जाली संरचना के उत्पन्न किया गया था: परत मोटाई, ०.३ मिमी; infill पैटर्न, सीधा; infill घनत्व, 25%; स्पीड, 10 मिमी/ - अलग और cryopreserve प्राथमिक मानव नाक chondrocytes (hNC) रोगियों से संदर्भित प्रोटोकॉल का पालन1।
- गल और विस्तार cryopreserved hNCs और ३७ डिग्री सेल्सियस पर मानक संस्कृति माध्यम का उपयोग कर monolayer संस्कृति में एक बार विस्तार । ८०-९०% संगम के साथ एक ०.५% trypsin/EDTA समाधान और गिनती एक trypan नीले बहिष्करण प्रोटोकॉल का उपयोग करके कक्षों को अलग करें । सभी प्रयोगों 2 पारित होने पर hNCs का उपयोग कर आयोजित किया गया ।
- १०० पर hNCs reसस्पेंड x 106 कोशिकाओं/एमएल के ३०० µ एल के भीतर संस्कृति मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन-streptomycin के साथ पूरक, और ५० µ जी/एमएल ascorbic एसिड, bioink के साथ सम्मिश्रण के लिए तैयार करने में ।
- एक 10:1 bioink में निष्क्रिय मिश्रण इकाई प्रोटोकॉल के बाद एक nanocellulose/alginate आधारित bioink में hNC सेल निलंबन ब्लेंड: सेल निलंबन अनुपात 9 x 106 कोशिकाओं की एक अंतिम कोशिका एकाग्रता प्राप्त करने के लिए/
- यह सुनिश्चित करें कि यूवी निवेश के माध्यम से निष्फल है और ७०% इथेनॉल के साथ नीचे पोंछे । एक लामिना प्रवाह कैबिनेट में रखकर बाँझ बनाए रखें.
- bioink/सेल निलंबन मिश्रणों युक्त कारतूस के लिए बाँझ मुद्रण नलिका देते हैं और में सम्मिलित करें.
- या तो मैंयुअल रूप से या प्रिंटर के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल द्वारा जांचना ।
- जाली का प्रिंट-संरचित, सेल लादेन निम्नलिखित मुद्रण मापदंडों का उपयोग कर निर्माण: 25 केपीए के दबाव में 25G शंकु नोक । एक नियंत्रण के रूप में (सेल मध्यम नहीं कोशिकाओं से युक्त) के साथ मिश्रित प्रिंट सेल मुक्त constructs ।
- पार-5 मिनट के लिए १०० mM CaCl2 के एक ईओण समाधान जोड़ने के द्वारा निर्माण लिंक । निर्माण और मानक संस्कृति शर्तों के तहत संस्कृति माध्यम में मशीन कुल्ला (३७ ° c, 5% CO2, और ९५% सापेक्षिक आर्द्रता) । हर दूसरे या तीसरे दिन मीडिया बदलें ।
- 2 और 4 सप्ताह में ऊतकीय विश्लेषण के लिए नमूने ले लीजिए । एक Alcian नीले दाग18का उपयोग कर उत्पादन के लिए नमूने दाग ।
5. दो सेल प्रकार के साथ त्वचा के अनुरूप का मुद्रण
- वांछित ऊतक एनालॉग के एक 3 डी मॉडल ड्रा और एक Gcode फ़ाइल को प्रिंटिंग के लिए कंवर्ट । Gcode फाइल को रिप्रिंटर पर लोड करें ।
नोट: इस प्रोटोकॉल में, आयाम ४.८ x ४.८ x ०.९ mm3 के साथ एक वर्ग संरचना एक STL फ़ाइल के रूप में निर्यात किया गया था । परत मोटाई, ०.३ मिमी: फिर एक Gcode फ़ाइल निम्न सेटिंग्स का उपयोग कर जाली संरचना के उत्पन्न किया गया था; infill पैटर्न, सीधा; infill घनत्व, 25%; स्पीड, 10 मिमी/ - प्रिंटिंग के लिए bioink में संमिश्रण के लिए सेल तैयार करें । त्वचा के अनुरूप निर्माण के लिए, दो सेल प्रकार का उपयोग किया गया । दो सेल प्रकार के bioink और प्रिंटिंग में मिश्रित थे ।
- प्राथमिक HDF प्राप्त करें । DMEM विकास मीडिया में इन कोशिकाओं को बनाए रखने के 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन-streptomycin, और ५० µ g/एमएल ascorbic एसिड के साथ पूरक । एक ०.५% trypsin/EDTA समाधान और गिनती के साथ ८०-९०% संगम पर कोशिकाओं को अलग करें ।
- संदर्भित प्रोटोकॉल1का अनुसरण करके रोगियों से प्राथमिक hNC को अलग और cryopreserve । गल और monolayer कल्चर में cryopreserved hNCs का विस्तार. एक ०.५% trypsin/EDTA समाधान और गिनती के साथ ८०-९०% संगम पर कोशिकाओं को अलग करें ।
- वृद्धि मीडिया के भीतर १०० x 106 कोशिकाओं/एमएल में दोनों कक्ष प्रकार reसस्पेंड । मीडिया के ३०० µ एल में १०० x 106 कोशिकाओं/एमएल के अंतिम कुल एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए एक साथ सेल सस्पेंशन को 1:1 अनुपात में मिलाएं ।
- एक 10:1 bioink पर निष्क्रिय मिश्रण इकाई प्रोटोकॉल के बाद एक nanocellulose/alginate आधारित bioink में HDF और hNC के 50:50 सेल निलंबन ब्लेंड: सेल निलंबन अनुपात 9 x 106 कोशिकाओं की एक अंतिम कोशिका एकाग्रता प्राप्त करने के लिए/
- यह सुनिश्चित करें कि एक लामिना प्रवाह कैबिनेट में रखा गया है या बाँझ को बनाए रखने के लिए ।
- bioink/सेल निलंबन मिश्रणों युक्त कारतूस के लिए बाँझ मुद्रण नलिका देते हैं और में सम्मिलित करें.
- या तो मैंयुअल रूप से या प्रिंटर के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल को जांचना ।
- जाली का प्रिंट-संरचित, सेल लादेन निम्नलिखित मुद्रण मापदंडों का उपयोग कर निर्माण: 25 केपीए के दबाव में 25G शंकु नोक । एक नियंत्रण के रूप में (सेल मध्यम नहीं कोशिकाओं से युक्त) के साथ मिश्रित प्रिंट सेल मुक्त constructs ।
- पार-5 मिनट के लिए १०० mM CaCl2 के एक ईओण समाधान जोड़ने के द्वारा निर्माण लिंक । निर्माण और मानक संस्कृति शर्तों के तहत संस्कृति माध्यम में मशीन कुल्ला (३७ ° c, 5% CO2, और ९५% सापेक्षिक आर्द्रता) । हर दूसरे या तीसरे दिन मीडिया बदलें ।
- 2 और 4 सप्ताह में ऊतकीय विश्लेषण के लिए नमूने ले लीजिए । दाग के लिए नमूने कोलेजन मैं एक Masson trichrome दाग का उपयोग कर उत्पादन19।
Representative Results
इस पांडुलिपि में परिणाम दो वर्गों में विभाजित हैं । सबसे पहले, कोशिका व्यवहार्यता के बाद या तो यांत्रिक विधि या निष्क्रिय मिश्रण इकाई के साथ मिश्रण का विश्लेषण किया गया । अगले, उपास्थि और त्वचा का निर्माण और संस्कृति प्रासंगिक ऊतकीय मार्करों के लिए विश्लेषण किया गया ।
दोनों ही मामलों में सेल वितरण समरूप दिखाई दिया । हालांकि, एक रंग का उपयोग कर हाथ से मिश्रण की कार्रवाई (चित्रा 2बी) एक निष्क्रिय मिश्रण इकाई (चित्रा 2ए) के साथ मिश्रण से अधिक विचरण किया है । हद, गति, और एक रंग के साथ मिश्रण तकनीक अत्यधिक उपयोगकर्ता पर निर्भर है । हालांकि, एक निष्क्रिय मिश्रण इकाई के साथ एक bioink में कोशिकाओं के मिश्रण मानकर मिश्रण और बैचों भर में भिन्नता को कम करता है. इसके अलावा, 30, ६०, और ९० एस मिश्रण समय bioink की एक बड़ी मात्रा में कोशिकाओं की एक बड़ी मात्रा के मिश्रण के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है । एक रंग के साथ मिश्रण के माध्यम से अधिक कठोर सम्मिश्रण आवश्यक हो सकता है. तुलना में, एक निष्क्रिय मिश्रण इकाई का उपयोग बेहतर सम्मिश्रण के दौरान bioink करने के लिए कोशिकाओं के मिश्रण अनुपात का कहना है और यह सुनिश्चित करता है कि एक सजातीय मिश्रण किया जाता है. इसके अतिरिक्त, नमूना हानि पारंपरिक मिश्रण तकनीक के साथ एक चिंता का विषय है, जहां bioink पेट्री व्यंजन, ट्यूबों, और मिश्रण उनके उच्च चिपचिपापन के कारण उपकरणों में पीछे छोड़ दिया जा सकता है । एक मिश्रण इकाई के साथ मिश्रण के लिए सेल व्यवहार्यता उच्च था (& #62; ९०%) 1, 2, या 3 बार । जब निष्क्रिय मिश्रण इकाई का उपयोग किया गया था, सम्मिश्रण एक धीमी गति से स्थिर मिश्रण दर पर के बारे में 1 मिनट लिया । जबकि एक रंग के साथ मिश्रण के लिए मिश्रण के बाद उच्च व्यवहार्यता प्रदर्शित 30 और ६० एस, अधिक से अधिक ९० की व्यवहार्यता में एक महत्वपूर्ण कमी के परिणामस्वरूप अंय समूहों की तुलना में एस (७७.९ ± 14%, p & #60; ०.०५) (चित्रा 2सी) । यह अत्यधिक मिश्रण है कि कोशिकाओं को नुकसान का कारण बनता है के कारण हो सकता है । लंबे समय तक जीवित/14 दिनों और संस्कृति के 28 दिनों के बाद दाग है अनुपूरक चित्रा 1में दिखाया गया है । कोशिकाओं को 14 दिन से फैल शुरू, और 28 दिन से अत्यधिक फैले हुए हैं, और अच्छी व्यवहार्यता का संकेत ।
संस्कृति के बाद, दोनों उपास्थि और त्वचा ऊतक अनुरूप प्रोटोकॉल के माध्यम से विश्लेषण किया गया । 0, 14, और 28 दिनों में उपास्थि के निर्माण का विश्लेषण की मात्रा और कवरेज में वृद्धि से पता चलता है के रूप में एक Alcian नीले दाग के माध्यम से प्रदर्शन किया (चित्रा 3एक-3 सी) । दाग के अभाव 0 दिन में देखा है, जबकि 14 दिन में धुंधला कोशिकाओं को समीपस्थ स्थानों तक ही सीमित है । हालांकि, संस्कृति के 28 दिन तक, Alcian नीले निर्माण भर में पाया जाता है, एक chondrocytic ECM के गठन का प्रदर्शन । मुद्रित त्वचा का निर्माण ऊतकीय कोलेजन के माध्यम से विश्लेषण मैं एक Masson Trichrome दाग का उपयोग किया गया (चित्रा 3डी-3f) । उपास्थि का निर्माण करने के लिए इसी तरह, दिन 0 नमूनों कोई कोलेजन जमाव का प्रदर्शन किया. संस्कृति के 14 दिन तक, कोलेजन का पर्याप्त जमा कोशिकाओं के आसपास और निर्माण की सतह के साथ नोट किया गया । यह आगे 28 दिन से बढ़ाया गया था, के रूप में घने कोलेजन परतों के निर्माण की सतह पर और थोक के भीतर पाए गए ।
चित्र 1 : निष्क्रिय मिश्रण इकाई प्रणाली । (क) 1 एमएल सिरिंज सेल निलंबन के लिए, (ख) bioink के साथ 12 मिलीलीटर सिरिंज, (सी) औषधालय इकाई, (घ) निष्क्रिय मिश्रण इकाई, (ई) भरने कारतूस, (च) bioink सिरिंज के विधानसभा (1) और सेल निलंबन सिरिंज (2) औषधालय इकाई में, दोनों सीरिंज के अंत में निष्क्रिय मिश्रण इकाई की कुर्की (३), (छ) महिला-महिला Luer ताला कनेक्टर की कुर्की (४) और भरना कारतूस का मोह (५) विधानसभा को पूरा करता है, (ज ) के लिए वितरण इकाई सेक (6) प्रधानमंत्री मिश्रण इकाई, (मैं) को वितरण इकाई पर नीचे धक्का के लिए bioink के साथ सेल निलंबन मिश्रण और भरने कारतूस (7) में बांटना जारी है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 : सेल व्यवहार्यता छवियां और विश्लेषण. प्रतिनिधि छवियों को निष्क्रिय मिश्रण इकाई 1, 2, या 3 बार (एक) या 30, ६०, या ९० सेकंड (बी) और 3 डी संस्कृति के लिए 1 दिन के लिए रंग के साथ मिश्रण के बाद लाइव (हरी) और मृत (लाल) मानव fibroblasts दिखा । 4x आवर्धन पर छवियां दिखाई जाती हैं । स्केल सलाखों 1 दिन के लिए निष्क्रिय मिश्रण इकाई या रंग और 3 डी संस्कृति के साथ मिश्रण के बाद मानव fibroblasts की २०० µm. (ग) प्रतिशत औसत व्यवहार्यता का संकेत मिलता है । त्रुटि पट्टियां माध्य का मानक विचलन, * ०.००५ दिखाएँ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: ऊतक विशिष्ट Extracellular मैट्रिक्स जमाव । (a) दिन 0, (b) 14, और (c) 28 में glycosaminoglycans Alcian नीला का उपयोग करने के लिए मुद्रित उपास्थि का निर्माण दाग । छवियां 5x आवर्धन पर कब्जा कर लिया । प्रिंटेड त्वचा का निर्माण कोलेजन के लिए सना हुआ मैं Masson Trichrome (डी) दिन 0, (ई) 14, और (एफ) 28 का उपयोग कर । छवियां 5x आवर्धन पर कब्जा कर लिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
अनुपूरक चित्रा 1: 14 दिन में सेल व्यवहार्यता (एक), और 28 दिन (बी) । स्केल बार २०० µm है, हरी जीवित कोशिकाओं को संदर्भित करता है, लाल मृत कोशिकाओं को संदर्भित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Discussion
के रूप में इस पांडुलिपि में प्रदर्शन किया, पूर्व-सेलुलर स्याही के लिए या तो उपास्थि या त्वचा के अनुरूप है कि अप करने के लिए 4 सप्ताह के लिए संस्कृति थे गढ़े का प्रिंट थे । निष्क्रिय मिश्रण इकाई तकनीक का उपयोग कर सम्मिश्रण के बाद सेल व्यवहार्यता पारंपरिक मिश्रण तरीकों की तुलना में अधिक था. इसके अतिरिक्त, मिश्रण इकाई का उपयोग कर मिश्रण की प्रक्रिया का सरलीकरण कदम हैंडलिंग की संख्या को कम करता है और मिश्रण की हद में बेहतर स्थिरता के लिए अनुमति देता है । अंततः, bioink के भीतर दोनों सेल वितरण में बेहतर reproducibility में यह परिणाम है, और निर्माण और प्रयोगात्मक समूहों के पार । ऐसे परिहास और कोलेजन के रूप में ऊतक विशिष्ट ECM घटकों के जमाव मैं दोनों उपास्थि और त्वचा के अनुरूप के लिए मनाया गया था, क्रमशः संस्कृति के 4 सप्ताह के बाद । यह दोनों मिश्रण तकनीक और चुना संरचना के लचीलेपन के लिए अलग ऊतक लक्ष्य बनाना इंगित करता है । दोनों उपास्थि और त्वचा के अनुरूप का निर्माण एक nanocellulose-alginate bioink और विशिष्ट इंजीनियर ऊतक लक्ष्य के लिए के लिए प्रिंटिंग तकनीक के दोनों का उपयोग के लचीलेपन का प्रदर्शन किया । हम नीचे अध्ययन के दो घटकों पर चर्चा करेंगे: (1) निष्क्रिय मिश्रण इकाई तकनीक, और (2) उपास्थि और त्वचा के अनुरूप के भीतर कोशिकाओं के व्यवहार ।
विकास और एक bioink में एक सेल निलंबन के सम्मिश्रण के लिए एक तकनीक का अनुकूलन इन constructs के निर्माण के लिए सर्वोपरि था । पारंपरिक कम चिपचिपापन hydrogel सामग्री के विपरीत, स्याही के उच्च चिपचिपापन एक bioink के पूर्व cellularization में कठिनाई के परिणामस्वरूप मुद्रण से पहले । एक bioink, एक चिपचिपा bioink में एक सेल निलंबन के मिश्रण कदम के लिए एक प्रोटोकॉल में सेल निगमन के पारंपरिक विधि के लिए एक विकल्प के रूप में विकसित किया गया था और चर्चा की । इसके अतिरिक्त, ऊतक के निर्माण में इस मिश्रण तकनीक के व्यावहारिक अनुप्रयोग का मूल्यांकन किया गया था । यह एक कदम मिश्रण दृष्टिकोण पारंपरिक मिश्रण तकनीक पर कई फायदे हैं, मिश्रण अनुपात नियंत्रित शामिल, उच्च और अनियमित कतरनी तनाव के ंयूनतम, और एक बंद प्रणाली मिश्रण वाहिकाओं में नमूना बंद को खत्म करने के लिए । हालांकि, इस तकनीक में कई महत्वपूर्ण कदम है सेल के लिए पारंपरिक तरीकों पर अपने फायदे सुनिश्चित करने के लिए/bioink सम्मिश्रण । यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि सेल सिरिंज में कोशिकाओं को निलंबित कर दिया और अच्छी तरह से सम्मिश्रण से पहले मिलाया जाता है. उठाने और सिरिंज में कोशिकाओं के हस्तांतरण और मिश्रण की प्रक्रिया शुरू करने के बीच एक समय अंतराल के बहुत बड़े तलछट, जो असमान मिश्रण और वितरण में एक मुद्रित रेशा में परिणाम होगा कोशिकाओं के कारण कर सकते हैं । अवसादन मनाया जाता है, तो तुरंत मिश्रण करने से पहले निष्क्रिय मिश्रण इकाई विधानसभा के सरल उलटा (2-3 बार) कोशिकाओं reसस्पेंड करने के लिए पर्याप्त है और एक समान वितरण सुनिश्चित करने से पहले सम्मिश्रण । यह भी महत्वपूर्ण है कि सिरिंजों में हवा के बुलबुले को खत्म कर दिया जाता है या यह सुनिश्चित करने से पहले कम किया जाता है कि मिश्रण अनुपात निरंतर बना रहे. यदि बड़े हवाई बुलबुले bioink कारतूस में रहने से पहले सम्मिश्रण, यह अनुशंसा की जाती है कि समाधान मिश्रण इकाई के माध्यम से चलाने के लिए एक अतिरिक्त समय पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए । यदि हवा के बुलबुले बने रहते हैं, मुद्रण कारतूस के कोमल दोहन/ इसके अतिरिक्त, यदि एकाधिक सामग्री सम्मिश्रण (कई मिश्रण इकाइयों या सामग्री) अधिक जटिल निर्माण के लिए आवश्यक है, मिश्रित किया जा करने के लिए एक स्याही/सेल सस्पेंशन की सांद्रता के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए कि सम्मिश्रण के माध्यम से कमजोर के बाद, उचित अंतिम एकाग्रता अभी भी हासिल की है ।
अंय सम्मिश्रण तकनीक की तुलना में, निष्क्रिय मिश्रण इकाई cellularize स्याही के लिए एक उपंयास दृष्टिकोण है । दोहरे सिरिंज मिश्रण, या एक रंग या अन्य उपकरण के साथ उभार के रूप में अन्य मिश्रण तकनीक के विपरीत, निष्क्रिय मिश्रण इकाई बैचों और उपयोगकर्ताओं के बीच सम्मिश्रण में अधिक निरंतरता की अनुमति देता है. इस तरह के एक रंग मिश्रण के रूप में मैनुअल मिश्रण तकनीक की प्रकृति, मिश्रण की हद और दर में अधिक से अधिक उपयोगकर्ता के लिए उपयोगकर्ता भिन्नता में परिणाम. इसके अतिरिक्त, इस तरह के निष्क्रिय मिश्रण इकाई और दोहरी सिरिंज मिश्रण के रूप में बंद सिस्टम एक पेट्री डिश या ट्यूब के भीतर मैनुअल मिश्रण की तुलना में कोई नमूना नुकसान के लिए कम है ।
दोनों ऊतक अनुरूप इस पांडुलिपि में गढ़े bioink और या तो एक या दो प्रकार के सेल के एक एकल प्रकार के शामिल थे । हालांकि, ऊतक अनुरूप है कि वास्तुकला है कि विशिष्ट कोशिका प्रकार के साथ विशिष्ट स्याही के क्षेत्रों में शामिल है का मुद्रण अधिक शारीरिक ऊतक के निर्माण के लिए आवश्यक हो सकता है20,21, 22. अद्वितीय रचनाओं या कार्यक्षमताओं के साथ और अधिक विशेष स्याही मौजूदा स्याही के कई प्रकार के सम्मिश्रण के माध्यम से उत्पन्न किया जा सकता है multimaterial स्याही है कि अलग रचनाओं या कार्यक्षमताओं23बनाने के लिए, 24. इस तरह के चमड़े के नीचे परत करने के लिए त्वचा के रूप में ऊतक संक्रमण क्षेत्रों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है या एक ऊतक के अस्थि क्षेत्र को उपास्थि जहां bioink रचना25,26 का एक ढाल के विकास को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हो सकता है इन महत्वपूर्ण क्षेत्रों में पाया मूल निवासी27ऊतकों । इसके अतिरिक्त, एक मिश्रण इकाई का उपयोग किया जा सकता है विकास कारकों में मिश्रण करने के लिए और morphogens से पहले के लिए बंद मिश्रण प्रणाली के साथ नमूना नुकसान के उंमूलन महंगा और कम एकाग्रता के उपयोग के लिए आकर्षक है, जहां नमूना नुकसान के भीतर अपने अंतिम एकाग्रता के लिए एक परिवर्तन में परिणाम कर सकते हैं, विशेष रूप से मुद्रित निर्माण, खासकर जब ग्रैडिएंट शामिल हैं ।
इस अध्ययन में उपयोग किया निष्क्रिय मिश्रण इकाई सहित किसी भी मिश्रण तकनीक, के साथ एक सीमा, यांत्रिक संवेदनशील कोशिका प्रकार के नुकसान का खतरा है. उदाहरण के लिए, अलग स्टेम कोशिकाओं अस्थि मज्जा या भ्रूण, या प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से उन यांत्रिक क्षति के लिए अतिसंवेदनशील होते है28,29। मिश्रण प्रक्रिया में शामिल कतरनी बलों के कारण कोशिकाओं पर असामान्य यांत्रिक तनाव प्रदान करना, और वे व्यवहार्यता की रक्षा करने के लिए संतुलित किया जाना चाहिए30. जबकि इस अध्ययन में प्राथमिक fibroblasts और chondrocytes के उपयोग के परिणामस्वरूप अच्छी व्यवहार्यता (चित्रा 2), अधिक अध्ययन के लिए सुरक्षित मिश्रण दरों और अधिक संवेदनशील सेल प्रकार के लिए अनुपात निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं । तब तक, यह सिफारिश की है कि मिश्रण व्यवहार्यता को अधिकतम करने के लिए एक स्थिर धीमी दर के तहत प्रदर्शन किया जा । इसके अतिरिक्त, इस अध्ययन में चुना गया कोशिका घनत्व पिछले अध्ययनों के आधार पर निर्धारित किया गया था1. इस कोशिका घनत्व सभी प्रकार के सेल के लिए आदर्श नहीं हो सकता है ।विशेष रूप से, एक उच्च एकाग्रता पर कोशिकाओं के मिश्रण कोशिका व्यवहार्यता और ऊतक गठन31,३२में सुधार हो सकता है कि सेल सेल संपर्कों में वृद्धि हो सकती है । इसी तरह की नस में, निष्क्रिय मिश्रण इकाई में सेल spheroids या अंय सेल समुच्चय३३ को एक स्याही में सम्मिश्रण करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
के रूप में प्रस्तावित और इस अध्ययन में प्रदर्शन किया, एक निष्क्रिय मिश्रण इकाई प्रणाली तेजी से एक चिपचिपा bioink में एक सेल निलंबन मिश्रण कर सकते हैं । हालांकि कोशिकाओं को यांत्रिक क्षति के लिए जोखिम अभी भी बनी हुई है, दृष्टिकोण एक अध्ययन के भीतर और उपयोगकर्ताओं में सम्मिश्रण में अधिक निरंतरता की अनुमति देता है । पूर्व सेलुलर इस दृष्टिकोण का उपयोग स्याही के लिए दोनों उपास्थि और त्वचा के अनुरूप है कि अप करने के लिए 4 सप्ताह के लिए किया गया था गढ़े थे, और ऊतक विशिष्ट ECM मार्करों के जमाव का प्रदर्शन । भविष्य के अध्ययन निष्क्रिय मिश्रण इकाई प्रणाली के उपयोग पर ध्यान केंद्रित करने के लिए और अधिक जटिल ऊतक सादृश्य के निर्माण के लिए मानकीकृत स्याही से विशेष स्याही मिश्रण होगा ।
Disclosures
इस पांडुलिपि के लेखक CELLINK LLC के कर्मचारी हैं.
Acknowledgments
लेखकों को कोई पावती नहीं है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| STARTINK Kit | CELLINK | SK0001 | Kit that contained all the elements for the CELLMIXER procedure |
| Live/Dead Kit | Life Technologies | L3224 | Kit for the analysis of cell viability after mixing |
| Masson's Trichrome | Sigma Aldrich | HT15-1KT | Kit for the analysis of collagen I deposition in the skin constructs |
| Alcian Blue | Sigma Aldrich | B8438-250ML | Kit for the analysis of glycosaminoglycan deposition in the skin constructs |
| INKREDIBLE+ bioprinter | CELLINK | Gen1+ | Printer utilized in the study |
| DMEM with Glutamax | Thermofisher | 10566016 | Media for culture of the cells |
| 10% fetal bovine serum | Thermofisher | A3160402 | Media supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | Media supplement |
| live cell imaging solution | thermofisher | A14291DJ | component utilized using live/dead imaging |
| inverted microscope | Olympus | IX73 | microscope utilized |
| a digital color camera | Olympus | XC10 | microscope camera utilized |
| cellSens imaging software | Olympus | n/a | stock software with the microscope |
| ImageJ | NIH | n/a | open source image analysis software |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | n/a | software for statistical analysis |
| Slic3r software (v1.2.9) | Slic3r | n/a | open-source software to convert .stl file to gcode |
| primary adult human dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-012 | cell source for fibroblasts |
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