Summary
Недавно мы сопоставлены трехмерной (3D) пространственного расположения транспортных маршрутов для различных белков, translocating внутри первичного реснички в живых клетках. Здесь этот документ детали экспериментальной установки, процесс биологических проб и анализ данных для флуоресценции 3D супер-резолюции, недавно изображений подход применяется в живут первичной ресничек.
Abstract
Основной ресничку на основе микротрубочек выступ на поверхности многих эукариотических клеток и содержит уникальный состав белков функции критически в подвижности клеток и сигнализации. Так как реснички не способны синтезировать свои собственные белки, около 200 уникальных цилиарной белки нужно торговли между в цитозоле и первичных ресничек. Однако, это по-прежнему технический вызов карта трехмерные (3D) расположения транспортных путей для этих белков в живой первичной реснички из-за ограничений в настоящее время существующих методов. Чтобы победить вызов, недавно мы разработали и занятых высокоскоростной виртуальный 3D супер резолюции микроскопии, называют точечные края возбуждения суб дифракции (скорость) микроскопия, чтобы определить 3D пространственное расположение транспортных путей для Оба цитозольной и мембранных белков в первичной реснички живых клеток. В этой статье мы покажем подробные настройки скорости микроскопии, подготовка клеток, выражая флуоресцировани обозначенного белка цилиарной белки, слежение в реальном времени одной молекулы индивидуальных белков в живой ресничку и достижения из 3D пространственных вероятностных карт плотности транспортных маршрутов для ресничный белков.
Introduction
Так как заявил Эрнст Аббе в 1873 году, резолюции обычных световой микроскопии было считается ограничивается примерно 200 Нм вследствие дифракции света от объективного1,2. В настоящее время методы световой микроскопии суперразрешением нарушать это ограничение и разрешить захват динамических изображений с разрешением суб дифракции (< 200 Нм). Методы, как правило, делятся на две широкие категории: стимулировали выбросов истощения (интереса) микроскопии основанные подходы, которые генерируют объем освещения суб дифракции вследствие нелинейных оптических ответ флуорофоров в образцы3; и photoactivated световой микроскопии (PALM) и стохастические оптических реконструкции микроскопии (шторм)-на основе суперразрешением методы, которые используют математические функции для локализации центроиды флуорофоров и затем восстановить эти центроиды сформировать суперразрешением изображения4,5. В настоящее время благодаря сравнительно несложной оптические установки, PALM шторм широко используются и активируя только небольшое подмножество флуорофоров в каждом фрейме долго видео биологической подготовки. Это позволяет для более точной локализации по 2D Гаусса фитинга флуоресцентные пятна, называется точка распространения функция (ФСФ), дневно меченых белков в каждом кадре видео. 2D расположение каждого дневно меченых молекул может затем накладывается на одной плоскости изображений для создания изображения суперразрешением биологической подготовки1,2. Хотя эти сингл молекула локализации, супер резолюции подходы к микроскопии конечно революцию, как было выполнено визуализации биологических образцов, есть еще проблемы, которые необходимо преодолеть. Например шторм и PALM могут достигнуть их лучших пространственного разрешения после фиксации биологических образцов и таким образом представлять статическое представление дневно меченых белков, который является аналогичные ограничения электронной микроскопии. Кроме того для достижения высокого пространственного разрешения для каждого белка-дневно обозначенных в живых клеток, образцы должны быть imaged на очень длинные частоты кадров, которые не в состоянии захватить динамики белков. Таким образом это необходимо для преодоления этих основных технических препятствий.
Чтобы получить высокое разрешение пространственно-временных, которая хорошо подходит для обнаружения быстро движущихся белков и РНК в живых клеток, мы разработали супер-резолюции скорость микроскопии в нашей лаборатории (рис. 1)6,7, 8. несколько крупных технических достижений в микроскопии скорость ранее позволили нам успешно отслеживать nucleocytoplasmic перевозок малых молекул, белки, мРНК и вирус через родной ядерной поры комплексы (НПС)6, 7 , 8. кратко, следующие особенности микроскопии скорость будет использоваться для отслеживания быстро движущихся макромолекул через суб микрометра осесимметричной структуры в живых клеток, таких как NPC и первичных реснички: (1) наклонной или вертикальная подсветка ПСФ позволяет возбуждения молекул одного внутри небольшой дифракционный предел тома в фокальной плоскости (рис. 1); (2) склонны ПСФ можно значительно избежать вне фокуса флуоресценции и таким образом улучшить соотношение сигнал шум. (3) оптическая плотность 100-500 кВт /2 см в ПСФ освещения позволяет тысячи фотоны должны быть собраны из одного флуорофоров с быстрого обнаружения скорости (> 500 Гц). (4) быстрого обнаружения скорость также значительно уменьшает сингл молекула пространственной локализации ошибки (< 10 Нм) при определении пространственных траекторий перемещения флуоресцентных молекул в живых клеток, потому что молекулярной диффузии является одним из основных факторов причиной несовершенства одной молекулы локализации для движущихся молекул. (5) налаженные 2D к 3D алгоритмы преобразования позволяют нам предоставлять 3D пространственных вероятностных карт плотности транспортных маршрутов для молекул в NPC или первичной ресничку. Примечательно, что наш процесс преобразования между декартовой и цилиндрических координации системы используется для создания 3D пространственной плотности вероятности карта, вместо того, чтобы 3D сингл молекула отслеживания (рис. 2). Ранее электронной микроскопии данные показали, что ВСНП9,10 и основной ресничку11 имеют осесимметричной структуры. В принципе случайно диффундирующих молекул, движущихся через NPC или первичной ресничку должны также иметь осесимметричной дистрибутивов. Как показано на рисунке 2, большое количество случайно диффундирующих молекул внутри цилиндра будет генерировать осесимметричной дистрибутивов на вид поперечного сечения, что в NPC, далее привело примерно единообразной пространственной распределение в рамках каждого очень маленькие субрегиона между двумя соседними кольцами (2 рисунокE). Это равномерное распределение приводит, что пространственное распределение измерении θ в цилиндрической системе является постоянным. Затем можно упростить 3D координаты (X, R, θ) быть 2D координат (R, X, константа). На самом деле наш процесс преобразования между декартовой и цилиндрических системами является от 2D (X, Y) 2D (R, X, константа). Постоянное θ, относится к пространственной плотности p в рисунке 2E, рассчитывается с помощью уравнения A
.
В конечном счете сингл молекула отслеживания имеет широкое применение в биологических исследований, таким образом, вполне естественно, что множество методов будут разрабатываться для заполнения конкретных биологических нишах12,,1314. Так обстоит дело с скорость микроскопии. Ранее при сочетании с 3D преобразования алгоритма, этот метод был разработан для устранения 3D транспортных маршрутов транзитных молекул через НПК, суб-diffraction-размера и вращательно-симметричных биологической структуры6. В этом документе первичный ресничек показано отличную модель органеллы также. Основная ресничек, цилиндрические, антенна как органеллы (~ 125 Нм радиус), которые проектируют от поверхности наиболее mammalian клетки15,16,17. Они отвечают за получение внешних сигналов и препровождающее внутриклеточные реакции, обычно связанных с ростом и метаболизм,1516. Таким образом, поток структурных белков, утилизация трансмембранные рецепторы и передаче внутриклеточных посланников жизненно важные обязанности основного ресничек. На стыке между первичной ресничек и клетки тела является критической избирательности барьер, называется переходной зоне или TZ, через который все это транспортного белка должно произойти,11,18,19 20. Подуманы, что помимо стробирования функции TZ, по крайней мере два транспортных процессов, intraflagellar транспорт и пассивной диффузии, отвечает за движение белка через этот регион16,21, 22. с точки зрения здоровья человека, потеря первичных ресничек и последующего дерегулирования течению сигнализации характерно многих раковых заболеваний. Кроме того многие генетических заболеваний, как Синдром Барде-Бидля и поликистозный болезни почек, связаны с дефектных белков транспорт23. Ограничение на размер суб дифракции и сложный процесс селективного белка транспорта через TZ сделать основной реснички главной мишенью для этой техники. В этом документе методы, мы продемонстрируем отслеживания цилиарной трансмембранным белком рецепторов соматостатина 3 (SSTR3)24, внешне помечены Alexa Fluor 647 и компонент IFT, IFT2025, помечены с молекулой плавленого GFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. низ 3T3 подготовка клетки для микроскопии скорость со склада
- 1,5 недели до начала эксперимента, восстановить свежие культуры клеток низ 3T3 из замороженных запас оттаивания при 37 ° C и передачи клетки до 25 см2 клетки культуры колба с 3 мл Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) дополнены 110 мг/мл пируват натрия, глютамин 2 мм, плода бычьим сывороточным 10% и 1% пенициллина/стрептомицина.
- Инкубируйте клетки при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора.
- Разбиение ячеек на 80% confluency, о каждые два дня, по крайней мере три раза до экспериментальных день для обеспечения однородности клеточного цикла. Trypsinize клетки с трипсин 0.25% для 2 минут при 37 ° C, аспирационная трипсина и заменить его с 2 мл среды. Пипетка средне неоднократно разбить ячейку кластеры, удалите нужное количество клеток и довести общий объем средств массовой информации обратно до 3 мл.
Примечание: Низ 3T3 были ранее генетически выразить СПОЗ-4, белок, локализует TZ26, сливается в отеле terminus C к mCherry. mCherry является Флюорофор, который может быть возбужден с 561 Нм освещение количественно локализовать TZ избирательности барьер и ориентировать первичного ресничек. - За два дня до эксперимента, плита клетки в 35 мм стекла дно блюдо на 60-70% confluency с 1,5 мл же среднего шага 1.1 и возвращение клетки в инкубаторе.
- Один день до эксперимента, химически transfect клетки с желаемой плазмиды. Смешать 500-1000 нг желаемого плазмида (см. Примечание ниже) в соотношении подаются с трансфекции реагента в 0,25 мл сокращение сыворотке СМИ без антибиотиков для 30 min. аспирата СМИ от 35 мм стекла блюдо дно и заменить его с плазмида 0,25 мл / Трансфекция реагент микс плюс дополнительные 1,25 мл сокращение сыворотке СМИ без антибиотиков. Сокращение сыворотке СМИ служит цели содействия успешной трансфекции, вызывая рост первичной ресничек, а также поддерживая клетки достаточно долго для выполнения эксперимента. Возвращение клетки в инкубатор для эксперимента на следующий день.
Примечание: При выполнении одной молекулы отслеживания IFT20, плазмиды, содержащий генетически модифицированные IFT20 сливается в его C terminus в GFP-используется25. При выполнении одной молекулы отслеживание SSTR3, плазмиды, содержащие генетически модифицированные SSTR3 сливается в его N terminus в акцепторной пептида (AP) домен и C расположен в GFP используется22. В дополнение к SSTR3 конструкции плазмиды, содержащие биотин лигаза Бира должны выражаться совместно и трансфекции СМИ должны быть дополнены с 10 мкм биотин. Бира затем придает биотина AP домена недавно синтезированных молекул AP-SSTR3-GFP на уровне ER. Alexa647, конъюгированных с тремя из четырех биотин привязки сайтов стрептавидина, в среднем, затем может быть дополнен в СМИ до визуализации дневно метку AP-SSTR3-GFP молекул на внешней поверхности клетки22,27 . В этом методе; используются GFP и AlexaFluor647 Однако другие флуоресцентных зондов может использоваться, если они имеют аналогично высокой фото стабильность и квантовый выход. - Если с помощью внешне меченых SSTR3 конструкции, удалить СМИ от стекла дно блюдо 1 h до эксперимента, мыть ячейки 5 раз с 1 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS) и добавить 1 мл сокращение сыворотке СМИ дополнена 1 мкм проспряганное Alexa647 стрептавидина.
- Не более чем за 15 мин до эксперимента, извлеките из стекла блюдо дно и мыть transfected и помечены клетки 5 раз с 1 мл раствора PBS.
- Место 1 мл буфера изображений (20 мм HEPES, 110 мм KOAc, 5 мм NaOAc, 2 мм MgOAc, 1 мм EGTA, рН 7.3) в блюдо дно стекла.
Примечание: В буфере визуализации, клетки являются жизнеспособным, не более чем 3 h. Таким образом только в 2 h экспериментов выполняются на каждое блюдо.
2. скорость микроскопия
Примечание: Скорость микроскопии установки включает Перевернутый флуоресценции микроскоп с 1.4-NA 100 × нефти погружения apochromatic цели, 35 МВт 633 нм He-Ne лазера, 50 МВт 488 нм и 561 Нм Лазеры твердого, получить на чипе умножения заряд сочетании устройство камеры и Микроскоп пакет программного обеспечения для сбора данных и обработки (рис. 1). Для визуализации отдельных каналов, GFP, mCherry и Alexa647 в восторге от 488 нм, 561 Нм, или 633 нм лазеры, соответственно. Для отслеживания одной молекулы, централизованное освещение используется для отслеживания отдельных дневно меченых молекул. Для эпифлуоресцентного изображений, вогнутая линза помещается в лазер освещения пути расширить луча в однородном поле освещения. Собранные ту же цель, отфильтрованные по Дихроичный фильтр (405/488/561/635) и фильтр выбросов (405/488/561/635) и образы с выше ПЗС-камеры, работающие на 500 для отслеживания одной молекулы или 2 Гц для флуоресценции выбросы эпифлуоресцентного изображений.
- Прикрепите днище стекла на этап микроскопа и найдите ячейку, которая надлежащим образом выражая требуемой конструкции. Найдя подходящий ячейки, выравнивание место NPHP4-mCherry на базе первичной реснички с расположением на плоскости изображения, соответствующий лазерный единой точки освещения.
- Захватить изображение эпифлуоресцентного NPHP4-mCherry и IFT20-GFP или AP-SSTR3-GFP, используя функцию «Snap» на вкладке «Камеры» окна «Фокус элементов управления» при использовании пакета программного обеспечения цифровой микроскопии (см. Таблицу материалы).
Примечание: Эти изображения будут выступать в качестве ссылки для последующих одной молекулы мест. - После получения исходных образов локально снижают концентрацию метками одной молекулы. Фото отбеливатель TZ с 1 МВт лазерной подсветки для 20 s или до тех пор, пока интенсивность флуоресценции близка фон флуоресценции.
Примечание: Когда точные концентрации можно управлять, 0,1-1 Нм, помечены одной молекулы используются. - Подготовить для отслеживания одной молекулы, уменьшите мощность лазера освещение ~0.15 МВт для одной молекулы, помечены GFP или ~0.5 МВт для молекул, помечены Alexa647.
- Как только мощность лазера и визуализации параметров набора, максимальный выигрыш и интенсификации и частота кадров 2 мс, для одной молекулы изображений, привлекать соответствующие освещения лазер и записывать не photobleached, обозначенный одной молекулы, как они транспортируются через регион photobleached TZ, нажав кнопку «Поток» в закладке «Камеры» окна «Фокус элементов управления».
Примечание: Не более 2 мин видео должно быть захвачен свести к минимуму последствия цилиарной дрейф до незначительного уровня. - После захвата видео одной молекулы, обработки видео с помощью 2D Гаусса фитинга алгоритм, например, проблеск лабораторией Gelles, который точно локализуется центроид возбуждения PSF в области, охватывающей каждого одной молекулы интерес (АОИ).
- Выберите все одной молекулы местоположения с точностью < 10 Нм и исправить центр ресничек, основанных на распределении мест одной молекулы с 2D функции Гаусса.
Примечание: С помощью 2D к 3D преобразования алгоритма, 3D транспортных маршрутов IFT20-GFP и AP-SSTR3 маршрутов четко указаны на цилиарных axonemal или цилиарной мембраны, соответственно.
3. 2D в 3D преобразования
- После того, как собраны несколько тысяч локализации для транзита молекул (сигнал/шум соотношение > 11) в ресничку, выберите длинной оси ресничку как X-измерение. Сделать Y гистограммы измерение мест и получить суммы Бен 10 нм с шагом.
Примечание: 2D в 3D преобразования может оцениваться вручную или любого программного обеспечения или языка программирования. Авторы успешно осуществили преобразование как Matlab, так и Python 2.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот раздел показывает данные, полученные от выполнения микроскопии скорость на TZ первичных ресничек для изучения транспортного маршрута SSTR3 соединены ~ 15 Нм внешних компоновщику Alexa647 (рисA). Он служит двойной цели проверки алгоритма 3D преобразования. Alexa647 следует только ярлык внешней поверхности первичной ресничку и, следовательно, 3D транспортный маршрут должен выявить высокой плотности транспортного маршрута в этом месте. НИЗ 3T3 стабильно выражения NPHP3-mCherry на TZ должны быть transfected с AP-SSTR3-GFP и инкубировали согласно выше протокол с стрептавидина конъюгированных Alexa647. Широкое поле изображения mCherry метки используется для локализации TZ пока GFP используется для того, что ячейка выразил желаемого SSTR3 конструкции. Кроме того широкое поле изображения метки Alexa647, используя 633 нм освещение необходимо подтвердить, что ячейка должным образом выразил плазмида Бира и вобрала в себя достаточно биотина от средств массовой информации. Положительное подтверждение характеризуется видимый ресничку, отличается от фона флуоресцирования (рис. 3B). Эффективное маркировки AP-SSTR3-GFP конструкции с стрептавидина конъюгированных Alexa647 может произойти только при этих условиях. Получив положительные подтверждения селективного маркировки первичного ресничку, Alexa647, Фотообесцвечивание и одной точки освещения TZ с 633 нм лазер позволит одной молекулы для отображения. Перед анализом данных наложения видео одной молекулы на освещение широкое поле является полезным проверки шаг (рис. 3C). Например если лазер не выровнен, без одной молекулы будет отображаться для локализации совместно с TZ. Еще один шаг проверки анализ предварительных данных для обеспечения надлежащего соотношения сигнал шум является проверка интенсивности на TZ по длине одной молекулы видео (рис. 3E). Такой анализ может выполняться быстро в ImageJ, используя функцию «участок профиля оси z». Пики в рисунке 3F соответствуют появление одной молекулы на TZ с сигнал шум ~ 5.0. Этот график также способен обеспечить возникновение достаточно Фотообесцвечивание как подтверждается хорошо разделенных частота одной молекулы. Рисунок 3 G демонстрирует низкое соотношение сигнал шум < 0.5. Одно из объяснений бы, что лазер не выровнен непосредственно на TZ. Другой причиной может быть, что мощность лазера освещение является слишком низким. Обе объяснения привести к низким возбуждения и, таким образом, низкая эмиссия флуорофоров на TZ. После этих проверок были сделаны, 2D Гаусса установку одной молекулы будет производить их траекторий в TZ (рис. 3H). Наложения множество траекторий будет производить транспортный маршрут помечены протеина интереса в TZ (рис. 3я). Так как 2D Гаусса фитинга соответствует значений пикселов на детектор, x, y одной молекулы данных могут быть объединены с изображением широкое поле TZ и первичный реснички далее проиллюстрировать протеин интереса в локализации (рис. 3J ).
IFT20 — это компонент IFT комплекс, который несет груз вдоль микротрубочек внутри первичного реснички25. Arl13b-mCherry, широко используется маркер цилиарной белок был используется для обозначения основной реснички19. Поля epi флуоресцентной микроскопии используется для изображения первичной ресничку, выражая Arl13b-mCherry и IFT20-GFP и затем переключился на скорость микроскопии для отслеживания индивидуальных белков IFT20-GFP в первичной реснички после pre Фотообесцвечивание GFP флуоресценции вплоть до уровня одной молекулы в области освещения скорость микроскопии (рис. 4A-4 C).
В конце концов можно получить сотни сингл молекула IFT20-GFP местоположения с точностью систематическое локализации < 16 Нм от первичного ресничку живых клеток (рис. 4D). Согласно нашей моделирование, 250 одной молекулы местах с радиусом 95 Нм было достаточно для создания надежной 3D транспортного маршрута (рис. 5). Окончательное определение IFT20-GFP транспортного маршрута на основе тысяч точек одной молекулы IFT20-GFP, собранных из десяти реснички (Рисунок 4E). Поскольку основной реснички обладают структурой с вращательной симметрией, 2D в 3D преобразования алгоритм был применен к 2D прогнозируемых данных. Интересно, что карты 3D пространственной плотности вероятности IFT20 указывается, что только один регион высокой плотности с шириной ~ 60-Нм достиг ~ 95 Нм вдоль радиуса первичных реснички (Рисунок 4E). Region высокой плотности, вероятно, локализует совместно с axonemal микротрубочки, по согласованию с известного местоположения IFT маршрута (Рисунок 4F).
Рисунок 1 . Упрощенная схема скорость микроскопии. (Путь 1) вертикальной или наклонной (путь 2) точка распространения функция используется для освещения одного Флюорофор молекул в фокальной плоскости. «d» означает расстояние между вертикальной освещения лазерный луч, который проходит через центр цели и углом освещения, которая достигается путем сосредоточения внимания лазерной подсветки на краю цели. Два или более лазеры, регулируется оптический вертолет, чтобы иметь режим включения выключения возбуждения используются для отслеживания одной молекулы, транзитом через NPC или первичной ресничку. Нерабочее время по крайней мере в десять раз дольше, чем Фотообесцвечивание Флюорофор метки на целевых молекул. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Графический демонстрация 2D к 3D-преобразования процесса. Схемы демонстрируют 2D в 3D преобразования алгоритма для молекул, например, если они диффузного в пределах Центральной люмен (A-F) или периферийной области (G-L) трубки. (A) идеальный 3D пространственного расположения случайно диффундирующих молекул внутри трубки могут координироваться в цилиндрических координации системы (R, θ, X). В скорости только карты 3D плотности в конечном итоге рассчитывается из 2D пространственного расположения. Однако это идеализированные случай чтобы проиллюстрировать, что карта 3D плотность эквивалентно ли известны 2D или 3D пространственного расположения. (B 3D молекулярные места в являются проецируется на двухмерную плоскость в декартовой координации системы (X, Y, Z) по микроскопии изображений. (C) очень тонкий ломтик (Δx), вырезанные из цилиндра в A вдоль x измерение. (D 3D пространственных мест в фрагменте показано в C может быть спроецировано в пределах узкой 2D области. (E) сечение мнение всех мест в тонкий ломтик, показано в C. Эти места могут быть сгруппированы в субрегионах между концентрических колец. Учитывая высокий номер случайно распределенными молекул в цилиндр и вырезать очень тонкий ломтик, пространственная плотность расположения (pя) в каждом субрегионе (Si) между двумя соседними кольцами будет вращательно симметрично и единообразной. Эти места могут быть далее проецироваться в 1D в измерении Y. Если места вдоль Y измерения группируются в гистограмму с j столбцы. Общее количество мест в каждом столбце (Aj) равен 
, которые могут быть экспериментально измерены, как показано на (F). (G-L) Подобно как выше, процесс трансформации представлен для распространения в пределах периферийной области трубки молекул. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . 3D пространственное расположение транспортного маршрута для SSTR3 на живой первичной ресничек, сопоставленное скорость микроскопии. (A) графическое представление скорости микроскопии применяются для отслеживания GFP-тегами SSTR3 через TZ, отмеченные NPHP4-mCherry. (B) эпифлуоресцентного образ NPHP4-mCherry (красный), ап-SSTR3-GFP (зеленый), Alexa647, используется для обозначения внешне AP-SSTR3-GFP (белый) и окончательный объединенное изображение. Линейки: 2 мкм. (C) отслеживания один Alexa 647-меченых AP-SSTR3-GFP (белый), проходящей через точки освещения поля для четырех кадров (2 мс/кадр). Линейки: 2 мкм. (D) одной молекулы траектории (белые) (c) накладывается на изображение эпифлуоресцентного NPHP4-mCherry (красный) и AP-SSTR3-GFP (зеленый). Линейки: 2 мкм. (E) белый барашек квадратных моменты по центру области единой точки освещения на TZ. Линейки: 2 мкм. (F) Фотон игр против кадр число граф для видео с высоким соотношение сигнал-шум определяется путем деления максимум флюоресценции одной молекулы, деленное на фоне флуоресценции одной молекулы. (G) Фотон игр против кадр число граф для одной молекулы видео с низким соотношение сигнал-шум. (H) траектории от (E) и (D) локализован в каждом кадре 2D Гаусса фитинга и накладывается на точное графическое представление TZ, также локализованы, 2D Гаусса фитинга. Процесс 2D Гаусса фитинга вписывается функцию Гаусса для X и Y размеры профиля интенсивности области интереса (АОИ), охватывающих одну молекулу PSF.(I) 2D суперразрешением пространственного распределения 220 отдельных Alexa Fluor 647-меченых AP-SSTR3-GFP местах собраны из одного основного ресничку. (J) суперразрешением одной молекулы места от (I) накладывается на изображение эпифлуоресцентного NPHP4-mCherry (красный) и AP-SSTR3-GFP (зеленый). Линейки: 2 мкм. (K) на 2D в 3D преобразования алгоритма, пространственной плотности вероятности распределения Alexa Fluor 647-меченых AP-SSTR3-GFP на первичной реснички в измерении R был получен. На основе Гауссова функция, арматура, Alexa Fluor 647-меченых AP-SSTR3-GFP преимущественно расположен на цилиарных мембраны в радиусе 131±3 нм с полной шириной на половину максимального (FWHM) 24±1 Нм. (L) сечение вид пространственной плотности вероятности распределения (зеленый облако) Alexa Fluor 647-меченых AP-SSTR3-GFP на первичной ресничек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . 3D пространственное расположение транспортного маршрута для IFT20 внутри живой первичной ресничек, сопоставленное скорость микроскопии. (A-C) Представитель изображение Arl13b-mCherry (A) и IFT20-GFP (B) совместно выразили в камеру NIH3T3 и слияния (C). Круг (голубой) указывает, что местоположение одноточечной освещение скорость микроскопии на первичной ресничку вырос на стороне ячейки (белый пунктирные линии), края которой определяются IFT20-GFP флуоресценции в клетки тела и яркие области освещения (не показано). Линейки: 10 мкм. (D) 2D суперразрешением пространственного распределения 286 отдельных мест IFT20-GFP, собранных из одного основного ресничку. (E) от 2D к 3D преобразования алгоритма получается пространственной плотности вероятности распределения IFT20-GFP внутри первичного реснички в измерении R. Основываясь на Гауссова функция установки, IFT20-GFP прежде всего найти в радиусе 95±1 нм с полной шириной на половину максимального (FWHM) 56±5 Нм. (F) сечение вид пространственной плотности вероятности распределения (зеленые облака) IFT20-ГФП в первичной реснички, обложил с схема в баре H. масштаба: 100 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . Моделирование использовалась для оценки минимальное количество 2D сингл молекула мест для создания надежной 3D пространственной плотности вероятности карты для 2D в 3D преобразования алгоритмов. (A) 100 вычислительно генерируемые сингл молекула местах случайно выборки из радиальная плотность нормального распределения, центрированного 95 Нм (соответствующий основной транспортный маршрут IFT20 определяется в наших экспериментах). Точность локализации 16 Нм имитации для каждого местоположения сингл молекула выборки из нормального распределения с σ = 16 Нм. Как показано на рис. 2C, очень тонкий ломтик (Δx) в измерении X используется для преобразования алгоритмов и поэтому X измерение не отображается в местах вычислительно генерируемые 2D одной молекулы. (B) преобразования между Y-мерных данных проекта и 3D R-мерного плотность генерировать гистограммы R-мерного плотностей 3D для пяти различных моделируемых наборов данных (каждая с 100 очков). Число выше является пик положение ± установку ошибка. (C-D) Результаты моделирования, основанные на 250 мест одной молекулы. (E-F) Результаты моделирования, основанные на 500 мест одной молекулы. (G-I) Средняя 3D плотность гистограммы от 100, 250 и 500-очки моделирования соответственно. Погрешностей представляют изменчивости в бин высоты гистограммы, а выше пик-пик средняя позиция ± стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает применение микроскопии скорость основного ресничку, клеточных сигналов органеллы, который очень зависит от эффективного белков транспорт. СКОРОСТЬ микроскопии может обеспечить высокого разрешения (< 10 Нм) мест для дневно меченых молекул, как они проходят через одну точку освещения, сосредоточены на TZ. Ранее он был применен для изучения белков, торговля через NPC6,,78. Однако он может быть продлен для изучения торговли через любой сотовой полости суб дифракции. Этот метод имеет преимущество над другими с высоким разрешением методы визуализации, в том, что он способен захватить динамику одного белка транспорта в живой клетки систем с пространственным и временным разрешением < 10 Нм и < 2 мс, соответственно. Другое преимущество заключается в том, что надо только дневно лейбл протеин интереса и выразить конструкции через трансфекции, общий подход молекулярной биологии для изучения белков локализации, чтобы начать выполнение скорость микроскопии. Надо иметь в виду, что единой точки освещения с высокой мощности лазера является функция, которая обеспечивает хорошо разделенных, высокое разрешение одной молекулы местах. Однако это также ограничивает области освещения и делает этот метод не подходит для локализации широкое поле. К счастью есть много методов супер резолюции широкое поле для следователей, чтобы выбрать из, по желанию. Еще один момент, чтобы рассмотреть является, что скорость микроскопии только захватывает мест перемещения одной молекулы. Таким образом сочетание с FRAP, который можно определить долю всего молекул, которые являются мобильными, могут быть полезным дополнением к анализу.
Процесс преобразования между декартовой и цилиндрических координации системы является создание виртуальных 3D плотности вероятности карты вместо того, чтобы представление 3D на основе 3D отслеживания одной молекулы. В деталях электронной микроскопии данные показали, что основная реснички имеют осесимметричной структуры, которая может генерировать единой молекулы распределение вдоль некоторых радиус. Это равномерное распределение приводит, что пространственное распределение измерении θ в цилиндрической системе является постоянным. Затем можно упростить 3D координаты (X, R, θ) быть 2D координат (R, X, константа). На самом деле наш процесс преобразования между декартовой и цилиндрических системами является от 2D (X, Y) 2D (R, X, константа). Постоянное θ, относится к пространственной плотности p, рассчитывается с помощью уравнения A
(рис. 2). Использовать калькулятор матрицы для расчета вектор 
, который соответствует относительной области между соседними концентрических колец в сечение мнение6,7Aj s общее взаимодействие сайтов на позицию j измеряется непосредственно из экспериментов; Таким образом, pя, пространственной плотности вероятности взаимодействия сайтов в r,я, может быть рассчитана путем решения уравнения матрицы A.
Важнейшим шагом в протоколе является для сведения к минимуму любого возмущения микроскопии установки между ссылкой изображения приобретение и одной молекулы видео. Если любое движение происходит, это не позволяет уверенно Карта расположения одной молекулы Ультраструктура первичной ресничек, что был получен через эпифлуоресцентного изображений. Еще одним важным шагом является photobleach площадь освещения достаточно локально снизить концентрацию дневно обозначенные одной молекулы, но не так много, что население является полностью photobleached. В случае SSTR3, коэффициент диффузии является медленным по сравнению с растворимых молекул и движение населения ООН photobleached SSTR3 молекул обратно в photobleached область будет больше чем две минуты, время, за пределами которого является цилиарной дрейф не ничтожно малый коэффициент. Если трудно достичь надлежащего уровня Фотообесцвечивание, и до сих пор присутствует высокий уровень фона флуоресценции, под углом освещения лазер может использоваться для уменьшения количества дневно обозначенные одной молекулы, которые рады выше и ниже визуализации плоскости. Это уменьшит фон и улучшить соотношение сигнал шум для каждого захваченного одной молекулы.
В целом микроскопия скорость может легко осуществляться на обычных микроскопии установок путем добавления лазерного источника освещения, связанные зеркала и высокоскоростной CCD камеры. Основные улучшения за другие подобные методы являются наклонные лазер, который значительно снижает фон флуоресценции и алгоритм преобразования 2D в 3D, который реконструирует 3D пространственной плотности вероятности карта из 2D сингл молекула места. С биологической точки зрения не требуется никакой дополнительной маркировки помимо конъюгированных Флюорофор протеин интереса. Эти функции позволяют скорость микроскопии для отслеживания одной молекулы с высоким пространственно-временных (5-10 Нм, 0,4-2 мс) резолюции как они трафик через суб микрометра био полости или био канал с вращательно-симметричных структур. В сочетании с 3D плотности вероятности алгоритм преобразования, 3D транспортных маршрутов тегами белков может быть определен через полость или канал. Применение этой методики ранее не использовался для различения 3D транспортных маршрутов белков и РНК через NPC, и здесь, мы покажем, что 3D транспорт трансмембранным белком, SSTR3 и цитозольной белок, IFT20, может быть достигнуто в TZ из Основная ресничек. Получили другие супер резолюции методы, такие как 3D-шторм, x, y, z позиции для одной молекулы, поместив Цилиндрические линзы оптического пути, который создает асимметричный искажения сингл молекула PSF в зависимости от своей позиции выше или ниже в фокальной плоскости28. Еще один аванс может попытаться реализовать технологию виртуальных обскуры уменьшить ширину выбросов PSF и таким образом увеличить резолюции еще больше. Вышеуказанные методы могут быть осуществлены на скорость микроскопии довольно легко. В целом скорость микроскопии обеспечивает уникальный подход, одновременно решая транспорта кинетики в сингл молекула уровня и 3D карта транспортных путей с супер-высокое пространственно-временных резолюции органелл или внутри молекулярная торговли при определенных обстоятельствах в системах живой клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим д-р Кристен верхей (Мичиганского университета, Анн-Арбор) и д-р Грегори Pazour (Университет штата Массачусетс Медицинская школа) за предоставление некоторые плазмиды. Проект был поддержан грантов от национальных институтов здравоохранения (низ GM097037, GM116204 и GM122552 к W.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 cm2 tissue culture dish | Corning | VV-01936-00 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10438018 | |
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | |
| OPTIMEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 25300054 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-1PAK | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35GCOL-0-14-C | |
| AlexaFluor 647-conjugated streptavidin | ThermoFisher | S21374 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| 633 nm He-Ne laser | Melles Griot | 25-LHP-928-249 | |
| 561 nm solid state laser | Coherent | OBIS 561-50 LS | |
| 488 nm solid state laser | Coherent | 1185053 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| 1.4-NA 100× oil-immersion apochromatic objective | Olympus | UPLSAPO 100× | |
| On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera | Roper Scientific | Cascade 128+ | |
| Dichroic filter | Semrock | Di01- R405/488/561/635-25x36 | |
| Emission filter | Semrock | NF01-405/488/561/635-25X5.0 | |
| Slidebook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | digital microscopy software |
References
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
- Leung, B. O., Chou, K. C. Review of super-resolution fluorescence microscopy for biology. Appl Spectrosc. 65, 967-980 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Meth. 3, 793-796 (2006).
- Ma, J., Yang, W. Three-dimensional distribution of transient interactions in the nuclear pore complex obtained from single-molecule snapshots. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 7305-7310 (2010).
- Ma, J., Goryaynov, A., Sarma, A., Yang, W. Self-regulated viscous channel in the nuclear pore complex. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7326-7331 (2012).
- Ma, J., et al. High-resolution three-dimensional mapping of mRNA export through the nuclear pore. Nat Comm. 4, (2013).
- Akey, C. W., Radermacher, M. Architecture of the Xenopus nuclear pore complex revealed by three-dimensional cryo-electron microscopy. J Cell Biol. 122, 1-19 (1993).
- Akey, C. W. Interactions and structure of the nuclear pore complex revealed by cryo-electron microscopy. J Cell Biol. 109, 955-970 (1989).
- Czarnecki, P. G., Shah, J. V. The ciliary transition zone: from morphology and molecules to medicine. Trends Cell Biol. 22, 201-210 (2012).
- Elf, J., Li, G. -W., Xie, X. S. Probing transcription factor dynamics at the single-molecule level in a living cell. Science. 316, 1191-1194 (2007).
- Anzalone, A., Annibale, P., Gratton, E. 3D orbital tracking in a modified two-photon microscope: an application to the tracking of intracellular vesicles. J Vis Exp. , (2014).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitscheck, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PloS one. 5, 11639 (2010).
- Marshall, W. F., Nonaka, S. Cilia: tuning in to the cell's antenna. Curr Biol. 16, 604-614 (2006).
- Scholey, J. M., Anderson, K. V. Intraflagellar transport and cilium-based signaling. Cell. 125, 439-442 (2006).
- Yang, T. T., et al. Superresolution pattern recognition reveals the architectural map of the ciliary transition zone. Sci Rep. 5, 14096 (2015).
- Craige, B., et al. CEP290 tethers flagellar transition zone microtubules to the membrane and regulates flagellar protein content. J Cell Biol. 190, 927-940 (2010).
- Kee, H. L., et al. A size-exclusion permeability barrier and nucleoporins characterize a ciliary pore complex that regulates transport into cilia. Nat Cell Biol. 14, 431-437 (2012).
- Najafi, M., Maza, N. A., Calvert, P. D. Steric volume exclusion sets soluble protein concentrations in photoreceptor sensory cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 203-208 (2012).
- Nachury, M. V., Seeley, E. S., Jin, H. Trafficking to the ciliary membrane: how to get across the periciliary diffusion barrier. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 59-87 (2010).
- Ye, F., et al. Single molecule imaging reveals a major role for diffusion in the exploration of ciliary space by signaling receptors. Elife. 2, 00654 (2013).
- Ross, A. J., et al. Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates. Nat Genetics. 37, 1135-1140 (2005).
- Handel, M., et al. Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia. Neuroscience. 89, 909-926 (1999).
- Follit, J. A., Tuft, R. A., Fogarty, K. E., Pazour, G. J. The intraflagellar transport protein IFT20 is associated with the Golgi complex and is required for cilia assembly. Mol Biol Cell. 17, 3781-3792 (2006).
- Awata, J., et al. NPHP4 controls ciliary trafficking of membrane proteins and large soluble proteins at the transition zone. J Cell Sci. 127, 4714-4727 (2014).
- Howarth, M., Ting, A. Y. Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin. Nat Protoc. 3, 534-545 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
