Summary
For nylig kortlagt vi tre-dimensionelle (3D) rumlige placeringen af transportveje for forskellige proteiner translocating inde primære cilier i levende celler. Dette papir beskriver den eksperimentelle setup, processen med biologiske prøver og dataanalyse til 3D super-resolution fluorescens imaging tilgang nyligt anvendt i live her primære cilier.
Abstract
Den primære cilium er en mikrotubulus-baserede fremspring på overfladen af mange eukaryote celler og indeholder et enestående supplement af proteiner der fungerer kritisk i celle motilitet og signalering. Da cilia er stand til at syntetisere deres egen protein, skal næsten 200 unikke ciliaere proteiner være smugles mellem cytosol og primære cilier. Men det er stadig en teknisk udfordring at kortlægge tredimensionale (3D) steder af transport veje for disse proteiner i levende primære cilier på grund af begrænsninger i øjeblikket eksisterende teknikker. For at erobre udfordringen, har for nylig vi udviklet og ansat en højhastigheds virtuelle 3D super-resolution mikroskopi, såkaldte single-point kant-excitation sub diffraktion (hastighed) mikroskopi, for at bestemme den 3D fysisk placering af transport veje for begge cytosole og Membranproteiner i primære cilier af levende celler. I denne artikel, vil vi vise detaljerede opsætningen af hastighed mikroskopi, fremstilling af celler, der udtrykker fluorescens-protein-mærket ciliaere proteiner, sporing af individuelle proteiner i levende cilium realtid enkelt-molekyle og opnåelsen af 3D rumlige betafordelingen kort af transportveje til ciliaere proteiner.
Introduction
Da anført af Ernst abbed i 1873, har opløsning af konventionelle lysmikroskopi været menes at være begrænset til ca. 200 nm på grund af lyset diffraction fra objektive1,2. I øjeblikket super-resolution lysmikroskopi teknikker bryde denne begrænsning og tillade fangst af dynamiske billeder med sub diffraktion (< 200 nm) opløsning. Teknikkerne generelt opdeles i to hovedkategorier: stimuleret emission udtynding (STED) mikroskopi baserede tilgange, som genererer sub diffraktion belysning volumen på grund af ulineære optiske svar af fluorophores i prøver3; og photoactivated lysmikroskopi (PALM) og stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (STORM)-baseret super-resolution teknikker, der anvender matematiske funktioner for at lokalisere centroids af fluorophores og derefter rekonstruere disse centroids at danne super-resolution billeder4,5. I øjeblikket, på grund af den relativt ukompliceret optisk setup, PALM og STORM er udførligt ansat ved at kun aktivere en lille delmængde af fluorophores i hver ramme af en lang video af en biologisk forberedelse. Dette giver mulighed for mere nøjagtig lokalisering af 2D Gaussisk montering af fluorescerende stedet kaldes funktionen punkt spredt (PSF), af fluorescently mærket proteiner i hver ramme af videoen. 2D placeringen af hver fluorescently mærket molekyle kan derefter overlejret på et enkelt tænkelig plan at producere en super-opløsning billede af biologiske forberedelse1,2. Mens disse enkelt-molekyle lokalisering, super-resolution tilgange til mikroskopi helt sikkert revolutioneret hvordan billeddannelse af biologiske prøver blev udført, der er stadig udfordringer skal overvindes. For eksempel kan STORM og PALM opnå deres bedste rumlige beslutninger efter fiksering af biologiske prøver og således til stede en statisk repræsentation af fluorescently mærket proteiner, som er en lignende begrænsning af Elektron Mikroskopi. Derudover for at opnå høj rumlige opløsning for hver fluorescently mærket protein i levende celler, skal prøver være afbildet på meget lange framerates, som ikke er i stand til at fange protein dynamics. Det er derfor nødvendigt at overvinde disse vigtigste tekniske forhindringer.
For at opnå en høj spatiotemporelle opløsning, der er velegnet til påvisning af hurtige proteiner eller RNA'er i levende celler, har vi udviklet super-resolution hastighed mikroskopi i vores laboratorium (figur 1)6,7, 8. flere store tekniske fremskridt i hastigheden mikroskopi har tidligere gjort det muligt at kunne spore nucleocytoplasmic transport af små molekyler, proteiner, mRNA og virus via indfødte nukleare pore komplekser (NPC'ere)6, 7 , 8. kort, følgende funktioner hastighed mikroskopi vil blive brugt til at spore hurtige makromolekyler gennem sub mikrometer rotationsstøbt symmetriske strukturer i levende celler, såsom NPCs og primære cilier: (1) en skrå eller en lodret belysning PSF giver mulighed for excitation af enkelt molekyler i en lille diffraktion-limit volumen i brændplanet (figur 1); (2) den skrå polyesterfibre kan stærkt undgå out-of-fokus fluorescens og dermed forbedre signal-støj-forhold. (3) den optisk tæthed på 100-500 kW / cm2 i belysning PSF giver mulighed for tusindvis af fotoner vil blive indsamlet fra enkelt fluorophores med hurtig påvisning hastigheder (> 500 Hz). (4) hurtigt registrering af hastighed reducerer også i høj grad den enkelt-molekyle geografiske lokalisering fejl (< 10 nm) ved fastsættelsen af de rumlige baner af bevægelige fluorescerende molekyler i levende celler, fordi molekylære diffusion er en af vigtigste faktorer forårsager mangler af enkelt-molekyle lokalisering for at flytte molekyler. (5) almindelig 2D til 3D transformation algoritmer gør det muligt at give 3D rumlige betafordelingen kort af transportveje for molekyler i NPC eller den primære cilium. Det er bemærkelsesværdigt, at vores konverteringen mellem de kartesiske og cylindriske koordineringssystem bruges til at generere en 3D rumlige betafordelingen-kort i stedet for 3D enkelt-molekyle-tracking (figur 2). Elektronmikroskopi data har tidligere afsløret, at NPC9,10 og primære cilium11 begge har en rotationsstøbt symmetrisk struktur. I princippet bør tilfældigt spreder molekyler bevæger sig gennem NPC eller primære cilium også have rotationsstøbt symmetrisk distributioner. Som vist i figur 2, et stort antal tilfældigt spreder molekyler inde i cylinderen ville generere rotationsstøbt symmetrisk distributioner på visningen tværsnit som i NPC, yderligere resulterer i en omtrent ensartet rumlige fordeling inden for hver meget små subregion mellem to tilstødende ringe (figur 2E). Dette ensartet fordeling medfører, at den geografiske fordeling langs θ dimension i den cylindriske system er konstant. Derefter kan 3D-koordinater (R, θ, X) forenkles for at være 2D-koordinater (R, X, konstant). Faktisk, vores konverteringen mellem de kartesiske og cylindriske systemer er fra 2D (X, Y) til 2D (R, X, konstant). Den konstante θ, refererer til den rumlige tæthed Pedersen i figur 2E, beregnes ved hjælp af ligningen A
.
I sidste ende, enkelt-molekyle tracking har bred anvendelse i biologisk forskning, derfor er det naturligt, at et utal af teknikker vil blive udviklet for at udfylde særlige biologiske nicher12,13,14. Det er tilfældet med hastighed mikroskopi. Tidligere, når kombineret med en 3D transformation algoritme, denne teknik blev udviklet for at løse 3D transportruter i transit molekyler gennem NPCs, en sub-diffraction mellemstore og rotationsstøbt symmetrisk biologiske struktur6. I dette papir, er primære cilier vist sig at være fremragende model organeller som godt. Primære cilier er cylindrisk, antenne-lignende organeller (~ 125 nm radius), projekt fra overfladen af mest mammale celler15,16,17. De er ansvarlige for at modtage eksterne signaler og sender en intracellulær reaktion typisk forbundet med vækst og stofskifte15,16. Derfor, flux af strukturelle proteiner, genanvendelse af transmembrane receptorer, og transmission af intracellulære budbringere er afgørende ansvar for primære cilier. På tidspunkt mellem de primære cilie og cellen kroppen er en kritisk selektivitet barriere, kaldet overgangszone eller TZ, hvorigennem alle dette protein transport skal forekomme11,18,19, 20. Ud over TZ gating funktion der mindst to processer, transport, intraflagellar transport og passive diffusion, menes at være ansvarlig for bevægelse af protein gennem denne region16,21, 22. ud fra en menneskelig sundhed synspunkt, tab af primære cilier og efterfølgende deregulering af downstream signalering er karakteristisk for mange kræftformer. Derudover er mange genetiske sygdomme, såsom Bardet-Biedl syndrom og polycystisk nyresygdom, forbundet med defekte protein transport23. Både sub diffraktion grænse størrelse og den komplekse proces i selektiv protein transport gennem TZ gør de primære cilie primære mål for denne teknik. I denne metoder papir, vil vi vise sporing af en ciliaere transmembrane protein, somatostatin receptor 3 (SSTR3)24, mærket eksternt med Alexa Fluor 647 og en komponent af IFT, IFT2025, mærket med en smeltet normal god landbrugspraksis molekyle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. NIH-3T3 celle forberedelse til hastighed mikroskopi fra lager
- 1,5 uger før eksperimentet, inddrive en frisk kultur af NIH-3T3 celler fra en frossen bestand ved optøning ved 37 ° C og overføre cellerne til en 25 cm2 celle kultur kolbe med 3 mL af Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) suppleret med 110 mg/mL natrium pyruvat, 2 mM glutamin, 10% føtal bovint serum og 1% penicillin/streptomycin.
- Inkuber celler ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Opdel celler på 80% confluency, om hver to dage, mindst tre gange før eksperimenterende dag at sikre homogeniteten af cellecyklus. Trypsinize celler med 0,25% trypsin i 2 minutter ved 37 ° C, Aspirér trypsin og erstatte det med 2 mL af medium. Pipette medium gentagne gange til at bryde op celle klynger, fjerne det ønskede antal celler og bringe samlede volumen af medier tilbage op til 3 mL.
Bemærk: NIH-3T3 var tidligere genetisk manipuleret til at udtrykke NPHP-4, et protein, der lokaliserer den TZ26, smeltet på C-terminus til mCherry. mCherry er en fluorophore, som kan være glade med 561 nm belysning til kvantitativt lokalisere TZ selektivitet barriere og orientere de primære cilie. - To dage før forsøget, plade celler ind i en 35 mm glas bund fad på 60-70% confluency med 1,5 mL af den samme medium som skridt 1.1 og returnere cellerne til rugemaskine.
- En dag før forsøget, kemisk transfect celler med den ønskede plasmid. Bland 500-1000 ng af den ønskede plasmid (Se Note nedenfor) i forholdet 1: 2.5 med Transfektion reagens i 0,25 mL af reducerede serum medier uden antibiotika i 30 min. aspirat medier fra 35 mm glas bund fad og erstatte det med 0,25 mL plasmid / Transfektion reagens sammenblande plus en ekstra 1,25 mL af reducerede serum medier uden antibiotika. Nedsat serum medier tjener det formål at fremme en vellykket Transfektion, inducerende primære cilier vækst, samt holde cellerne i live længe nok til at udføre eksperimentet. Returnere celler til rugemaskine for forsøget på den følgende dag.
Bemærk: Når du udfører enkelt-molekyle sporing af IFT20, et plasmid som indeholder en genetisk modificeret IFT20 smeltet på sin C endestation for normal god landbrugspraksis er brugt25. Når du udfører enkelt-molekyle sporing af SSTR3, et plasmid som indeholder en genetisk modificeret SSTR3 smeltet på sin N endestation for en acceptor peptid (AP) domæne og C endestation for normal god landbrugspraksis er brugt22. Ud over SSTR3 konstruktionen, et plasmid som indeholder biotin ligase BirA skal udtrykkes Co og Transfektion medier skal suppleres med 10 µM biotin. BirA tillægger derefter AP domæne af nyligt syntetiserede AP-SSTR3-NGL molekyler på niveau med Skadestuen biotin. Alexa647 konjugeret til tre af de fire biotin-bindingssteder på streptavidin, i gennemsnit, kan derefter suppleres til medierne før imaging til fluorescently etiket AP-SSTR3-NGL molekyler på den udvendige overflade af cellen22,27 . Normal god landbrugspraksis og AlexaFluor647 anvendes i denne metode; andre fluorescerende sonder kan dog bruges, hvis de har tilsvarende høj foto-stabilitet og quantum udbytte. - Hvis bruger eksternt mærket SSTR3 konstruktion, fjerne medier fra glas bund fad 1 h før eksperimentet, vaske celle 5 gange med 1 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS), og tilføje 1 mL af reducerede serum media suppleret med 1 µM Alexa647 konjugeret streptavidin.
- Ikke mere end 15 min før forsøget, fjerne medier fra bunden glasskål og transfekteret og mærket cellerne vaskes 5 gange med 1 mL PBS.
- Sted 1 mL af imaging buffer (20 mM HEPES, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7.3) i bunden glasskål.
Bemærk: I imaging-buffer celler er rentabelt for ikke længere end 3 h. Derfor udføres kun 2 h forsøg på hver tallerken.
2. hastighed mikroskopi
Bemærk: Hastighed mikroskopi installationsprogrammet indeholder en inverteret fluorescens mikroskop udstyret med en 1,4-NA 100 × oliebestan apokromatiske mål, en 35 mW 633 nm He-Ne laser, 50 mW solid state 488 nm og 561-nm lasere, en på chip multiplikation gevinst gebyr-kombineret-enhedens kamera og et mikroskop softwarepakke til opsamling og databehandling (figur 1). For individuelle kanal imaging, normal god landbrugspraksis, mCherry og Alexa647 er begejstrede ved 488 nm, 561 nm eller 633 nm lasere, henholdsvis. For enkelt molekyle tracking bruges enkelt punkt belysning til at spore individuelle fluorescently mærket molekyler. For epifluorescensmikroskop imaging placeres en konkav linse i laser belysning stien for at udvide strålen i en ensartet felt af belysning. Fluorescens emission er indsamlet af de samme mål, filtreret efter en dichroic filter (405/488/561/635) og en emission filter (405/488/561/635) og afbildet med de ovenstående CCD kamera opererer på 500 Hz til enkelt molekyle sporing eller 2 Hz til epifluorescensmikroskop billeddannelse.
- Anbringer bunden glasplade til fase af mikroskop og finde en celle, der korrekt udtryk for de ønskede konstruktioner. Når en egnet celle er blevet fundet, justere NPHP4-mCherry sted i bunden af de primære cilie med placering i imaging flyet, der svarer til den laser singlepoint belysning.
- Capture et epifluorescensmikroskop billede af NPHP4-mCherry og enten IFT20-NGL eller AP-SSTR3-normal god landbrugspraksis ved hjælp af funktionen "Snap" under fanen "Kamera" i vinduet "fokus", hvis brug af digitale mikroskopi-softwarepakken (Se Tabel af materialer).
Bemærk: Disse billeder vil fungere som en reference for de efterfølgende enkelte molekyle steder. - Når reference billeder er opnået, lokalt reducere koncentrationen af mærket enkelt molekyler. Foto-blegemiddel TZ med 1 mW laser belysningsstyrke for 20 s eller indtil fluorescens-intensiteten ligger tæt op ad baggrund fluorescens.
Bemærk: Når den præcise koncentration kan styres, 0,1-1 nM mærket enkelt molekyler er brugt. - For at forberede enkelt molekyle tracking, reducere laser belysningsstyrke strømmen til ~0.15 mW for enkelt molekyler mærket med normal god landbrugspraksis eller ~0.5 mW for molekyler, mærket med Alexa647.
- Så snart laser power og imaging parametre er sæt, maksimal gevinst og intensivering og 2 ms framerate, til enkelt molekyle imaging, engagere passende belysning laser og optage ikke-photobleached, mærket enkelt molekyler, som de transporteres gennem photobleached-regionen i TZ ved at klikke på knappen "Stream" under fanen "Kamera" i vinduet "fokus".
Bemærk: Ikke mere end 2 min video skal registreres for at minimere virkningerne af ciliaere drift til et ubetydeligt niveau. - Efter fanger den enkelte molekyle video, proces videoer ved hjælp af en 2D Gaussisk montering algoritme, som glimt af Gelles Lab, som netop lokaliserer barycentrum for hver enkelt molekyle excitation PSF i en altomfattende område af interesse (AOI).
- Vælg alle enkelt molekyle steder med præcision < 10 nm og rette op på midten af cilier baseret på distribution af enkelt molekyle steder udstyret med en 2D Gaussisk funktion.
Bemærk: Ved hjælp af 2D 3D transformation algoritme, 3D transportveje for IFT20-normal god landbrugspraksis og AP-SSTR3 ruter er tydeligt vist på ciliaere axonemal eller ciliaere membran, henholdsvis.
3. 2D til 3D Transformation
- Når flere tusinde lokaliseringer for transit molekyler (signal til støj forhold > 11) i cilium er indsamlet, skal du vælge cilium længdeakse som X-dimension. Gøre et Y dimension histogram af placeringer og få bin beløb i 10 nm intervaller.
Bemærk: 2D til 3D transformation kan vurderes af hånden eller software eller programmeringssprog. Forfatterne har med succes gennemført omdannelsen i Matlab og Python 2.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette afsnit viser resultaterne af udførelse hastighed mikroskopi på TZ af primære cilier at studere transportruten af SSTR3 forbundet med en ~ 15 nm eksterne linker til Alexa647 (fig. 3A). Det tjener det dobbelte formål at verificere 3D transformation algoritme. Alexa647 bør kun etiket den udvendige overflade af det primære cilium og derfor transportruten 3D skal afsløre en high-density transportruten på denne placering. NIH-3T3 stabilt udtrykker NPHP3-mCherry på TZ skal transfekteret med AP-SSTR3-normal god landbrugspraksis og udruget efter ovennævnte protokol med streptavidin-konjugeret Alexa647. Bredt felt billeddannelse af etiketten mCherry bruges til at lokalisere TZ, mens normal god landbrugspraksis bruges til at sikre, at en celle har givet udtryk for den ønskede SSTR3 konstruktion. Derudover er bredt felt billeddannelse af etiketten Alexa647 ved 633 nm belysning nødvendige for at bekræfte, at cellen er korrekt udtryk BirA plasmid og har absorberet tilstrækkeligt biotin fra medierne. Positiv bekræftelse er karakteriseret ved en synlig cilium adskilt fra baggrunden fluorescens (fig. 3B). Effektiv mærkning af AP-SSTR3-NGL konstruktion med streptavidin-konjugeret Alexa647 kan kun ske under disse betingelser. Når positive bekræftelse af selektiv mærkning af de primære cilium af Alexa647 er opnået, vil photobleaching og enkelt punkt belysningen af TZ med en 633 nm laser tillade enkelt molekyler til visualiseres. Før dataanalyse er sammenføje enkelt molekyle video på bredt felt belysning en nyttig valideringstrinet (figur 3C). For eksempel, hvis laseren ikke er justeret korrekt, vises ingen enkelt molekyler til co lokalisere med TZ. En anden før data analyse validering skridt til at sikre et passende signal-støj-forholdet er at kontrollere intensiteten på TZ over længden af den enkelt molekyle video (figur 3E). En sådan analyse kan udføres hurtigt i ImageJ ved hjælp af funktionen 'plot z akse profil'. Toppe i figur 3F svarer til en enkelt molekyle på TZ udseende med et signal til støj af ~ 5.0. Denne graf er også i stand til at sikre, at nok photobleaching har fundet sted, som det fremgår af godt adskilt hyppigheden af enkelt molekyler. Figur 3 G viser et lavt signal til støj forhold på < 0.5. Én forklaring ville være, at laseren ikke justeres direkte på TZ. En anden årsag kan være, at laser belysningsstyrke magt er for lavt. Begge forklaringer resultere i lav excitation og derfor lav emission af fluorophores på TZ. Efter disse kontroller har foretaget, vil 2D Gaussisk montering af enkelt molekylerne producere deres baner i TZ (figur 3H). Sammenføje mange baner vil producere transportruten af mærket protein af interesse i TZ (figur 3jeg). Da 2D Gaussisk montering svarer til pixelværdier på detektoren, x, kan y enkelt molekyle data flettes med bredt billede af TZ og primære cilier yderligere illustrerer protein af interesses lokalisering (figur 3Jørgensen ).
IFT20 er en komponent af IFT kompleks, der bærer fragt langs mikrotubuli inde primære cilier25. Arl13b-mCherry, et protein, der udbredte ciliaere markør blev brugt til at mærke primære cilier19. Wide-felt epi-Fluorescens mikroskopi blev brugt til at afbilde den primære cilium udtrykker både Arl13b-mCherry og IFT20-normal god landbrugspraksis og så skiftede til hastighed mikroskopi til at spore individuelle IFT20-NGL proteiner i primære cilier efter en pre-photobleaching af normal god landbrugspraksis Fluorescens enkelt-molekyle niveau i området belysning hastighed mikroskopi (figur 4A-4 C).
Til sidst, kan hundredvis af enkelt-molekyle IFT20-NGL steder med en systematisk lokalisering præcision af < 16 nm fås fra den primære cilium af en levende celle (figur 4D). Ifølge vores simulering, 250 enkelt molekyle steder med en radius af 95 nm var nok til at generere en pålidelig 3D transport route (figur 5). En endelig bestemmelse af IFT20-NGL transportrute er baseret på tusindvis af enkelt-molekyle IFT20-NGL steder indsamles fra ti cilier (figur 4E). Da primære cilier besidder en struktur med rotational symmetri, blev 2D til 3D transformation algoritme anvendt til 2D forventede data. Interessant, 3D rumlige betafordelingen kort over IFT20 anført, at kun en enkelt high-density region med en ~ 60-nm bredde toppede ~ 95 nm langs radius af primære cilier (figur 4E). Denne high-density region sandsynligvis lokaliserer Co med axonemal mikrotubuler i samarbejde med den kendte placering af ruten IFT (figur 4F).
Figur 1 . Forenklede skematiske hastighed mikroskopi. En lodret (bane 1) eller en skrå (stien 2) punkt spredning funktion bruges til at belyse enkelt fluorophore molekyler i brændplanet. "d" henviser til afstanden mellem lodrette belysning laserstråle, der passerer gennem midten af målet og vinklet belysning, som opnås ved at fokusere belysning laser på kanten af mål. To eller flere lasere reguleret af en optisk chopper har en-off excitation tilstand bruges til at spore de enkelt molekyler transit gennem NPC eller den primære cilium. Den off tid er mindst ti gange længere end photobleaching tid af fluorophore etiket på de målrettede molekyler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Grafisk demonstration af 2D til 3D konverteringen. Skemaer vise 2D til 3D transformation algoritme for molekyler, for eksempel, hvis de diffuse inden for centrale lumen (A-F) eller et randområde (GL) af et rør. A ideelle 3D geografiske placeringer af tilfældigt spreder molekyler inde i et rør kan koordineres i en cylindrisk koordinationssystem (R, θ, X). I hastighed beregnes kun 3D tæthed kortet i sidste ende fra 2D geografiske placeringer. Men dette er en idealiseret sag at illustrere, at 3D tæthed kort er tilsvarende om 2D eller 3D rumlige lokationerne er kendt. (B) 3D molekylære placeringer i en er projiceret op på en 2D flyet i en kartesiske koordinationssystem (X, Y, Z) ved mikroskopi imaging. (C) en meget tynd skive (Δx) skæres fra cylinder i A langs x-dimension. (D) 3D rumlige placeringer i Skive vist i C kan projiceres inden for en snæver 2D region. (E) tværsnit visning af alle steder i tynde skive vist i C. Disse steder kan grupperes i subregioner mellem koncentriske ringe. Givet high-antal tilfældigt fordelte molekyler i cylinderen og skæres meget tyndt skive, den rumlige tæthed af steder (pjeg) i hvert underregion (Si) mellem to tilstødende ringe bliver rotationsstøbt symmetriske og ensartet. Disse steder kan projiceres videre i 1D langs Y-dimension. Hvis steder langs Y dimension er grupperet i et histogram med j kolonner. Det samlede antal placeringer i hver kolonne (Aj) er lig med 
, som kan måles eksperimentelt, som vist i (F). (G-L) Samme som ovenstående, omstillingsprocessen præsenteres for molekyler spreder i et randområde af et rør. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . 3D fysisk placering af transportruten til SSTR3 på live primære cilier kortlagt af hastighed mikroskopi. (A) grafisk repræsentation af hastighed mikroskopi anvendes til sporing af normal god landbrugspraksis-mærket SSTR3 gennem TZ præget af NPHP4-mCherry. B epifluorescensmikroskop billede af NPHP4-mCherry (rød), AP-SSTR3-NGL (grøn), Alexa647 bruges til eksternt label AP-SSTR3-NGL (hvid), og den endelige flettede billede. Skalalinjen: 2 µm. c Tracking af en enkelt Alexa 647-mærket AP-SSTR3-normal god landbrugspraksis (hvid) der passerer gennem feltet punkt belysning for fire rammer (2 ms/ramme). Skalalinjen: 2 µm. (D) enkelt molekyle bane (hvid) fra (C) overlejret på et epifluorescensmikroskop billede af NPHP4-mCherry (rød) og AP-SSTR3-NGL (grøn). Skalalinjen: 2 µm. (E) hvide stiplede firkantede højdepunkter område af enkelt punkt belysning centreret på TZ. Skalalinjen: 2 µm. (F) foton count vs stel nummer grafen for et enkelt molekyle video med et højt signal til støjforhold bestemmes ved at dividere den maksimale fluorescens enkelt molekyle divideret med baggrund fluorescens. (G) foton count vs ramme tal grafen for et enkelt molekyle video med et lavt signal / støjforhold. (H) bane fra (E) og (D) lokaliseret i hver ramme af 2D Gaussisk montering og overlejret på en nøjagtig grafisk repræsentation af TZ, også lokaliseret af 2D Gaussisk montering. 2D Gaussisk montering proces passer en Gaussisk funktion til X og Y dimensioner af profilen intensiteten af et område af interesse (AOI) omfatter enkelt-molekyle PSF.(I) 2D super-resolution rumlige fordeling af 220 individuelle Alexa Fluor 647-mærket AP-SSTR3-NGL steder indsamles fra en enkelt primære cilium. J super-resolution enkelt molekyle steder fra (I) overlejret på et epifluorescensmikroskop billede af NPHP4-mCherry (rød) og AP-SSTR3-NGL (grøn). Skalalinjen: 2 µm. (K) af en 2D til 3D transformation algoritme, den rumlige betafordelingen fordeling af Alexa Fluor 647-mærket AP-SSTR3-NGL på primære cilier langs dimensionen Rasmussen blev opnået. Baseret på Gaussisk funktion montering, Alexa Fluor 647-mærket AP-SSTR3-normal god landbrugspraksis primært beliggende på ciliaere membranen i en radius af 131±3 nm med en fuld bredde på halv maksimum (FWHM) på 24±1 nm. (L) tværsnit visning af rumlige betafordelingen distribution (grøn Sky) af Alexa Fluor 647-mærket AP-SSTR3-NGL på primære cilier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . 3D fysisk placering af transportruten til IFT20 inde i live primære cilier kortlagt af hastighed mikroskopi. (A-C) Repræsentativt billede af Arl13b-mCherry (A) og IFT20-normal god landbrugspraksis (B) Co udtrykt i en NIH3T3 celle, og den fusionerede (C). Cirkel (cyan) angiver placeringen af single-point belysning hastighed mikroskopi på en primær cilium voksede på siden af en celle (hvide stiplede linjer) Hvis kanterne bestemmes af IFT20-NGL fluorescens i cellen kroppen og lysfelt belysning (ikke vist). Skalalinjen: 10 µm. (D) 2D super-resolution rumlige fordeling af 286 individuelle IFT20-NGL steder indsamles fra en enkelt primære cilium. (E) af en 2D til 3D transformation algoritme opnås fysisk betafordelingen fordeling af IFT20-NGL inde primære cilier langs dimensionen Rasmussen. Baseret på Gaussisk funktion montering, finde IFT20-NGL primært i en radius af 95±1 nm med en fuld bredde på halv maksimum (FWHM) på 56±5 nm. F tværsnit visning af rumlige betafordelingen distribution (grøn skyer) af IFT20-normal god landbrugspraksis i primære cilier, belagt med skematiske i H. skalalinjen: 100 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Simulation blev brugt til at vurdere det minimum antal 2D enkelt-molekyle steder til at generere en pålidelig 3D rumlige betafordelingen kort til 2D til 3D transformation algoritmer. (A) beregningsmæssigt genereret enkelt-molekyle steder tilfældigt prøve fra radial tæthed normalfordeling centreret på 95 100 nm (svarende til den primære transportrute af IFT20 bestemmes i vores eksperimenter). Lokalisering præcision af 16 nm er simuleret for hver enkelt-molekyle placering af prøvetagning fra en normalfordeling med σ = 16 nm. Som vist i figur 2C, en meget tynd skive (Δx) i X-dimension bruges til transformation algoritmer og derfor dimensionen X er ikke vist på beregningsmæssigt genereret 2D enkelt-molekyle placeringer. B transformation mellem Y-dimensionelle projektdata og 3D Rasmussen-dimensionelle tæthed generere histogrammer af 3D Rasmussen-dimensionelle tætheder for fem forskellige simulerede datasæt (hver med 100 point). Den nummer ovenfor er peak holdning ± montering fejl. (C-D) Simulering resultater baseret på 250 enkelt-molekyle steder. (E-F) Simulering resultater baseret på 500 enkelt-molekyle steder. (G-JEG) Gennemsnitlig 3D tæthed histogrammer fra 100 - 250- og 500-point simuleringer henholdsvis. Fejllinjer udgør variabilitet i histogrammet bin højder mens tal over toppen er den gennemsnitlige peak holdning ± standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver anvendelsen af hastighed mikroskopi til den primære cilium, en cellulær signalering organelle, der er stærkt afhængig af effektiv protein transport. HASTIGHED mikroskopi kan give høj opløsning (< 10 nm) steder for fluorescently mærket molekyler som de passerer gennem enkelt punkt belysningen centreret om TZ. Det er tidligere blevet anvendt til at undersøge protein handel gennem NPC6,7,8. Det kan dog udvides til at studere handel gennem nogen sub diffraktion cellulære hulrum. Denne teknik har en fordel frem for andre med høj opløsning Billeddannende teknikker i, at det er købedygtig fange dynamikken i enkelt protein transport i levende celle systemer på en rumlige og tidsmæssige opløsning af < 10 nm og < 2 ms, henholdsvis. En anden fordel er at man skal kun fluorescently-label et protein af interesse og express konstruktion via Transfektion, en fælles Molekylærbiologi tilgang til at studere proteiner lokalisering, for at begynde at udføre hastighed mikroskopi. Man skal holde i tankerne at singlepoint belysning med en high-power laser er den funktion, der giver godt adskilt, høj opløsning enkelt molekyle steder. Men dette også begrænser området belysning og gør teknikken ikke velegnet til bredt felt lokalisering. Heldigvis er der mange bredt felt super opløsning teknikker for efterforskerne at vælge imellem, hvis det ønskes. Et andet punkt at overveje er, at hastigheden mikroskopi kun fanger steder af omflytning enkelt molekyler. Kombination med FRAP, som kan afgøre brøkdel af samlede molekyler, der er mobile, kan derfor være et nyttigt supplement til analyse.
Konverteringen mellem de kartesiske og cylindriske samordningssystemet er at generere en virtuel 3D betafordelingen kort i stedet for en 3D-visning baseret på 3D enkelt-molekyle tracking. Detaljeret, har elektronmikroskopi data viste, at de primære cilie har en rotationsstøbt symmetrisk struktur, som kan generere en ensartet molekyle distribution langs visse radius. Dette ensartet fordeling medfører, at den geografiske fordeling langs θ dimension i den cylindriske system er konstant. Derefter kan 3D-koordinater (R, θ, X) forenkles for at være 2D-koordinater (R, X, konstant). Faktisk, vores Transformer processen mellem den kartesiske og cylindriske systemer er fra 2D (X, Y) til 2D (R, X, konstant). Den konstante θ, refererer til den rumlige tæthed Pedersen, beregnes ved hjælp af ligningen A
(figur 2). Brug en matrix lommeregner til at beregne vektoren 
, som svarer til de relative områder mellem tilstødende koncentriske cirkler i tværsnit Se6,7Salling samlede interaktion websteder på position Jørgensen målt direkte fra eksperimenter; Således, pjeg, den rumlige betafordelingen af interaktion websteder på r,jeg, kan beregnes ved at løse matrix ligningen a.
Et kritisk trin i protokollen er at minimere enhver undertrykkelse af netbårne af opsætningen mikroskopi mellem reference billede erhvervelse og enkelt molekyle video. Hvis der opstår nogen bevægelse, er det ikke muligt at trygt tilknyttes ultrastruktur af de primære cilier der blev hentet via epifluorescensmikroskop imaging enkelt molekyle steder. Et andet vigtigt skridt er at photobleach inden for belysning nok til lokalt reducere koncentrationen af fluorescently mærket enkelt molekyler, men ikke så meget, at befolkningen er helt photobleached. I forbindelse med SSTR3, diffusion koefficient er langsom sammenlignet med opløselige molekyler og bevægelse af en population af FN-photobleached SSTR3 molekyler tilbage ind i photobleached området vil være længere end to minutter, hvorover den ciliaere drift er en ikke ubetydelig faktor. Hvis det rette niveau af photobleaching er vanskelig at nå og et højt niveau af baggrunden Fluorescens er stadig til stede, en vinklet belysning laser kan bruges til at reducere mængden af fluorescently mærket enkelt molekyler, der er begejstrede over og under den Imaging fly. Dette vil reducere baggrunden og forbedre signal-støj-forholdet for hver erobrede enkelt molekyle.
I Resumé er hastighed mikroskopi købedygtig gennemføres let på konventionelle mikroskopi opsætninger ved tilsætning af en laser belysning kilde, tilhørende spejle og høj hastighed CCD kamera. Den største fremgang over andre lignende teknikker er den tilbøjelig laser, som reducerer baggrund fluorescens og 2D til 3D transformation algoritme, der rekonstruerer 3D rumlige betafordelingen kort fra den 2D enkelt-molekyle placeringer. Fra et biologiske synspunkt, er ingen ekstra mærkning udover en fluorophore-konjugeret protein af interesse nødvendig. Disse funktioner kan hastighed mikroskopi til at følge enkelt molekyler med høj spatiotemporelle (5-10 nm, 0,4-2 ms) opløsning som de trafik gennem en sub mikrometer bio-hulrum eller bio-kanal med rotationsstøbt symmetriske strukturer. Kombineret med en 3D betafordelingen transformation algoritme, kan 3D transportruter af mærket proteiner bestemmes gennem hulrum eller kanal. Anvendelsen af denne teknik har været tidligere brugt til at skelne 3D transportruter af proteiner og RNA'er gennem NPC, og her, vi viser, at 3D transport af en transmembrane protein, SSTR3 og en cytosole protein, IFT20, kan opnås i TZ af primære cilier. Andre super opløsning teknikker, såsom 3D-STORM, har fået x, y, z stilling for enkelt molekyler ved at placere en cylindrisk linse i den optiske bane, som skaber en asymmetrisk fordrejning af enkelt-molekyle PSF afhængigt af dens position over eller under brændplanet28. Et andet forskud kan forsøge at gennemføre virtuelle pinhole teknologi for at reducere bredden af emission PSF og dermed øge beslutning endnu længere. De ovennævnte teknikker kunne gennemføres på hastighed mikroskopi ganske let. Samlet set giver hastighed mikroskopi en unik tilgang ved samtidigt transport kinetics på enkelt-molekyle niveau og 3D kort over transport veje med super-høj spatiotemporelle opløsning for inter - eller intra-organelle molekylære handel under visse omstændigheder i levende celle systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takke Dr. Kristen Verhey (University of Michigan, Ann Arbor) og Dr. Gregory Pazour (University of Massachusetts Medical School) for at give nogle plasmider. Projektet blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (NIH GM097037, GM116204 og GM122552 til W.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 cm2 tissue culture dish | Corning | VV-01936-00 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10438018 | |
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | |
| OPTIMEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 25300054 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-1PAK | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35GCOL-0-14-C | |
| AlexaFluor 647-conjugated streptavidin | ThermoFisher | S21374 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| 633 nm He-Ne laser | Melles Griot | 25-LHP-928-249 | |
| 561 nm solid state laser | Coherent | OBIS 561-50 LS | |
| 488 nm solid state laser | Coherent | 1185053 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| 1.4-NA 100× oil-immersion apochromatic objective | Olympus | UPLSAPO 100× | |
| On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera | Roper Scientific | Cascade 128+ | |
| Dichroic filter | Semrock | Di01- R405/488/561/635-25x36 | |
| Emission filter | Semrock | NF01-405/488/561/635-25X5.0 | |
| Slidebook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | digital microscopy software |
References
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
- Leung, B. O., Chou, K. C. Review of super-resolution fluorescence microscopy for biology. Appl Spectrosc. 65, 967-980 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Meth. 3, 793-796 (2006).
- Ma, J., Yang, W. Three-dimensional distribution of transient interactions in the nuclear pore complex obtained from single-molecule snapshots. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 7305-7310 (2010).
- Ma, J., Goryaynov, A., Sarma, A., Yang, W. Self-regulated viscous channel in the nuclear pore complex. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7326-7331 (2012).
- Ma, J., et al. High-resolution three-dimensional mapping of mRNA export through the nuclear pore. Nat Comm. 4, (2013).
- Akey, C. W., Radermacher, M. Architecture of the Xenopus nuclear pore complex revealed by three-dimensional cryo-electron microscopy. J Cell Biol. 122, 1-19 (1993).
- Akey, C. W. Interactions and structure of the nuclear pore complex revealed by cryo-electron microscopy. J Cell Biol. 109, 955-970 (1989).
- Czarnecki, P. G., Shah, J. V. The ciliary transition zone: from morphology and molecules to medicine. Trends Cell Biol. 22, 201-210 (2012).
- Elf, J., Li, G. -W., Xie, X. S. Probing transcription factor dynamics at the single-molecule level in a living cell. Science. 316, 1191-1194 (2007).
- Anzalone, A., Annibale, P., Gratton, E. 3D orbital tracking in a modified two-photon microscope: an application to the tracking of intracellular vesicles. J Vis Exp. , (2014).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitscheck, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PloS one. 5, 11639 (2010).
- Marshall, W. F., Nonaka, S. Cilia: tuning in to the cell's antenna. Curr Biol. 16, 604-614 (2006).
- Scholey, J. M., Anderson, K. V. Intraflagellar transport and cilium-based signaling. Cell. 125, 439-442 (2006).
- Yang, T. T., et al. Superresolution pattern recognition reveals the architectural map of the ciliary transition zone. Sci Rep. 5, 14096 (2015).
- Craige, B., et al. CEP290 tethers flagellar transition zone microtubules to the membrane and regulates flagellar protein content. J Cell Biol. 190, 927-940 (2010).
- Kee, H. L., et al. A size-exclusion permeability barrier and nucleoporins characterize a ciliary pore complex that regulates transport into cilia. Nat Cell Biol. 14, 431-437 (2012).
- Najafi, M., Maza, N. A., Calvert, P. D. Steric volume exclusion sets soluble protein concentrations in photoreceptor sensory cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 203-208 (2012).
- Nachury, M. V., Seeley, E. S., Jin, H. Trafficking to the ciliary membrane: how to get across the periciliary diffusion barrier. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 59-87 (2010).
- Ye, F., et al. Single molecule imaging reveals a major role for diffusion in the exploration of ciliary space by signaling receptors. Elife. 2, 00654 (2013).
- Ross, A. J., et al. Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates. Nat Genetics. 37, 1135-1140 (2005).
- Handel, M., et al. Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia. Neuroscience. 89, 909-926 (1999).
- Follit, J. A., Tuft, R. A., Fogarty, K. E., Pazour, G. J. The intraflagellar transport protein IFT20 is associated with the Golgi complex and is required for cilia assembly. Mol Biol Cell. 17, 3781-3792 (2006).
- Awata, J., et al. NPHP4 controls ciliary trafficking of membrane proteins and large soluble proteins at the transition zone. J Cell Sci. 127, 4714-4727 (2014).
- Howarth, M., Ting, A. Y. Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin. Nat Protoc. 3, 534-545 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
