Индукция и микро-КТ мозгового кавернозные мальформации в мышиной модели
Summary
Этот протокол демонстрирует индукции мозгового кавернозных мальформация болезни в мышиной модели и контраст использует расширение Микро Компьютерная томография для измерения поражения бремя. Этот метод увеличивает значение установленных мыши модели для изучения молекулярные основы и потенциальных терапий для церебральной кавернозных мальформация и другие цереброваскулярные заболевания.
Abstract
Мутации в CCM1 (ака KRIT1), CCM2, или CCM3 (ака PDCD10) гена вызывает церебральный кавернозных мальформация (СКК) в организме человека. Модели мыши CCM болезни были созданы тамоксифен индуцированной удаления Ccm генов в послеродовой животных. Эти модели мыши обеспечивают неоценимое расследовать молекулярный механизм и терапевтические подходы для СКК болезни. Точная и количественный метод оценки поражения бремя и прогрессии необходимо использовать полную стоимость этих животных моделей. Здесь мы демонстрируем индукции CCM болезни в мышиной модели и расширить использование контраст рентгеновского Микро Компьютерная томография (микро CT) метод измерения CCM поражения бремени в мозг мыши. На послеродовом день 1 (P1) мы использовали 4-hydroxytamoxifen (4HT) для активации Cre рекомбиназа деятельности от Cdh5-CreErt2 трансген к расщеплять аллеля floxed Ccm2. CCM поражений в мозг мыши были проанализированы на P8. Для микро CT раствор Люголя на основе йода была использована для повышения контраста в ткани мозга. Мы имеем оптимизированы параметры сканирования и использовали voxel измерение 9,5 мкм, которая приведет к минимальным размером около 25 мкм. Эта резолюция является достаточно измерить объем поражения СКК и номер глобально и точно, и обеспечить высокое качество 3-D картирование CCM поражений мозга мыши. Этот метод увеличивает значение установленных мыши модели для изучения потенциальных терапий и молекулярные основы для СКК и другие цереброваскулярные заболевания.
Introduction
CCM тонкими стенками, расширены сосудистые мальформации в мозге с преобладанием до 0,5% в человеческой популяции1. СКК может наследоваться как доминирующей расстройство из-за потери функции мутации в одном из трех генов: CCM1 (ака Krit1), CCM2и CCM3 (также называемый PDCD10)2,3,4 ,5,6. Эти гены присутствуют в одном сигнализации комплекс.
Были разработаны различные модели модель болезней человека СКК и понять течению тропы CCM гены, которые отвечают за CCM7,8,9,10. Самые надежные модели является условно удалять любой из генов СКК с тамоксифен индуцибельной Cdh5-CreERT2 в точке P1 в новорожденных детенышей8,10. Эти щенки развиться поражения СКК в мозг от P6 вперед и, как ожидается, будет идеальная модель для доклинических исследований в поиске механизмов и терапевтических агентов в лечении заболеваний СКК.
CCM поражения бремя в мозг мыши измеряется прежде всего методы, основанные на гистологию, подход, который чрезвычайно много времени и при условии следователь смещения10,,1112. МРТ основе методы были использованы для оценки СКК поражения бремя взрослых мыши модель9,13. Однако высоко специализированных малых животных МРТ инструмента и долгое время проверки нескольких часов в ночь требуется для достижения удовлетворительного решения для выявления поражений СКК. Кроме того не было сообщено ли МРТ может использоваться для обнаружения CCM поражений у новорожденных мышей и резолюции может ограничить чувствительность.
Мы недавно разработали технику микро CT изображения и анализировать CCM поражения14,15. Это с высоким разрешением, время и экономически эффективным методом резко повысило значение модели болезни СКК в механистический и терапевтических исследований. Повышение контрастности, вся гора пятная методы были использованы для микро-КТ мягких тканей и мыши эмбрионов16,17. Ранее мы использовали на основе осмий окрашивания для повышения контраста для микро-КТ CCM поражения мозга14. В этой статье мы использовали менее токсичны, неразрушающего, и экономически эффективных реагентов, йода на основе раствор Люголя в, чтобы увеличить контраст для микро-КТ. Йод может распространять по всему мозгу и имеет высокое сродство для крови18.
Здесь представлены подробный протокол индукции CCM поражений в неонатальной мыши модели наряду с изображений и анализа CCM поражений с контраст основе микро CT. Этот метод на основе микро КТ обеспечивает количественных глобальное измерение объема поражения СКК, точно определяет количество и расположение 3-D CCM поражений головного мозга мыши и значительно снижает стоимость и время, необходимое для фенотип этих животных.
Protocol
Representative Results
Discussion
СКК является общей сосудистая мальформация, которое затрагивает до 0,5% лиц1. СКК может происходить в форме спорадические или семейная. Пациента прогноз часто неясно, как СКК поражений может неожиданно разрыву вызвать инсульт и другие неврологические последствия. В настоящ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают, зал и научной и технической помощи Sydney микроскопия и микроанализ исследовательский фонд (AMMRF) и Австралийский центр по микроскопия и микроанализ АКММ в Университете Сиднея. Эти исследования были поддержаны австралийского национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (NHMRC) проект Грант 161558 и APP1124011 (XZ).
Materials
| 4-hydroxy tamoxifen | Sigma-Aldrich | H6278 | To activate Cdh5-CreErt2 |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | To dilute 4-hydroxy tamoxifen |
| Stereomicroscope | Leica | M205FA | To take macroscopic images |
| Lugol's Iodine solution | Sigma-Aldrich | L6146 | To stain samples for contrast micro-CT |
| Plastic paraffin film | Parafilm | PM992 | To package samples |
| Micro-CT | Xradia | MicroXCT-400 | Micro-CT |
| 3D rendering software | FEI Visualization Science group | Avizo 3D image processing software | To analyse micro-CT scans |
References
- Fischer, A., Zalvide, J., Faurobert, E., Albiges-Rizo, C., Tournier-Lasserve, E. Cerebral cavernous malformations: from CCM genes to endothelial cell homeostasis. Trends Mol Med. 19 (5), 302-308 (2013).
- Liquori, C. L., et al. Mutations in a gene encoding a novel protein containing a phosphotyrosine-binding domain cause type 2 cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 73 (6), 1459-1464 (2003).
- Laberge-le Couteulx, S., et al. Truncating mutations in CCM1, encoding KRIT1, cause hereditary cavernous angiomas. Nat Genet. 23 (2), 189-193 (1999).
- Sahoo, T., et al. Mutations in the gene encoding KRIT1, a Krev-1/rap1a binding protein, cause cerebral cavernous malformations (CCM1). Hum Mol Genet. 8 (12), 2325-2333 (1999).
- Denier, C., et al. Mutations within the MGC4607 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 74 (2), 326-337 (2004).
- Bergametti, F., et al. Mutations within the programmed cell death 10 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 76 (1), 42-51 (2005).
- McDonald, D. A., et al. A novel mouse model of cerebral cavernous malformations based on the two-hit mutation hypothesis recapitulates the human disease. Hum Mol Genet. 20 (2), 211-222 (2011).
- Boulday, G., et al. Developmental timing of CCM2 loss influences cerebral cavernous malformations in mice. J Exp Med. 208 (9), 1835-1847 (2011).
- Chan, A. C., et al. Mutations in 2 distinct genetic pathways result in cerebral cavernous malformations in mice. J Clin Invest. 121 (5), 1871-1881 (2011).
- Zheng, X., et al. Cerebral cavernous malformations arise independent of the heart of glass receptor. Stroke. 45 (5), 1505-1509 (2014).
- McDonald, D. A., et al. Fasudil decreases lesion burden in a murine model of cerebral cavernous malformation disease. Stroke. 43 (2), 571-574 (2012).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Gibson, C. C., et al. Strategy for identifying repurposed drugs for the treatment of cerebral cavernous malformation. Circulation. 131 (3), 289-299 (2015).
- Choi, J. P., et al. Micro-CT Imaging Reveals Mekk3 Heterozygosity Prevents Cerebral Cavernous Malformations in Ccm2-Deficient Mice. PLoS One. 11 (8), 0160833 (2016).
- Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532 (7597), 122-126 (2016).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiol. 9, 11 (2009).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), 61 (2006).
- Anderson, R., Maga, A. M. A Novel Procedure for Rapid Imaging of Adult Mouse Brains with MicroCT Using Iodine-Based Contrast. PLoS One. 10 (11), 0142974 (2015).
- Zheng, X., et al. Dynamic regulation of the cerebral cavernous malformation pathway controls vascular stability and growth. Dev Cell. 23 (2), 342-355 (2012).
