Summary
Dit protocol beschrijft de kwantificering van meerdere cytokine doelen tegelijkertijd in weefselkweek supernatant gestimuleerd muis splenocytes met behulp van multiplex kraal gebaseerde immunoassay platform en een stroom cytometer verkregen.
Abstract
Immunoassay kraal gebaseerde dienst hetzelfde fundamentele principe als sandwich-immunoassay. Kralen, die kan worden gedifferentieerd door grootte en interne allophycocyanin (APC) fluorescentie intensiteit, zijn geconjugeerd aan antilichamen specifiek voor een bepaalde stof te vangen. Een geselecteerde panel van gedefinieerde opnamesets kraal is vervolgens geïncubeerd met een biologische steekproef met doel analyten specifiek voor de opname-antilichamen. Een biotinyleerd detectieantilichaam cocktail wordt toegevoegd, die leidt tot de vorming van capture kraal-analyt-detectieantilichaam broodjes.
Tot slot, streptavidine-phycoerythrin (SA-PE) wordt toegevoegd, die bindt aan biotinyleerd detectie antilichamen, verstrekken van fluorescent signaal intensiteit in verhouding tot de hoeveelheid afhankelijke analyt. De PE fluorescent signaal van kralen van de analyt-specifieke regio's is gekwantificeerd aan de hand van cytometry van de stroom en de concentraties van bepaalde analyten worden bepaald met behulp van de software van de analyse van de gegevens en de standaard curve gegenereerd in de test.
In dit experiment gebruiken we een muis T helper cytokine panel te kwantificeren gelijktijdig de concentratie van 13 aparte cytokine doelen in weefselkweek supernatant verzameld van muis splenocytes gekweekte onder verschillende stimulerend condities.
Introduction
Cytokines bemiddelen in hun rol als oplosbare signalering moleculen, de sterk gecoördineerde en multifactoriële processen die host immunologische reacties regeren. Ze worden uitgedrukt in alle stadia van het inflammatoire proces, vanaf de initiatie in de resolutie, en regelen van een complexe interactie-netwerk waarin hun eigen synthese en die van hun cellulaire receptoren1. Deze communicatienetwerk is gelaagd met een complexiteit die verder gaat dan de synergistische of antagonistische relatie die zich kunnen voordoen tussen de afzonderlijke onderdelen. Inderdaad, zijn vele cytokines bekend redundante of op zijn minst gedeeltelijk overlappende functies2,3te delen.
Geïntegreerde systemen biologie benaderingen die meerdere cytokine analyten tegelijkertijd te kwantificeren bieden momenteel een steeds grondig inzicht in de unieke cytokinomes die orkestreren van de immuunrespons die ten grondslag liggen aan meerdere ziekte staat4,5. Deze ziekte staten variëren van veralgemeende ontsteking tot kanker, neurodegeneratieve omstandigheden, en hart-en vaatziekten6,,7,,8,9.
Dergelijke cytokine-netwerken kunnen worden ondervraagd effectief gebruik maken van LEGENDplex kraal gebaseerde immunoassay. Deze tests zijn gebaseerd op hetzelfde principe als de sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), en gebruik van fluorescentie gecodeerd microbolletjes met capture antilichamen covalent gekoppeld aan hun oppervlak. Deze antilichamen zijn geïmmobiliseerd op oppervlakten veel kleiner dan die van traditionele ELISA formaten. Hierdoor kunnen deze gehaltebepalingen moet worden uitgevoerd met veel minder monstervolume, terwijl op hetzelfde moment vermindering van aspecifieke bindend en verstrekken multiplexed analyse van verschillende analyten.
De bepaling die is beschreven in dit protocol maakt gebruik van deze technologie te kwantificeren tot 13 doelstellingen tegelijkertijd. Gegevens uit deze test kunnen worden verkregen met behulp van een grote verscheidenheid van algemeen beschikbare flow cytometers en in tegenstelling tot andere beschikbare tests vereist niet het gebruik van speciale assay-specifieke instrumentatie. Met een groeiende catalogus van gevalideerde analyt panelen, zijn deze tests gebruikt in verschillende lopende biomedisch onderzoek projecten10,11,12,,13.
Om aan te tonen van het gemak en de nut van de bepaling-indeling, in dit experiment we een muis T-helper cytokine-panel gebruiken om te kwantificeren scheiden 13 cytokine concentraties van weefselkweek supernatant muis splenocytes gekweekt onder meerdere verkregen stimulerend voorwaarden. Naast weefselkweek supernatant, kan deze test ook worden uitgevoerd met behulp van serum of plasma monsters.
Protocol
alle dierproeven zijn uitgevoerd volgens de NIH aanbevelingen in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren en goedgekeurd door de IACUC op BioLegend.
Figuur 1: filteren plaat Assay Procedure samenvatting. Het protocol voor het uitvoeren van de bepaling met behulp van de filter platen wordt voorgesteld als een diagram waarin u ziet belangrijke assay onderdelen en incubatie stappen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
1. biologische bereiding van de monsters
Opmerking: het gekozen anatomische locatie en hoeveelheid bloed collectie wordt overgelaten aan het goeddunken van elke individuele onderzoeker en heeft geen invloed op de uitkomst van de test. Echter, zodra zij zijn verkregen, monsters moeten worden behandeld volgens de onderstaande stappen uit.
- Voorbereiding van serummonsters
- verzamelen van de gewenste hoeveelheid bloed in voorkeur collectie buis en laat het stollen voor ten minste 30 min.
- Het monster gedurende 10 minuten bij 1.000 x g bij kamertemperatuur Centrifugeer.
- Verwijderen van serum en assay onmiddellijk of aliquot in polypropyleen microcentrifuge buizen en opslaan van monsters op ≤ -20 ° C.
- Voorbereiding van de monsters van de Plasma
- Collect de gewenste hoeveelheid bloed met behulp van ethyleendiamminetetra-azijnzuuroplossing (NA2EDTA) bloed collectie buizen bekleed.
- Centrifuge voor 10 min bij 1.000 x g bij kamertemperatuur binnen 30 min van collectie.
- Verwijderen van plasma en assay onmiddellijk of aliquot in polypropyleen microcentrifuge buizen en opslaan van monsters op ≤ -20 ° C.
- Voorbereiding van weefselkweek Supernatant monsters
- het monster gedurende 10 minuten bij 1.500 x g bij 4 ° C tot het verwijderen van cellen en puin Centrifugeer.
- Verzamelen supernatant en assay onmiddellijk of aliquot in polypropyleen microcentrifuge buizen en bewaren bij ≤ -20 ° C.
- Ontdooien van bevroren biologische monsters
- volledig ontdooien eerder bevroren biologische monsters op ijs en vortex kort vóór gebruik. Voorkomen van meer dan 2 vorst/dooi cycli.
Opmerking: De in dit protocol gebruikte monsters werden verkregen door het kweken van de BALB/c muis splenocytes (1 x 10 6 cellen bij 37 ° C + 5% CO 2 onder verschillende omstandigheden: ongestimuleerde, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µg/mL plaat beklede) + αCD28 (1 µg/mL oplosbaar), PMA (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). Cultuur supernatant werden verzameld na 48u en verwerkt zoals beschreven in punt 1.3.
- volledig ontdooien eerder bevroren biologische monsters op ijs en vortex kort vóór gebruik. Voorkomen van meer dan 2 vorst/dooi cycli.
2. Bereiding van het reagens
- Preparation of Pre-mixed Antibody-Immobilized kralen
- Sonicate vooraf gemengde kralen fles voor 1 min in een ultrasoonapparaat bad bij kamertemperatuur, en vervolgens vortex voor 30 s vóór gebruik. Als geen bad ultrasoonapparaat beschikbaar is, verhoogt u de vortex tijd om 1 min.
- Voorbereiding van Wash Buffer
- brengen de 20 x was Buffer (20 x PBS met 1% Tween-20) geleverd met de kit aan kamertemperatuur en vortex om alle zouten in oplossing.
- Verdun 25 mL van 20 x was Buffer met 475 mL gedeïoniseerd water. Ongebruikte deel van de winkel tussen 2 ° C en 8 ° C voor maximaal een maand.
- Voorbereiding van Matrix B (voor gebruik met Serum en Plasma monsters alleen)
- 5,0 mL van de Buffer Assay (PBS met 1% BSA) inbegrepen in de kit aan de fles met gelyofiliseerd Matrix B. toestaan ten minste 15 min. voor volledige reconst toevoegen itution, vervolgens vortex te goed mengen. Overgebleven gereconstitueerde Matrix B kan worden achtergelaten bij ≤-70 ° C gedurende maximaal één maand.
3. Standaard voorbereiding
Opmerking: elke analyt in dit paneel heeft een top standaard concentratie van 10.000 pg/mL.
- Toevoegen 250 µL van Assay Buffer te reconstrueren de gelyofiliseerd muis Th Cytokine standaard Cocktail. Meng door kort vortexing en laat de flacon te zitten bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten
- De standaard cocktail overbrengen in een polypropyleen microcentrifuge buis met het label " C7 ". Dit zal worden gebruikt als de standaard top.
- Label 6 polypropyleen microcentrifuge buizen als C6, C5, C4, C3, C2 en C1.
- Toevoegen 75 µL van Assay Buffer aan elk van deze buizen.
- Transfer 25 µL van de hoogste standaard C7 C6 buis en meng goed door vortexing. Dit is de standaard C6.
- Doorgaan uitvoeren van seriële 1:4 verdunningen met behulp van een nieuwe Pipetteer tip voor elke buis 25 µL van de vorige standaard toevoegen aan de 75 µL van Assay Buffer in de volgende laagste standaard buis gevolgd door vortexing te verkrijgen normen C5, C4, C3 , C2 en C1. Assay Buffer gebruiken als de standaard 0 pg/mL (C0).
4. Proef de verdunning
Opmerking: voorontwerp proefprojecten met behulp van deze test met meerdere verdunningen mogelijk vereist om te bepalen van de meest geschikte verdunningsfactor voor een bepaalde set van biologische monsters. Een goede verdunningsfactor zal produceren berekeningen van de concentratie voor de steekproef die binnen de grenzen van de standaard curve liggen. De volgende stappen zijn bedoeld als leidraad en wellicht empirisch worden vastgesteld afhankelijk van type monster.
- Dilute serum of plasma stalen 2-fold met Assay Buffer (bijv. 50 µL van monster met 50 µL van Assay Buffer verdunnen) in polypropyleen microcentrifuge buizen.
Opmerking: Indien verdere monsterverdunning vereist is, verdunningen moeten gebeuren met Matrix B in plaats van assay buffer om ervoor te zorgen nauwkeurige meting. Toevoegen serum of plasma monsters zonder verdunning zal resulteren in lage assay nauwkeurigheid en de plaat van de filter kunnen verstoppen. Matrix B bestaat uit gebundelde muis serum uitgeput van endogene assay doelen. Het wordt gebruikt als een serum of plasma monster verdunningsmiddel te vermijden matrixeffecten, waarvan bekend is dat de invloed van analytische gevoeligheid van immunoassay. - Test cel cultuur supernatant monsters zonder verdunning.
Opmerking: De niveaus van de analyt kunnen variëren sterk van steekproef om steekproef. Eventueel verdunnen supernatant monsters met behulp van een verse bereiding van hun overeenkomstige cel kweekmedium of Assay Buffer.
5. Assay Procedure
Opmerking: de test kan worden uitgevoerd in polypropyleen filter platen, micro FACS buizen of V-bodem microplates. De filter procedure voor de bepaling van de plaat wordt aanbevolen vanwege de goede steekproef om steekproef consistentie, assay robuustheid en gebruiksgemak. Voor deze procedure moet een vacuüm filtratie-eenheid voor het wassen (geleverd door de eindgebruiker).
- Alle reagentia opwarmen tot kamertemperatuur (20-25 ° C) vóór gebruik toestaan.
- Set de plaat van de filter op de cover van een omgekeerde plaat te allen tijde tijdens de test setup en incubatie stappen, zodat de onderkant van de plaat raakt niet alle oppervlakken, omdat het kan leiden tot lekken.
- De plaat rechtop houden tijdens de gehele test procedure, met inbegrip van de stappen wassen, om te voorkomen dat verliezen kralen.
- Houden van de plaat in het donker of verpakt met aluminiumfolie voor alle stappen van de incubatie.
- Uitvoeren van alle normen en monsters als duplicaten, gerangschikt op de plaat in een opeenvolgende orde.
- Vooraf de filter plaat NAT door 100 µL van het 1 x wassen Buffer toe te voegen aan elk putje en laat het zitten voor 1 minuut bij kamertemperatuur (als filter-onderkant microplate).
- Van het buffervolume verwijderen met behulp van de vacuüm variëteit (5-10 s). Niet meer dan 10 " Hg van vacuüm. Vlek overtollige Wash Buffer vanaf de onderkant van de plaat door het indrukken van de plaat op een stapel schone papieren handdoeken. Plaats de plaat op de top van de omgekeerde plaat cover.
Opmerking: Stappen 5.1-5.2 kunnen worden weggelaten als het uitvoeren van de bepaling met behulp van een V-bodem microplate of micro FACS tubes. - Voor cultuur supernatant celsteekproeven, voeg toe 25 µL van Assay Buffer aan alle putjes. Voeg toe 25 µL van elke standaard aan de standaard putjes. Voeg toe 25 µL van elk monster aan de monster-putjes.
- Voor het meten van serum of plasma monsters, voeg toe 25 µL van Matrix B aan de standaard putjes. Voeg toe 25 µL van Assay Buffer aan de monster-putjes. Voeg toe 25 µL van elke standaard aan de standaard putjes. Voeg toe 25 µL van elke verdund serum of plasma monster aan de monster-putjes.
- Vortex gemengd kralen voor 30 s. toevoegen 25 µL van gemengde parels aan elk putje, schudden kraal fles met tussenpozen Voorkom parel regelen. Het eindvolume moet 75 µL in elk putje na toevoeging van kralen.
- Zegel de plaat met een plaat sealer. Wikkel de hele plaat, met inbegrip van de omgekeerde plaat cover, met aluminiumfolie. Plaats de plaat op een plaat shaker, veilig, en schud bij ongeveer 500 omwentelingen per minuut gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Om te voorkomen dat lekkende, niet van toepassing positieve druk op de plaat sealer.
- Zonder omkeren, plaatst u de plaat op de vacuüm variëteit en vacuüm als voorheen van toepassing en voeg 200 µL van het 1 x wassen buffer aan elk putje.
- Verwijder de inhoud van de putjes van de plaat assay door vacuüm filtratie. Blot overtollige was buffer vanaf de onderkant van de plaat met een absorberend stootkussen of papieren handdoeken. Herhaal deze stap nog eenmaal.
Opmerking: Als de test wordt uitgevoerd met behulp van een V-bodem microplate of micro FACS overslaan stappen 5.12 en 5.13 buizen. In plaats daarvan de plaat bij 1.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur centrifugeren en deze vervolgens verwijdert de bovendrijvende vloeistof met behulp van een meerkanaalspipet. - Voeg toe 25 µL van detectie van antistoffen (Zie de tabel van materialen) aan elk putje.
- Zegel de plaat met een verse plaat sealer. Wikkel de hele plaat, met inbegrip van de omgekeerde plaat cover, met aluminiumfolie.
- Plaats van de plaat op een plaat shaker en schud ongeveer 500 rpm gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Zonder stofzuigen, 25 µL van SA-PE reagens rechtstreeks toevoegen aan elk putje. Geen verwatering van het reagens nodig is.
- Zegel de plaat met een verse plaat sealer. Wikkel de hele plaat, met inbegrip van de omgekeerde plaat cover, met aluminiumfolie.
- Plaats van de plaat op een plaat shaker en schud ongeveer 500 rpm gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Herhaal stap hierboven 5.13.
- Voeg toe 200 µL 1 x wassen Buffer voor elk goed. Resuspendeer de kralen op een plaat-shaker voor 1 min.
- Monsters van de filter-plaat met behulp van een meerkanaals Pipetteer, overbrengen naar FACS buizen te lezen monsters op een stroom cytometer.
Opmerking: Monstervolume mag worden verhoogd van 200 µL tot 300 µL door een extra 100 µL van het 1 x wassen Buffer toe te voegen aan elke buis om te voorkomen dat het monster drooglopen. Als de nodige monsters kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C beschermd tegen licht en geanalyseerd de volgende dag. Echter langdurig monster opslag kan leiden tot verminderde signaal.
6. Flow Cytometer Set-up
Opmerking: om het genereren van betrouwbare gegevens, de stroom cytometer moet worden correct ingesteld voordat data-acquisitie. Dit proces zal variëren voor afzonderlijke gebruikers in sommige opzichten afhankelijk van de configuratie van het specifieke instrument dat de test wordt uitgevoerd op. Een veralgemeende setup-proces voor een cytometer kunnen meten PE en APC en uitgerust met zowel een 488 en 633 nm laser wordt besproken onder.
- Start van de stroom cytometer en acquisitie software volgens de fabrikant ' s instructies voorzien van het instrument.
- Maken een stip plot met FSC (forward-verstrooiing) op de x-as en SSC (kant spreiding) voor de y-as. FSC en SSC ingesteld op lineaire modus.
- Maak een tweede perceel van de stip met PE op de x-as en de APC voor de y-as. Dit perceel moet worden ingesteld op een log gebaseerde weergavemodus.
- Vortex de flacon van ruwe kralen inbegrepen in de kit voor 30 s tot resuspendeer de kralen. Deze parels bevatten een interne APC kleurstof en bestaan uit twee grootte populaties.
- Transfer 400 µL van de ruwe parels aan een nieuwe FACS buis.
- Het debiet van de cytometer-stroom ingesteld op lage.
- Lopen de ruwe kralen, zorgvuldig aanpassing van de winst en de spanning voor FSC en SSC zodat beide populaties van de grootte van deze parels zichtbaar gescheiden en gemakkelijk naar gate zijn.
- Aanpassen van de FSC-drempel om uit te sluiten van ongewenste gebeurtenissen (d.w.z. puin of air bubbles).
- In the FSC vs. SSC perceel, tekenen een hek dat omvat alle populaties van de kraal.
Opmerking: De ruwe kralen bevatten twee populaties van de grootte van de parels, de kleinere " een kralen " en de grotere " B kraal " gebieden. - De gated kraal populaties van de FSC vs. SSC plot op het tweede punt perceel met PE op de x-as en de APC voor de y-as weergegeven.
- De kruisspanning Bet voor de APC fluorescentie kanaal zodat de APC-signaal voor alle bead bevolking heeft een mediane fluorescentie-intensiteit (MFI's) die tussen 1 x 10, 1 en 5 x 10, 3 ligt.
- Vortex de flacon van PE setup kralen voor 30 s tot resuspendeer de kralen.
- Transfer 400 µL van de PE kralen aan een nieuwe FACS buis.
- Vervangen de ruwe kralen tube van de cytometer van de stroom met de PE buis kralen.
- De kruisspanning fotomultiplicator buis (PMT) voor de PE fluorescentie kanaal instellen zodat de MFI van de PE-parels tussen het bereik van de veel-specifieke gevonden valt genoteerd op de PE kralen flacon.
Opmerking: De PE setup kralen bevatten kralen van de grootte van een populatie (" een kralen " alleen).
7. Data-acquisitie
Opmerking: de exacte procedures die verband houden met de overname van gegevens over een bepaald instrument kan variëren en zijn afhankelijk van de cytometer ' s configuratie specificaties en de interfacesoftware die wordt gebruikt. De onderstaande instructies zijn daarom bedoeld om te benadrukken de vereiste stappen te nemen in de bepaling ongeacht de cytometer werkzaam in de assay.
- Controleren of het debiet van de cytometer is nog steeds ingesteld op laag.
- Het aantal kraal gebeurtenissen te verwerven tot ongeveer 300 per analyt instellen. Voor een 13-plex gecombineerd paneel, dit komt neer op het verwerven van 3900 gebeurtenissen uit zowel Parel grootte populaties (A + B kralen).
- Vortex elk monster voor 5 s vóór analyse.
- Lees de monsters. Bij het lezen van monsters, de stroom cytometer eerst ingesteld op de setup-modus en wacht totdat de kraal bevolking wordt gestabiliseerd voordat de overname schakelen.
- Eenvoudige namen met opeenvolgende nummering voor gegevensbestanden gebruiken om eenvoudig gegevensanalysen.
- Alleen de gated gebeurtenissen (A + B bead regio's) in plaats van totale gebeurtenissen exporteren.
- Slaat alle FCS-bestanden in dezelfde map voor elke assay. Als meerdere tests uitvoert, maakt u een aparte map voor elke assay.
Opmerking: de FCS bestanden gegenereerd op de stroom cytometer moeten worden geanalyseerd met behulp van de data analysesoftware, die kan worden gedownload voor gratis 14.
- Installeren van de software van de analyse van de gegevens op een PC.
- Alle assay FCS bestanden overbrengen naar de computer waarop de analysesoftware.
- De licentie sleutel dongle (meegeleverd in de kit) aansluit op een USB-poort van de computer.
- Lanceren van de data-analysesoftware.
- Klik op de blauwe " bestanden toevoegen " knop bevindt zich aan de bovenkant van het scherm.
- Navigeer naar de map waarin de bestanden van de FCS van de bepaling in het pop-upvenster dat verschijnt.
- Klik en sleep alle assay FCS-bestanden uit het pop omhooggaande venster naar het display van de software. Alle bestanden moeten nu worden weergegeven in een lijst.
- Klik op de groene " volgende " knop op het bodemrecht van het scherm. Klik met de linkermuisknop ingedrukt houden om te slepen van de kleine blauwe standaard curve knoppen (C7 aan C0) naar hun overeenkomstige FCS-bestanden uit de lijst te definiëren van de standaard curve.
- Klik op de groene " volgende " knop op het bodemrecht van het scherm te openen de gating knal opwaarts venster.
- Aan de linkerzijde van het gating venster Voer de namen van zowel de A en B kraal regio's assay analyt doelstellingen en hun bijbehorende kraal ID (te vinden in de handleiding met de bepaling) in oplopende volgorde.
- Selecteer het gating gereedschap vanaf de bovenkant van het pop omhooggaande venster en gebruik het om te tekenen 2 poorten in het proefvlak FSC vs. SSC, een rond de A-kralen en een tweede rond de B kralen.
- Bekijk de APC vs. PE scatter percelen die verschijnen onder de FSC vs. SSC plot die worden weergegeven. Er zullen 6 banden van de analyt in de A-kralen (linker perceel) en 7 analyt bands in de B-kralen (juiste perceel).
Opmerking: Gates kan worden getekend handmatig door te selecteren met het gereedschap Gummetje aan de bovenkant en klikken om te verwijderen van een bepaalde poort. De gating tool kan vervolgens worden geselecteerd en gebruikt een poort handmatig toe te passen om de gewenste band regio. - Klik op de groene " OK " knop aan de gating knal opwaarts venster sluiten en terugkeren naar de lijst met bestanden van FCS.
- Definiëren van eventuele verdunningen die zijn aangebracht in biologische monsters door rechts te klikken op een bestand, het selecteren van " verdunning vouwen " in het menu, en de invoer de juiste waarde.
- Klik op de groene " lopen " knoop bij het bodemrecht van het scherm te genereren van de standaard curven voor de bepaling en het berekenen van de concentraties van onbekende biologische monsters.
Representative Results
Dit protocol laat zien hoe een kraal gebaseerde immunoassay platform kan worden gebruikt om gelijktijdig het kwantificeren van cytokine profielen van biologische monsters met behulp van een cytometer stroom. De biologische monsters in dit voorbeeld gebruikt waren cel cultuur supernatant van muis-splenocytes die eerder had zijn geïncubeerd onder verschillende activerend condities, hoewel de assay-indeling is ook gevalideerd voor gebruik met serum of plasma monsters.
Gegevens die zijn gegenereerd op basis van de bepaling worden gebruikt voor het construeren van standaard curven voor alle analyten in het multiplexed deelvenster. De software van de analyse van de gegevens classificeert elk bepaald analyt op basis van een unieke parel omvang en intensiteit van de APC en kwantificeert ze met behulp van een PE-verslaggever. Het dynamische bereik, evenals de gevoeligheid van de test worden aangetoond wanneer uitgezet op een schaal van de log-log in figuur 2A. De software gebruikt assay gegevens en een 5-parameter curve fitting algoritme precies kunnen worden berekend niet alleen de concentraties van de analyten in gebruiker biologische monsters, maar ook de grenzen van de detectie op zowel de boven- en onderlimieten einde van alle standaard curven (tabel 1 ). De indeling die wordt beschreven in dit protocol biedt ook uiterst robuust assay precisie. In figuur 2B en 2 C worden de gegevens gepresenteerd beeltenis van de variabiliteit van de intra-assay van elke analyt. Twee aparte standaard eiwit concentraties (hoog en laag) werden geanalyseerd in één test met 16 replicatieonderzoeken voor elk monster. Figuur 2C en 2D vertegenwoordigen de Inter assay variabiliteit van doel analyten uit drie onafhankelijke testen. Zoals met de intra-assay precisie experimenten, hoge en lage standaard concentraties werden geanalyseerd met 3 repliceert in elk van de onafhankelijke experimenten. Minimale variabiliteit in de berekende concentratie van proteïnen toe doel is duidelijk zichtbaar.
Om aan te tonen het nut van cytometrische kraal gebaseerde testen in het ondervragen van cytokine expressieprofielen, werden muis splenocytes geïncubeerd onder verschillende activerend condities. Naast een ongestimuleerde controle, werden cellen ook geïncubeerd met LP's, anti-CD3/anti-CD28 antilichamen, of phorbol 12-myristaat 13-acetaat en ionomycin. Cel cultuur supernatant werden verzameld 48 uur later en getest met behulp van de muis T-helper cytokine-paneel. Het resultaat van de kwantificering van dit experiment wordt weergegeven in Figuur 3 en het effect van stimulatie voorwaarden op cytokine concentraties is duidelijk afgebakend.
De hierboven beschreven resultaten zijn typische, zolang de experimentator goede laboratoriumpraktijken techniek heeft en het meegeleverde assay-protocol volgt. Bronnen van fout in deze bepaling-indeling kunnen voortvloeien uit afwijkingen in incubatie tijden, reagens volumes, wassen, of uit onjuiste instellingen van de bet op de cytometer van de stroom gebruikt voor het analyseren van de monsters. In figuur 4A een spreidingsdiagram toont perceel van een succesvolle test 2 verschillende kraal populaties die duidelijk zijn gedefinieerd. Dit kan worden vergeleken aan figuur 4B, waar slechte naleving van wassen en protocol hebben geleid tot kraal aggregaten die vervagen van de twee bevolkingsgroepen. Bovendien, zoals blijkt uit het puin in de onderste linker Kwadrant, werden totale cytometer evenementen geëxporteerd voor analyse in plaats van de standaardindeling van gated gebeurtenissen alleen. Juiste cytometer instellen is cruciaal voor het genereren van betrouwbare gegevens in deze test. In figuur 4C juiste bet toestaan instellingen voor de oplossing van elk van de 6 analyten in het kanaal van de classificatie APC. Onjuiste instellingen van de bet zal resulteren in gegevens vergelijkbaar met die in Figuur 4 d waar de APC-kanaal kraal populaties met overlappende classificatie intensiteiten heeft gepresenteerd. Vervalt de bepaling aangezien het onmogelijk zijn zal te berekenen van de analyt concentraties zonder duidelijk omschreven populaties van assay kralen.
Figuur 2: standaard Curve bereiken en Assay precisie. (A) een representatieve standaard curve gegenereerd met behulp van de muis T-helper cytokine-paneel. Een standaard curve moet worden uitgevoerd met elke test. (B-C) Intra-assay precisie. Twee monsters met verschillende concentraties van doel eiwitten (hoog en laag) werden geanalyseerd in één test met 16 replicatieonderzoeken voor elk monster. Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde + standaarddeviatie. (D-E) Inter assay precisie. Twee monsters met verschillende concentraties van doel eiwitten (hoog en laag) werden geanalyseerd in drie onafhankelijke tests met 3 replicatieonderzoeken voor elk monster. Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde + standaarddeviatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: kwantificering van vertegenwoordiger resultaten. Muis splenocytes (1 x 106 cellen) werden gekweekt bij 37 ° C + 5% CO2 onder verschillende omstandigheden: ongestimuleerde, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µg/mL plaat beklede) + αCD28 (1 µg/mL oplosbaar), PMA (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). Cultuur supernatant werden verzameld na 48u dan gekwantificeerd aan de hand van de muis T-helper cytokine-paneel. Differentiële cytokine expressieprofielen bij reactie op de stimulatie voorwaarden zijn duidelijk zichtbaar. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: resultaten van succesvolle vs. mislukte testen. (A) succesvolle testen zal hebben verschillende kraal populaties voor de bevolking van de microsfeer. (B) mislukte tests zal hebben arme bevolking scheiding, kraal aggregaten en teveel verzamelde gebeurtenissen. (C) succesvolle testen hebben duidelijk intensiteiten in de indeling fluorescentie kanaal die gemakkelijk kunnen worden gate en kwantificeren. (D) mislukte tests zal hebben slecht gescheiden en intensiteiten van de classificatie die meerdere kraal populaties overlappen, kwantificering te bemoeilijken. Veel van deze fouten kunnen worden vermeden door middel van zorgvuldige naleving van het protocol assay. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Standaard Curve | Gevoeligheid (pg/mL) | ||||
| Analyt | Fit formule | CV | R2 | Min. | Max. |
| IFN-Γ | 5-P.log(4.43, 14.40, 0.54, 9.11, 0.01) | 1,77% | 0.99 | 2.1 | 18105.0 |
| IL-5 | 5-P.log(4.36, 12.68, 0.64, 5.73, 0.36) | 1,32% | 1 | 1.9 | 14514.0 |
| TNF-Α | 5-P.log(4.36, 11.63, 0.79, 5.45, 0.37) | 1,48% | 0.99 | 1.9 | 20109.0 |
| IL-2 | 5-P.log(4.46, 12.62, 0.78, 5.07, 0.34) | 1,34% | 1 | 1.9 | 25109.0 |
| IL-6 | 5-P.log(4.58, 11.66, 0.64, 5.77, 0.37) | ||||
Tabel 1: standaard Curve-Fitting en Assay gevoeligheid. De software van de analyse van de gegevens werd gebruikt voor het genereren van standaard curven voor alle analyten opgenomen in de bepaling van multiplex. Dit volledig geautomatiseerde analyse geldt een robuust 5-parameter curve passend algoritme om de normen van de reeks verdunning van de bepaling en werd ook gebruikt voor het definiëren van de gevoeligheid van de test met behulp van de theoretische grenzen van detectie.
Discussion
De indeling van de test die wordt beschreven in dit protocol kan gebruikers robuuste kwantificering van oplosbare bemiddelaar profielen in biologische monsters als bedoeld de experimentator heeft goede laboratoriumpraktijken techniek en voldoet aan de aanbevolen protocol.
Er zijn enkele belangrijke stappen die moeten worden gevolgd teneinde betrouwbare resultaten. Ten eerste, de recombinante normen moeten kunnen reconstrueren in assay buffer de full-time aanbevolen, en daarna alleen verdund in polypropyleen tubes. Polystyreen buizen kunnen de bevordering van de hechting van de eiwitten van de wanden van de buizen, die tot lage signalen leiden kan bij het genereren van de standaard curve. Tweede, goed schudden tijdens de incubatie stappen is van cruciaal belang. Zonder juiste agitatie, kunnen de bindende eigenschappen van de kralen assay ernstig worden belemmerd. Daarnaast is goede wassen tussen incubatie stappen ook vereist. De experimentator moet zorgen dat overtollige reagentia worden verwijderd uit de putten vóór de volgende stap in het protocol. Instrumenten-instellingen voor de cytometer van de stroom gebruikt om te ondervragen de assay kralen moeten eveneens worden geoptimaliseerd. In het bijzonder, moeten bet-instellingen worden aangepast om ervoor te zorgen de juiste kraal scheiding en brede dynamische bereik voor de standaard curven. Tot slot, net vóór de analyse wordt uitgevoerd op de cytometer, kralen moeten vortexed te verzekeren van de juiste schorsing en om te voorkomen dat de vorming van aggregaten die resultaten kunnen scheeftrekken.
Dit protocol kan mogelijk worden aangepast voor het analyseren van weefsel homogenates, alsmede de vormen van de steekproef besproken in dit manuscript, mits de onderzoeker bereid is voor het optimaliseren van hun lysis-protocol vóór het uitvoeren van grote, volledige plaat testen. De werkelijke techniek hangt natuurlijk af van weefseltype; het protocol moet echter in het algemeen een neutrale pH buffer met fysiologische concentraties van ionogene zouten, geen denatureren chemicaliën en bij voorkeur geen schoonmaakmiddelen gebruiken. Als wasmiddel moet worden gebruikt, dient niet-ionogene wasmiddel concentraties worden bewaard bij een minimum (bijvoorbeeld niet meer dan 1%). De buffer moet ook voldoende proteaseinhibitors Voorkom Proteolytische afbraak van doel eiwitten bevatten. Ongeacht de lysis-protocol gebruikt, moeten de laatste voorbereidingen worden gecentrifugeerd om te verwijderen van de deeltjes vóór de analyse.
Met betrekking tot beperkingen van de test, de concentratie van de analyt doelen in biologische steekproef typen kunnen sterk variëren. Om goed kwantificeren concentraties van de analyt, moeten ze vallen binnen de hoogste en laagste waarden voor de standaard curve. Extrapolatie van de waarden van de curve is niet noodzakelijkerwijs betrouwbaar en niet aan te bevelen. Onderzoekers moeten daarom optimaliseren verdunningen voor hun bijzondere samples in proefprojecten voordat u een volledige-plaat assay. Daarnaast is de zorgvuldige voorbereiding van de biologische monsters te worden vehiculumcontrolegroep primordiaal voor het welslagen van deze bepaling-indeling. Monsters die zijn lipemic, hemolyzed of bevatten eiwitten puin zal beïnvloeden de antigeen-antilichaam interactie die het basisprincipe van deze immunoassay definiëren en maken van de resultaten die uninterpretable zijn.
Deze bepaling is van belang met betrekking tot bestaande kwantificering methoden om verschillende redenen. Wanneer het goed wordt uitgevoerd, kan de bepaling-indeling maximaal 13 analyten uit een monster via een veel kleiner volume dan nodig zijn zou om het analyseren van het monster met behulp van traditionele ELISA-testen, kwantificeren. Deze bepaling-indeling ook vereist geen speciale instrumentatie om te worden uitgevoerd. Dit is een voordeel ten opzichte van andere verkrijgbare kraal gebaseerde immunoassay zoals de test kan worden uitgevoerd met behulp van een willekeurig aantal veelgebruikte flow cytometers.
Wetenschappelijk onderzoek naar de rol gespeeld door secreted factoren en cytokine netwerken in gezondheid en ziekte breidt zich uit. De indeling van de test die wordt beschreven in dit manuscript kunnen een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers willen begrijpen van deze veelzijdige en complexe verschijnselen. Actieve biomedisch onderzoek programma's beginnen te verkennen van de rol van cytokine netwerken in niet alleen gebieden zoals veralgemeende ontsteking6, maar ook in context van bepaalde ziekte staten zoals atherosclerose, kanker, en neuroinflammation 15,16,17. Onderzoek zal ongetwijfeld blijven groeien in deze gebieden, zoals het zoeken naar nieuwe therapeutics naar deze chronische aandoeningen breidt zich uit. De noodzaak voor accurate en betrouwbare kwantificering van de oplosbare bemiddelaars die zijn gekoppeld aan deze ziekten zullen een kritisch onderzoeksprioriteit blijven.
Disclosures
De auteurs zijn in dienst van de BioLegend, die wordt beschreven in dit manuscript reagentia produceert. Vigene Tech, Inc. ontwikkelde de LEGENDplex data analysesoftware die wordt gebruikt voor het analyseren van de gegevens die zijn gegenereerd op basis van de bepaling in dit manuscript beschreven.
Acknowledgments
De auteurs wil erkennen van de bijdragen van de Biomarkers en Immuno-assays Product Development team voor de ontwikkeling van de bepaling. Daarnaast bedank we Vigene Tech, Inc. voor hun gezamenlijke inspanningen bij het ontwerpen van de data-analyse software-pakketten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor | Beckman Coulter | 366816 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
| LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel | BioLegend | 740005 | Multiplex Immunoassay (13-plex) |
| Anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format |
| Anti-mouse CD28 antibody | BioLegend | 102112 | Clone 37.51, low endotoxin, azide free format |
| Vacuum Pump | EMD Millipore | WP6111560 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
| Vacuum Manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
| Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher Scientific | 07-200-130 | Or equivalent |
| Polypropylene MicroFACS Tubes | Fisher Scientific | 11-842-90 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
| Pipette Kit | Fisher Scientific | 14-388-100 | Four pipette sizes (0.2-2µL, 2-20µL, 20-200µL, 100-1000µL) |
| Multi-Channel Pipette | Fisher Scientific | FA10011G | capable of dispensing 5 μL to 200 μL |
| Microplate Shaker | Fisher Scientific | 88880023 | Or equivalent |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002410 | Or equivalent |
| FACS tubes | Fisher Scientific | NC9885747 | 12 x 75 mm round bottom |
| PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L-8274 | Escherichia coli O26:B6 |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| Branson B200 Ultrasonic Cleaner | Sigma-Aldrich | Z305359 | Or equivalent |
| Microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | 1.5 mL polypropylene tubes |
| Flow Cytometer | Various | Various | Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm |
| 96-Well Polypropylene Plate | VWR | 82050-662 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
References
- Stanley, A. C., Lacy, P. Pathways for cytokine secretion. Physiology (Bethesda). 25, 218-229 (2010).
- Nicola, N. A. Cytokine pleiotropy and redundancy: a view from the receptor. Stem Cells. 12, (1994).
- Miyajima, A., Hara, T., Kitamura, T. Common subunits of cytokine receptors and the functional redundancy of cytokines. Trends Biochem Sci. 17, 378-382 (1992).
- Costantini, S., Castello, G., Colonna, G. Human Cytokinome: a new challenge for systems biology. Bioinformation. 5, 166-167 (2010).
- Capone, F., et al. Serum Cytokinome Profile Evaluation: A Tool to Define New Diagnostic and Prognostic Markers of Cancer Using Multiplexed Bead-Based Immunoassays. Mediators Inflamm. , 3064643 (2016).
- Schett, G., Elewaut, D., McInnes, I. B., Dayer, J. M., Neurath, M. F. How cytokine networks fuel inflammation: Toward a cytokine-based disease taxonomy. Nat Med. 19, 822-824 (2013).
- Tse, E., Kwong, Y. L. T-cell lymphoma: Microenvironment-related biomarkers. Semin Cancer Biol. 34, 46-51 (2015).
- Reale, M., Greig, N. H., Kamal, M. A. Peripheral chemo-cytokine profiles in Alzheimer's and Parkinson's diseases. Mini Rev Med Chem. 9, 1229-1241 (2009).
- Vistnes, M., Christensen, G., Omland, T. Multiple cytokine biomarkers in heart failure. Expert Rev Mol Diagn. 10, 147-157 (2010).
- Gobel, K., et al. Blood coagulation factor XII drives adaptive immunity during neuroinflammation via CD87-mediated modulation of dendritic cells. Nat Commun. 7, 11626 (2016).
- Palm, A. K., Friedrich, H. C., Kleinau, S. Nodal marginal zone B cells in mice: a novel subset with dormant self-reactivity. Sci Rep. 6, 27687 (2016).
- Yu, Y., et al. The transcription factor Bcl11b is specifically expressed in group 2 innate lymphoid cells and is essential for their development. J Exp Med. 212, 865-874 (2015).
- Pelly, V. S., et al. IL-4-producing ILC2s are required for the differentiation of TH2 cells following Heligmosomoides polygyrus infection. Mucosal Immunol. 9, 1407-1417 (2016).
- LEGENDplex Multiplex Assays. , Available from: https://www.biolegend.com/legendplex (2017).
- Autieri, M. Pro- and anti-inflammatory networks in atherosclerosis. ISRN Vascular Medicine. 2012, (2012).
- West, N. R., et al. Emerging cytokine networks in colorectal cancer. Nat Rev Immunol. 15, 615-629 (2015).
- Becher, B., Spath, S., Goverman, J. Cytokine networks in neuroinflammation. Nat Rev Immunol. 17, 49-59 (2017).
