Summary
Brusk og hud analoger blev bioprinted ved hjælp af en nanocellulose-calciumalginat baseret bioink. Bioinks var cellularized før udskrivning via et enkelt skridt passiv blanding enhed. Konstruktioner påvistes at være ensartet cellularized, har høj rentabilitet og udstille gunstige markører for differentiering.
Abstract
Bioprinting er en kraftfuld teknik for den hurtige og reproducerbare fabrikation af konstruktioner til tissue engineering applikationer. I denne undersøgelse, var både brusk og hud analoger fremstillet efter bioink pre-cellularization udnytte en roman passiv blanding enhed teknik. Denne teknik blev udviklet med formålet at forenkle de forskellige trin i en blanding af en cellesuspension til en meget tyktflydende bioink. Opløsning af filamenter deponeret gennem bioprinting nødvendiggør forsikringen om ensartethed i celle distribution inden udskrivning for at undgå aflejring af regioner uden celler eller fastholdelse af store celle klumper, der kan tilstoppe nålen. Vi demonstrere evnen til hurtigt blend en cellesuspension med en bioink før bioprinting af både brusk og hud analoger. Begge væv analoger kunne være kulturperler i op til 4 uger. Histologiske analyse viste både cellernes levedygtighed og deposition af væv specifikke ekstracellulære matrix (ECM) markører som glycosaminoglycans (GAGs) og kollagen jeg henholdsvis.
Introduction
I de seneste år, er tre-dimensionelle (3D) bioprinting teknologi blevet mere tilgængelige for forskere, så teknik til at blive mere bredt udnyttet til fremstilling af væv analoger. Bioprinting lover at revolutionere biomedicinsk forskning ved at lette den hurtige og repeterbare fabrikation af mangefacetteret væv konstruktioner. Kernen i bioprinting teknologien lægger i evnen til at netop kontrol aflejring af biomaterialer (kendt som bioinks) i tre dimensioner. Dette giver mulighed for generation af komplekse stilladser med forskellige regioner af matrix kompositioner, bioaktive faktorer og celler, der mere præcist kan sammenfatte indfødte væv struktur.
Bioprinting er blevet udnyttet til fabrikation af konstruktioner til mange væv applikationer herunder brusk1, huden2, muskel3og knogle4. Disse væv er attraktive for bioprinting på grund af deres iboende tværstribede mikro-arkitekturer, der er egnet til Rekapitulering via lag på lag deposition. Især besidder hud en veldefineret flerlaget struktur5, som er egnet til fabrikation gennem lag på lag deposition teknikker som bioprinting. Derudover bioprinting kan udnyttes til at generere konstruktioner, der besidder de nødvendige anatomiske dimensioner og figurer til at reparere væv defekt. Evnen til at generere biomaterialer med patienten-specifikke størrelse og figur6 kan begynde at imødegå efterspørgsel efter delvis reparationer af mange væv, herunder men begrænset ikke til knogledefekter, bruskskader og hudlæsioner hvis omfang varierer fra patient til patient.
I denne undersøgelse, var to væv analoger (ledbrusken og hud) fremstillet ved bioprinting af pre-cellularized bioinks. At sikre tilstrækkelig blanding af et bioink med cellesuspension, der kan sikre ensartet celle distribution, mens bevare cellernes levedygtighed kan være en udfordring. Bioinks egnet til bioprinting via ekstrudering ofte er meget tyktflydende og derfor kræver omfattende blanding for at sikre en homogen blanding. Mekaniske skader på celler kan optræde under barske blanding og negativt påvirker levedygtighed. Undersøgelser har vist, at de fleste celledød under inkjet print proces forekommer under forberedelse som blanding7,8. Mens traditionelle blanding med agitation9 kan være tilstrækkeligt til lav viskositet bioinks egnet til inkjet print10, blanding af celler ind i en høj viskositet bioink mere velegnet til ekstrudering bioprinting er vanskeligere. Tackle dette behov, er brugen af blande dyser blevet mere populært for blanding af bioinks under udskrivning proces11. Disse blandere har også udnyttet bredt i mikrofluidik forskning hvor blanding af væsker med lav Reynolds tal er vigtige12. Udnyttelse af en kontinuerlig blanding proces at blande en cellesuspension ind en bioink ville give mulighed for ensartethed under udskrivningsprocessen. Men da celle suspensioner besidde lav viskositet i forhold til en bioink, vanskeligheder vil opstå i forebyggelsen sedimentation af cellerne under udskrivning proces9,13,14. Alternativt, en blanding af celler ind i en bioink før udskrivning kan løse dette problem.
For at minimere celledød under blanding i en bioink, udviklet vi en teknik baseret på en passiv blanding enhed til at blande celler ind i en bioink i den minimalt antal trin. Den kaotiske blanding genereret gennem strømmen af materialer gennem blanding enheden er tilstrækkeligt at reproducerbar blanding to komponenter sammen15,16. Denne metode blev primært udviklet til at forenkle blanding af enhver cellesuspension med nogen bioink der egner sig til ekstrudering bioprinting. Antallet af trin i miksningen blev minimeret for at fjerne bruger til bruger variation i blanding. Overdreven blanding skridt kan være tidskrævende og ikke gælder for alle bioinks, især når cellerne er involveret. Sekundære, vi sigter mod at udvikle en blanding proces, der var selvstændig til både bevare sterilitet og minimere prøve tab.
I dette manuskript vise vi blanding af en cellesuspension med en bioink ved hjælp af en passiv blanding enhed teknik der minimerer håndtering og resultater i høj celle levedygtighed og ensartet distribution. Disse pre-cellularized bioinks der derefter udnyttet til bioprint enten en brusk eller hud konstruere med én eller to celletyper, henholdsvis at er kulturperler i op til 6 uger. Bioink udnyttede er en natriumalginat-nanocellulose blanding, som tidligere har vist egnethed for bioprinting1.
Protocol
Denne protokol følger retningslinjerne fra Chalmers University's human videnskabsetisk Komité.
Bemærk: Alle trin der skal udføres inden for en steril biosikkerhed kabinet.
1. forberedelse af forbrugsvarer, Bioink og celler
- Få to sprøjter, en sprøjte (figur 1en) for cellesuspension, mens andre sprøjten er for bioink (figur 1b).
- Opnå en steril passiv blanding-enhed (figur 1c), der kan kobles med dobbelt sprøjter via en Luer lock forbindelse.
- Opnå en udlevering enhed (fig. 1d), der kan presse en diskenhed fra to sterile sprøjter samtidig på en kontrolleret hastighed.
Bemærk: Blandingsforholdet udnyttet i dette studie er 10:1. Derfor bruge en 12 mL sprøjte og en 1 mL sprøjte som krævet af 10:1 blanding enhed. - Opnå en steril patron (figur 1e) og en steril kvinde-kvinde Luer lock stik til direkte blandet bioink og celle suspension i.
- Opnå eller forberede bioink til at blande med en cellesuspension.
Bemærk: I denne protokol, et nanocellulose/calciumalginat baseret bioink blev udnyttet. Denne bioink er tværbundet gennem tilsætning af en steril 100 mM CaCl2 løsning indlæg udskrivning. - Frigør celler ved hjælp af en 0,5% trypsin/EDTA-oploesning og tælle det samlede antal celler ved hjælp af trypan blå udstødelse metode17.
Bemærk: I denne protokol, humane fibroblaster blev udnyttet. - Bestemme, hvilken celle tæthed er ønskede i den endelige trykte konstruktion. Beregne ved hjælp af følgende ligninger koncentrationen af de høstede celler, der skal fortyndes for at opnå dette mål sidste celle tæthed.
Bemærk: I denne protokol, en afsluttende celle tæthed af 5 x 106 celler/mL blev udnyttet.- Vælg en ønskede celle koncentration for eksperimenter: Ccelle (celler/mL).
- Beregning af bioink nødvendigt, Vbioink, baseret på det samlede antal konstruktioner ønskes:
Vbioink = Vkonstruere × NContructs
Bemærk: For eksempel mængden af bioink pr. konstruktion er 100 µL. Hvis 30 konstruktioner er trykt, er bioink volumen nødvendige 3 mL. - Beregne antallet af celler brug for:
Nceller = Ccelle (1,1 × Vbiolink) - Resuspend celler (Nceller) i 1/10th omfanget af bioink:
Vcellesuspension = 0,1 × Vbiolink
Bemærk: For eksempel, hvis Vbioink = 3 mL, så Vcellesuspension = 0,1 × 3 mL = 0,3 mL
2. blanding af cellesuspension og Bioink
- Overføre cellesuspension ind i cellen suspension sprøjten.
- Overførsel af bioink til en anden sprøjte eller få en sprøjte, der indeholder bioink.
- Trække bioink sprøjte stemplet tilbage og Indsæt sprøjten ind i udlevering enhed. Anbring enheden lodret med Luer lock stik opad (figur 1f1).
- Træk stemplet celle sprøjte tilbage til en lignende længde som bioink sprøjte og indsætte i den udlevering enhed (figur 1f2).
- Knytte begge sprøjter til blanding enheden ved at dreje Luer lock stik (figur 1f3).
- Prime blanding systemet ved at trykke på den udlevering enhed til at presse luft i sprøjten. Stop priming før løsningen at nå Luer lock (figur 1g4).
- Efter grunding, vedhæfte påfyldning patron til slutningen af den blanding enhed via Luer lock stik (figur 1g5). Sikre, at stemplet i fyldet patron i bunden inden vedhæftet fil.
- Langsomt komprimere (figur 1h6) for udlevering enhed til at blande bioink og celle suspensionen sammen i patron (figur 1i7).
- Skubbe stemplet i fyldet patron nedad med en steril pipette tip til at kontakte bioink-celle blandingen efter blanding. Holde udlevering indtil komprimeret for at sikre celle/bioink blanding ikke er ekstruderet tilbage til de blande enhed.
- Cap patronen og forsigtigt trykke på bordpladen til at flytte eventuelle luftbobler til toppen af patronen (stempel ende).
Bemærk: På dette punkt, celle/bioink blanding er klar til udskrivning. De følgende afsnit vil skitsere specifikke programmer og udskrivning procedurer.
3. bestemmelse af cellernes levedygtighed ved hjælp af en blanding enhed i forhold til manuel spatel blanding
- Frigøre humane fibroblaster (passage 7) med en 0,5% trypsin/EDTA-opløsning på 80% confluence, tælle antallet og resuspend dyrkningsmedium med tilstrækkelig celle tæthed til at opnå en endelig koncentration efter blanding med bioink (1:10 celle: bioink ratio) 5 x 10 6 celler/mL.
- Blend celler i bioink ved hjælp af enten den passive blanding enhed teknik (trin 2) eller via spatel til at evaluere virkningen af begge teknikker på cellernes levedygtighed.
- Blend cellerne i bioink ved hjælp af den passive blanding enhed teknik 1, 2 eller 3 gange før udlevering i en støbeform for danne tvaerbindinger ved hjælp af 100 mM CaCl2.
Bemærk: For at udføre yderligere blandinger, bland celle/bioink direkte i en sprøjte i stedet for en patron. Derefter remix blandingen gennem blanding enheden efter den foregående protokol, men uden celle sprøjte komponent. - Blend cellerne i et separat bioink ved hjælp af manuel mekaniske blanding via en spatel for varigheder af 30, 60 eller 90 s. overførsel blandinger (for hver blanding tid) i en støbeform for danne tvaerbindinger ved hjælp af 100 mM CaCl2.
- Overføre prøverne til en godt plade efter afslutningen af cross-linking og kultur under standardbetingelser.
- Efter 1 dag af kultur, vaske konstruktioner (n = 3-4 pr. gruppe) i serumfrit cellekulturmedium i 30 min. pletten celler i konstruktioner med en Farvningsopløsningen (4 µM Calcein AM, 1 µM Ethidium homodimer-1) i 30 min.
- Vask to flere gange, og Inkuber prøver i serumfrit cellekulturmedium for et samlet beløb på 1 h ved 37 ° C.
4. Bioprinting af brusk analoger med en enkelt celletype
- Tegne en 3D model af det ønskede væv analog. Konvertere til en Gcode fil til bioprinting og indlæse filen Gcode på bioprinter1.
Bemærk: I denne protokol, et firkantet struktur med dimensioner 4,8 x 4.8 x 0,9 mm3 blev eksporteret som en STL fil. En Gcode filen blev genereret af gitterstruktur ved hjælp af følgende indstillinger: lagtykkelse, 0.3 mm; infill mønster, retlinede; infill tæthed, 25%; hastighed, 10 mm/s. - Isolere og cryopreserve primære menneskers nasal chondrocytter (hNC) fra patienterne efter den refererede protokol1.
- Tø og udvide befrugtede hNCs og udvide en gang i éncellelag kultur ved hjælp af standard dyrkningsmediet ved 37 ° C. Frigør celler på 80-90% sammenløbet med en 0,5% trypsin/EDTA-oploesning og tælle ved hjælp af en protokol til blå udelukkelse af trypan. Alle eksperimenter blev udført ved hjælp af hNCs på passage 2.
- Resuspend hNCs på 100 x 106 celler/mL inden for 300 µL af næringssubstratet suppleret med 10% føtal bovint serum, 1% penicillin-streptomycin og 50 µg/mL ascorbinsyre, som forberedelse til blanding med bioink.
- Blend hNC cellesuspension til en nanocellulose/calciumalginat baseret bioink følgende passive blanding enhed protokol i forholdet 10:1 bioink:cell suspension til en afsluttende celle koncentration af 9 x 106 celler/mL.
- Sikre, at bioprinter er steriliseret via UV-eksponering og tørre ned med 70% ethanol. Vedligeholde sterilitet ved at placere i en laminar flow kabinet.
- Tillægger de patroner, der indeholder bioink/celle suspension blandinger sterile udskrivning dyser og indsætte i bioprinter.
- Kalibrere bioprinter, enten manuelt eller af de protokoller, der er specifikke for printeren.
- Bioprint gitter-strukturerede, celle-belæsset konstruktioner ved hjælp af de følgende udskriftsparametre: 25G konisk dyse ved et tryk på 25 kPa. Bioprint celle-gratis konstruktioner (blandet med celle medium indeholder ingen celler) som en kontrol.
- Krydse-link på konstruktioner ved at tilføje en ionisk opløsning af 100 mM CaCl2 i 5 min. Skyl konstruktioner og Inkuber i dyrkningsmediet under standard kultur (37 ° C, 5% CO2og 95% relativ fugtighed). Ændre medierne hver anden eller tredje dag.
- Indsamle prøver til histologisk undersøgelse på uge 2 og 4. Pletten prøver til GAG produktion ved hjælp af en Alcian blå plet18.
5. Bioprinting af huden analoger med to celletyper
- Tegne en 3D model af det ønskede væv analoge og konvertere til en Gcode fil til bioprinting. Indlæse filen Gcode på bioprinter.
Bemærk: I denne protokol, et firkantet struktur med dimensioner 4,8 x 4.8 x 0,9 mm3 blev eksporteret som en STL fil. Så en Gcode filen blev genereret af gitterstruktur ved hjælp af følgende indstillinger: lagtykkelse, 0.3 mm; infill mønster, retlinede; infill tæthed, 25%; hastighed, 10 mm/s. - Forberede cellerne til at blende ind i bioink for bioprinting. Til fabrikation af huden analoger, blev to celletyper udnyttet. To celletyper blev blandet ind i bioink og bioprinting.
- Få primære HDF. Opretholde disse celler i DMEM vækst medier suppleret med 10% føtal bovint serum, 1% penicillin-streptomycin og 50 µg/mL ascorbinsyre. Frigør celler på 80-90% sammenløbet med 0,5% trypsin/EDTA-oploesning og tælle.
- Isolere og cryopreserve primære hNC fra patienterne efter den refererede protokol1. Tø og udvide befrugtede hNCs i éncellelag kultur. Frigør celler på 80-90% sammenløbet med 0,5% trypsin/EDTA-oploesning og tælle.
- Resuspend begge celletyper på 100 x 106 celler/mL i vækst medier. Bland celle suspensioner sammen i forholdet 1:1 til at opnå en endelig total koncentration af 100 x 106 celler/mL i 300 µL af medier.
- Blend 50/50 cellesuspension af HDF og hNC i en nanocellulose/calciumalginat baseret bioink følgende passive blanding enhed protokol i forholdet 10:1 bioink:cell suspension til en afsluttende celle koncentration af 9 x 106 celler/mL.
- Sikre, at bioprinter er steriliseret eller placeres i en laminar flow kabinet at opretholde sterilitet.
- Tillægger de patroner, der indeholder bioink/celle suspension blandinger sterile udskrivning dyser og indsætte i bioprinter.
- Kalibrere bioprinter enten manuelt eller de protokoller, der er specifikke for printeren.
- Bioprint gitter-strukturerede, celle-belæsset konstruktioner ved hjælp af de følgende udskriftsparametre: 25G konisk dyse ved et tryk på 25 kPa. Bioprint celle-gratis konstruktioner (blandet med celle medium indeholder ingen celler) som en kontrol.
- Krydse-link på konstruktioner ved at tilføje en ionisk opløsning af 100 mM CaCl2 i 5 min. Skyl konstruktioner og Inkuber i dyrkningsmediet under standard kultur (37 ° C, 5% CO2og 95% relativ fugtighed). Ændre medierne hver anden eller tredje dag.
- Indsamle prøver til histologisk undersøgelse på uge 2 og 4. Pletten prøver for kollagen jeg produktion ved hjælp af en Masson trichrome pletten19.
Representative Results
Resultaterne i dette håndskrift er opdelt i to sektioner. Første blev celle levedygtighed analyseret efter blanding med enten den mekaniske metode eller den passive blanding enhed. Næste, brusk og hud-konstruktioner var kulturperler og analyseres for relevante histologiske markører.
Celle distribution syntes homogen i begge tilfælde. Handlingen af blanding af hånden ved hjælp af en spatel (figur 2b) har dog mere varians end at blande med en passiv blanding enhed (figur 2en). Omfang, hastighed og blande teknik med en spatel er stærkt afhængige af brugeren. Dog blanding celler ind i en bioink med en passiv blanding enhed standardiserer blanding og minimerer variation på tværs af partier. Desuden 30, 60 og 90 s blanding tid maj ikke være tilstrækkeligt for en blanding af en stor mængde af celler ind i en stor mængde af bioink. Strengere blanding gennem blanding med en spatel kan være nødvendigt. Til sammenligning udnytter en passiv blanding enhed bedre fastholder blandingsforholdet af celler til bioink under blanding og sikrer, at en homogen blanding er udført. Derudover er prøve tab et problem med traditionelle blanding teknikker hvor bioink kan være efterladt i petriskåle, rør og blande værktøjer på grund af deres høje viskositet. Cellernes levedygtighed var høje for blanding med en blanding enhed (> 90%) 1, 2 eller 3 gange. Når den passive blanding enhed blev udnyttet, tog blending ca 1 min på en langsom stabil blanding sats. Mens blanding med en spatel udstillet høj rentabilitet efter blanding til 30 og 60 s, større end 90 s blanding resulterede i et betydeligt fald i rentabilitet i forhold til de andre grupper (77,9 ± 14%, p < 0,05) (figur 2c). Dette kan skyldes overdreven blande, der forårsager skader på cellerne. Langsigtet live/døde pletter efter 14 dage og 28 dage af kultur er vist i tillægs figur 1. Celler begynde spredning af dag 14, og er meget spredt af dag 28, og viser god levedygtighed.
Efter kultur, blev brusk og huden væv analoger analyseret gennem histologi. Analyse af brusk konstruktioner på dag 0, 14 og 28 viser en stigning i antal og dækning af GAGs som påvist gennem en Alcian blå plet (figur 3a-3_c). Fravær af pletten er bemærket på dag 0, mens på dag 14 farvning er begrænset til lokaliteter proksimalt for cellerne. Dog af dag 28 af kultur, er Alcian blå fundet i hele konstruktionen, påviser dannelsen af en chondrocytic ECM. Bioprinted hud konstruktioner blev analyseret gennem histologiske farvning af kollagen jeg udnytter en Masson Trichrome plet (figur 3d-3f). Svarende til brusk-konstruktioner, dag 0 prøver udstillet ingen aflejring af kollagen. Dag 14 af kultur, var betydelige aflejringer af kollagen bemærkede omkring cellerne og langs overfladen af konstruktionen. Dette blev yderligere styrket af dag 28, som tætte kollagen lag blev fundet på den konstruktion og inden for hovedparten.
Figur 1 : Passiv blanding enhed System. (en) 1 mL sprøjte for cellesuspension, (b) 12 mL sprøjte med bioink, (c) udlevering enhed, (d) passiv blanding enhed, (e) fylde patron, (f) forsamling af bioink sprøjte (1) og celle suspension sprøjte (2) i den udlevering enhed, fastgørelse af den passive blanding enhed til slutningen af både sprøjter (3), (g) udlæg i kvinde-kvinde Luer lock stik (4) og udlæg i fyldet patron (5) fuldender forsamling, (h ) komprimere den udlevering enhed til at prime den blanding enhed (6), (jeg) fortsætte med at skubbe på den udlevering enhed til at blande cellesuspension med bioink og dispensere til påfyldning patron (7). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Celle levedygtighed billeder og analyse. Repræsentative billeder viser live (grøn) og døde (rød) human fibroblaster efter blanding med den passive blanding enhed 1, 2 eller 3 gange (en) eller spatel til 30, 60 eller 90 sekunder (b) og 3D kultur i 1 dag. Billeder på 4 X forstørrelse er vist. Skalaen angiver 200 µm. (c) procent gennemsnitlige rentabilitet af humane fibroblaster efter blanding med den passive blanding enhed eller spatel og 3D kultur for 1 dag. Fejllinjer Vis standardafvigelsen for middelværdien, * 0,005. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: væv specifikke ekstracellulære Matrix Deposition. Bioprinted brusk konstruktioner farves for glycosaminoglycans udnytter Alcian blå på (en) dag 0, (b) 14, og (c) 28. Billeder taget på 5 X forstørrelse. Bioprinted hud konstruktioner farvet for kollagen jeg bruger Masson's Trichrome (d) dag 0, (e) 14, og (f) 28. Billeder taget på 5 X forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: cellernes levedygtighed på dag 14 (en), og 28 (b). Skalalinjen er 200 µm, grøn henviser til levende celler, rød refererer til døde celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Som påvist i dette manuskript, var pre-cellularized bioinks bioprinted til at fabrikere enten brusk eller hud analoger, der var kulturperler i op til 4 uger. Cellernes levedygtighed efter blanding ved hjælp af den passive blanding enhed teknik var højere end de traditionelle blanding metoder. Derudover forenkling af blending processen ved hjælp af enhedens blanding minimerer antallet af håndtering af trin og giver mulighed for bedre sammenhæng i omfanget af blanding. I sidste ende, dette resulterer i bedre reproducerbarhed i begge celle fordeling inden for bioink, og på tværs af konstruktioner og eksperimentelle grupper. Deposition af væv specifikke ECM komponenter såsom GAGs og kollagen jeg blev observeret for både brusk og hud analoger, henholdsvis efter 4 uger af kultur. Dette angiver fleksibiliteten i både den blanding teknik og den valgte konstruktion geometri til at fremstille forskellige væv mål. Fabrikation af brusk og hud analoger udstillet fleksibilitet både anvendelsen af en nanocellulose-calciumalginat bioink og bioprinting teknik til særskilte manipuleret væv mål. Vi vil diskutere to komponenter i undersøgelsen nedenfor: (1) den passive blande enhed teknik, og (2) opførslen af celler i brusk og hud analoger.
Udvikling og optimering af en teknik for blanding af en cellesuspension i en bioink var altafgørende for fabrikation af disse konstruktioner. I modsætning til traditionelle lav viskositet hydrogel materialer resulterede høj viskositet af bioinks i vanskeligheder i pre-cellularization af en bioink før udskrivning. Som et alternativ til den traditionelle metode til celle indarbejdes i en bioink, blev en protokol for et-trins blanding af en cellesuspension til en tyktflydende bioink udviklet og drøftet. Derudover blev den praktiske anvendelse af denne blanding teknik i fabrikation af væv konstruktioner evalueret. Denne et-trins blanding tilgang har flere fordele frem for traditionelle teknikker indgår kontrolleret blanding blandingsforholdet, minimering af høj og uregelmæssige selvdestruerende understreges, og et lukket system til at fjerne prøve lukke i blande fartøjer. Men der er flere vigtige skridt i denne teknik til at sikre dens fordele i forhold til traditionelle metoder for celle/bioink blanding. Det er afgørende at sikre, at cellerne i celle sprøjten er suspenderet og godt blandet inden blanding. For store af tidsforskydninger mellem løfter og overførsel af cellerne i sprøjten og start miksningen kan bevirke, at cellerne til sediment, som vil resultere i ujævn blanding og distribution i en trykt glødetråd. Hvis sedimentation er observeret, enkle inversion (2 - 3 gange) af er den passive blanding enhed forsamling umiddelbart inden blanding tilstrækkeligt at resuspend cellerne og sikre en ensartet fordeling inden blanding. Det er også afgørende at luftbobler i sprøjter er elimineret eller minimeret forudgående for at sikre, at den blandingsforholdet forbliver konstant. Hvis store luftbobler forbliver i bioink patron inden blanding, anbefales det, at løsningen kan køres gennem blanding enheden en ekstra tid for at sikre grundig blanding. Hvis luftbobler forblive, kan blid tappe af print cartridge/sprøjten fortrænge resterende luftbobler. Desuden, hvis flere materiale blanding (flere blande enheder eller materialer) er nødvendige for mere komplicerede konstruktioner, bør koncentrationer af bioinks/celle suspensioner bliver blandet tilpasses for at sikre, at efter fortynding gennem blanding, rette endelig koncentration opnås stadig.
I forhold til andre blanding teknikker er passiv blanding enheden en ny tilgang til cellularize bioinks. I modsætning til andre blande teknikker som dobbelt sprøjte blanding eller omrøring med en spatel eller andet værktøj, tillader den passive blanding enhed mere konsekvens i blanding på tværs af partier og brugere. Arten af manuel blanding teknikker, som en spatel blanding, resulterer i større bruger-til-bruger variation i omfanget af og sats af blanding. Derudover har lukkede systemer som passiv blande enhed og dobbelt sprøjte blanding lidt at ingen prøve tab i forhold til manuel blanding i en petriskål eller tube.
Begge væv analoger fabrikeret i dette manuskript bestod af en enkelt type af bioink og enten én eller to celletyper. Bioprinting af væv-analoger, der består af arkitekturer, der indeholder regioner i forskellige bioinks med forskellige celletyper kan dog være nødvendigt for fabrikation af flere fysiologisk væv konstruktioner20,21, 22. Mere specialiserede bioinks med unikke kompositioner eller funktionaliteter kan genereres gennem blanding af flere typer af eksisterende bioinks sammen for at skabe multimaterial bioinks, der har forskellige kompositioner eller funktionaliteter23, 24. Dette kan være særlig vigtigt på væv overgangsregioner såsom hud til subkutane lag eller brusk til knogle region af en væv hvor et forløb af bioink sammensætning25,26 kan være nødvendigt at sikre udviklingen af disse kritiske regioner findes i native væv27. Derudover kunne en blanding enhed udnyttes til at blande i vækstfaktorer og morphogens ind i bioinks før bioprinting. Fjernelse af prøven tab med det lukkede blanding system er attraktivt for brug af dyrt og lav koncentration bioaktive faktorer, hvor prøven tab kan resultere i en ændring til deres endelige koncentration i bioprinted konstruktion, især når gradienter er involveret.
En begrænsning med enhver blanding teknik, herunder passiv blanding enhed udnyttes i denne undersøgelse, er risikoen for beskadigelse af mekanisk følsomme celletyper. For eksempel, isolerede stamceller sådan dem fra knoglemarv eller embryo eller induceret pluripotente stamceller er mere modtagelige for mekaniske skader28,29. Handlingen at blande formidler unormale mekaniske belastninger på celler på grund af shear kræfter involveret i miksningen, og de skal være afbalanceret for at bevare levedygtigheden30. Mens brugen af primære fibroblaster og chondrocytter i denne undersøgelse resulterede i god levedygtighed (figur 2), er yderligere undersøgelser nødvendige for at bestemme sikkert blande priser og nøgletal for mere følsomme celletyper. Indtil da anbefales det, at blandingen udføres under en jævn langsom hastighed til at maksimere levedygtighed. Derudover blev celle tæthed valgt i denne undersøgelse fastsat baseret på tidligere undersøgelser1. Denne celle tæthed kan ikke være ideel til alle celletyper.Især kan blanding celler på en højere koncentration resultere i øget celle-celle kontakter, der kan forbedre cellernes levedygtighed og væv dannelse31,32. I samme retning, kunne den passive blanding enhed anvendes blanding celle spheroids eller andre celle aggregater33 i bioinks.
Som foreslået og påvist i denne undersøgelse, en passiv blanding enhed system kan hurtigt blend en cellesuspension til en tyktflydende bioink. Mens risikoen for mekaniske skader på cellerne er stadig, tilgangen giver mulighed for mere sammenhæng i blending inden for en enkelt undersøgelse og på tværs af brugere. Pre-cellularized bioinks udnytte denne tilgang blev brugt til at fremstille begge brusk og hud analoger, der blev dyrket til op til 4 uger, og demonstreret aflejring af væv specifikke ECM markører. Fremtidige undersøgelser vil fokusere på udnyttelse af den passive blanding enhed system for at blande specialiserede bioinks fra standardiserede bioinks for fabrikation af mere komplekse væv analoger.
Disclosures
Forfatterne til dette manuskript er medarbejdere i CELLINK LLC.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen anerkendelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| STARTINK Kit | CELLINK | SK0001 | Kit that contained all the elements for the CELLMIXER procedure |
| Live/Dead Kit | Life Technologies | L3224 | Kit for the analysis of cell viability after mixing |
| Masson's Trichrome | Sigma Aldrich | HT15-1KT | Kit for the analysis of collagen I deposition in the skin constructs |
| Alcian Blue | Sigma Aldrich | B8438-250ML | Kit for the analysis of glycosaminoglycan deposition in the skin constructs |
| INKREDIBLE+ bioprinter | CELLINK | Gen1+ | Printer utilized in the study |
| DMEM with Glutamax | Thermofisher | 10566016 | Media for culture of the cells |
| 10% fetal bovine serum | Thermofisher | A3160402 | Media supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | Media supplement |
| live cell imaging solution | thermofisher | A14291DJ | component utilized using live/dead imaging |
| inverted microscope | Olympus | IX73 | microscope utilized |
| a digital color camera | Olympus | XC10 | microscope camera utilized |
| cellSens imaging software | Olympus | n/a | stock software with the microscope |
| ImageJ | NIH | n/a | open source image analysis software |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | n/a | software for statistical analysis |
| Slic3r software (v1.2.9) | Slic3r | n/a | open-source software to convert .stl file to gcode |
| primary adult human dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-012 | cell source for fibroblasts |
References
- Avila, H. M., Schwarz, S., Rotter, N., Gatenholm, P. 3D bioprinting of human chondrocyte-laden nanocellulose hydrogels for patient-specific auricular cartilage regeneration. Bioprinting. 1, 22-35 (2016).
- Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue Eng Part C Methods. 20 (6), 473-484 (2013).
- Costantini, M., et al. Microfluidic-enhanced 3D bioprinting of aligned myoblast-laden hydrogels leads to functionally organized myofibers in vitro and in vivo. Biomaterials. 131, 98-110 (2017).
- Fedorovich, N. E., et al. Biofabrication of Osteochondral Tissue Equivalents by Printing Topologically Defined, Cell-Laden Hydrogel Scaffolds. Tissue Eng Part C Methods. 18 (1), 33-44 (2011).
- Vijayavenkataraman, S., Lu, W. F., Fuh, J. Y. H. 3D bioprinting of skin: a state-of-the-art review on modelling, materials, and processes. Biofabrication. 8 (3), 032001 (2016).
- Peltola, S. M., Melchels, F. P. W., Grijpma, D. W., Kellomäki, M. A review of rapid prototyping techniques for tissue engineering purposes. Ann Med. 40 (4), 268-280 (2008).
- Xu, T., Jin, J., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. Inkjet printing of viable mammalian cells. Biomaterials. 26 (1), 93-99 (2005).
- Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells. Biotechnol Bioeng. 106 (6), 963-969 (2010).
- Parsa, S., Gupta, M., Loizeau, F., Cheung, K. C. Effects of surfactant and gentle agitation on inkjet dispensing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 025003 (2010).
- Derby, B. Inkjet printing of functional and structural materials: fluid property requirements, feature stability, and resolution. Annu Rev Mater Res. 40, 395-414 (2010).
- Colosi, C., et al. Microfluidic Bioprinting of Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low-Viscosity Bioink. Adv Mater. 28 (4), 677-684 (2016).
- Ober, T. J., Foresti, D., Lewis, J. A. Active mixing of complex fluids at the microscale. Proc Natl Acad Sci. 112 (40), 12293-12298 (2015).
- Shabnam, P., Madhuja, G., Frédéric, L., Karen, C. C. Effects of surfactant and gentle agitation on inkjet dispensing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 025003 (2010).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnol Bioeng. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Niu, X., Lee, Y. -K. Efficient spatial-temporal chaotic mixing in microchannels. J Micromech Microeng. 13 (3), 454 (2003).
- Liu, R. H., et al. Passive mixing in a three-dimensional serpentine microchannel. J Microelectromech Syst. 9 (2), 190-197 (2000).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr protoc immunol. , A3. B. 1-A3. B (2001).
- Scott, J., Dorling, J. Differential staining of acid glycosaminoglycans (mucopolysaccharides) by alcian blue in salt solutions. Histochem Cell Biol. 5 (3), 221-233 (1965).
- Garvey, W. Modified elastic tissue-Masson trichrome stain. Stain technol. 59 (4), 213-216 (1984).
- Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. -M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. Complex heterogeneous tissue constructs containing multiple cell types prepared by inkjet printing technology. Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).
- Kolesky, D. B., et al. 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
- Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proc Natl Acad Sci. 113 (12), 3179-3184 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Adv Mater. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- KÖpf, M., Campos, D. F. D., Blaeser, A., Sen, K. S., Fischer, H. A tailored three-dimensionally printable agarose-collagen blend allows encapsulation, spreading, and attachment of human umbilical artery smooth muscle cells. Biofabrication. 8 (2), 025011 (2016).
- Gurkan, U. A., et al. Engineering anisotropic biomimetic fibrocartilage microenvironment by bioprinting mesenchymal stem cells in nanoliter gel droplets. Mol Pharm. 11 (7), 2151-2159 (2014).
- Ma, Y., Ji, Y., Huang, G., Ling, K., Zhang, X., Xu, F. Bioprinting 3D cell-laden hydrogel microarray for screening human periodontal ligament stem cell response to extracellular matrix. Biofabrication. 7 (4), 044105 (2015).
- Lu, H. H., Thomopoulos, S. Functional attachment of soft tissues to bone: development, healing, and tissue engineering. Annu Rev Biomed Eng. 15, 201-226 (2013).
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2011).
- Parisi-Amon, A., Mulyasasmita, W., Chung, C., Heilshorn, S. C. Protein-Engineered Injectable Hydrogel to Improve Retention of Transplanted Adipose-Derived Stem Cells. Adv Healthc Mater. 2 (3), 428-432 (2013).
- Qiu, X., De Jesus, J., Pennell, M., Troiani, M., Haun, J. B. Microfluidic device for mechanical dissociation of cancer cell aggregates into single cells. Lab Chip. 15 (1), 339-350 (2015).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14 (5), 633-640 (2002).
- Loessner, D., et al. Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells. Biomaterials. 31 (32), 8494-8506 (2010).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
