Summary
Synaptic strømme kan registreres focally fra visualiseret synaptic boutons i Drosophila tredje instar larver neuromuskulære junction. Denne teknik gør det muligt for overvågning af aktiviteten af et enkelt synaptic bouton.
Abstract
Drosophila neuromuskulære junction (NMJ) er en fremragende modelsystem til at studere glutamatergic synaptisk transmission. Vi beskriver teknik af focal macropatch optagelser af synaptic strømninger fra visualiseret boutons i Drosophila larve NMJ. Denne teknik kræver tilpassede fabrikation af optager Mikropipetter, samt et sammensat mikroskop udstyret med en høj forstørrelse, langdistance vand fordybelse mål, differential interferens kontrast (DIC) optik og en fluorescerende vedhæftet fil. Optagelse elektrode er placeret på toppen af en markeret synaptic bouton visualiseret med DIC optik, epi-fluorescens eller begge. Fordelen ved denne teknik er, at det giver mulighed for overvågning af synaptic aktivitet af et begrænset antal sider om frigivelse. Optagelse elektroden har en diameter på flere mikron, og frigivelse sites placeret uden for den elektrode rand påvirker ikke væsentligt de indspillede strømninger. De indspillede synaptic strømninger har hurtig kinetik og kan løses let. Disse fordele er især vigtige for studier af mutant flyve linjer med forbedret spontan eller asynkron synaptic aktivitet.
Introduction
Drosophila er en fremragende modelsystem til at studere de molekylære mekanismer kontrollerende synaptisk transmission. Det neuromuskulære system i Drosophila er glutamatergic, og derfor Drosophila neuromuskulære junction (NMJ) kan bruges til at studere de bevarede funktioner i glutamatergic udgivelse. Siden Jan og Jans studie1, er de tredje instar larver bredt plejede at studere evoked og spontane synaptisk transmission af overvågning excitatoriske junction potentialer (EJPs) eller strømme (EJCs). EJPs registreres almindeligt intracellulært med en skarp glas mikro-elektrode, og de afspejler aktiviteten af det hele NMJ, herunder alle boutons at synapser på den givne muskelfiber.
Derimod kan aktivitet af et begrænset antal sider om frigivelse registreres focally ved at placere en mikropipette tip nær neuronal terminaler eller synaptic varicosities. Denne teknik blev oprindeligt ansat af Katz og Miledi2, og fokale ekstracellulære optagelser er blevet med held ansat på flere NMJ præparater, herunder frog3,4,5, mus6 , 7 , 8, krebsdyr9,10,11,12,13,14,15,16og Drosophila17,18,19,20,21,22,23. Denne tilgang blev yderligere udviklet af Dudel, der optimeret macropatch recoding elektroder24,25. I Dudels gennemførelse afstemt denne teknik nøje løs-patch-clamp metode26.
Drosophila larve NMJ har klart defineres synaptisk boutons, og transgene linjer med genetisk kodet neuronal fluorescerende tags (Se Tabel af materialer) er let tilgængelige. Disse fordele gjorde det muligt at optage EJCs og mEJCs fra en valgte synaptic bouton20,21,22. Her beskriver vi denne teknik i detaljer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabrikation af optagelse elektroder
- trække glas elektroder
- Brug følgende protokol for mikroelektrode puller (Se Tabel af materialer):
- linje 1: varme 510 træk - hastighed 30 tid 250; Linje 2: Varme 490 Pull - hastighed 30 tid 250.
NOTE: Tidsenheder svarer til 0,5 ms pr. enhed; de øvrige enheder er relativ. Værdien af varmen bør justeres for hver glødetråd efter rampe test udføres.
- linje 1: varme 510 træk - hastighed 30 tid 250; Linje 2: Varme 490 Pull - hastighed 30 tid 250.
- Bruger et mikroskop (35 x forstørrelse) til at sikre, at den indvendige diameter af den trak elektrode er i rækken af 7-10 µm ( figur 1A). Gemme kapillærerne i tæt lukkede beholdere for at undgå støvopbygning.
- Brug følgende protokol for mikroelektrode puller (Se Tabel af materialer):
- Brand polering
- brand polsk kapillærer (80-90% af maksimal varme værdi for 1-2 s) ved hjælp af en mikro-forge (Se Tabel af materialer). Sikre den endelige indre diameter af poleret elektroden er 5 µm ( figur 1A) 27.
- Bøjning
Bemærk: to bøjninger er lavet for at placere elektrode på toppen af muskel under en høj forstørrelse mål.- Brug af apparatet, vist i figur 1B. Fix elektroden i manipulatoren og Placer spidsen over glødetråden, ikke at røre ved den.
- Sæt varme værdi til 60-70% af maksimalt og tryk på pedalen af mikro-forge for 1-2 s (Se Tabel af materialer) til at varme glødetråden. Bruge en L-formet nål forsigtigt trække ned spidsen af elektrode ( figur 1B udvidet). At bøje på cirka 90 o ( figur 1 c).
- Holde elektrode over flammen af faklen i hånden ved hjælp af pincet og gøre den anden bend i en afstand af 7-10 mm fra den første bøje og i en vinkel på ca 120 o ( figur 1 c).
fig. 1. Sidste skridt mikropipette fabrikation. (A) elektrode tips efter trækker og brand polering. (B.1) setup for tip bøjning. (B.2) den boxed område er vist udvidede til højre. Elektrode og glødetråden er fast så at elektrode tip er placeret lidt over wiren og ikke røre. (C.1) optagelse elektrode. (C.2) den boxed område er vist udvidede til højre. Den første bøje har en vinkel på ca. 90°, og afstanden mellem den første bøje og spidsen af elektroden er ca 1 mm. skalaen bar = 3 mm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
2. ekstra forberedende skridt
- Forbered heamolymph-lignende (HL3) løsning (i mM): 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 trehalose, 115 saccharose, 5 HEPES og 1 mM CaCl 2; pH indstilles til 7,3 - 7.4. opløsningen i køleskab og gøre det friske hver uge.
- Gøre stimulation pipets det samme måde som optagelse glas pipets, medmindre der er ingen grund til at bøje dem.
Bemærk: Forberedelse af stimulation elektroder er beskrevet i detaljer i 28 og 27. Den endelige diameter efter brand polering skal være i intervallet 5-7 µm. - Indsæt en stimulation afpipetteres i en mikroelektrode indehaveren tilsluttet en sprøjte.
- Fremstilling dissektion plader fra små petriskåle (35 x 10 mm) belagt med silikone gummi epoxy (Se Tabel af materialer) som beskrevet i 28.
Bemærk: Silikonegummi skal være helt hærdet før brug. - Vælge en omvandrende tredje-instar larver og dissekere det som beskrevet i 27 , 28 , 29 , 30.
Bemærk: For at visualisere boutons, bruge den flyve stamme CD8-normal god landbrugspraksis (Se Tabel af materialer)- brug af pincet (Se Tabel af materialer), vælge de 3 rd instar larver fra et hætteglas.
- Pin larver, placere den første pin posterior og en anden pin anterior (tæt på munden kroge).
- Tilføje HL3 løsning.
- Gøre et snit ved hjælp af foråret saks (Se Tabel af materialer) hele vejen fra top pin til bunden, en på den dorsale side af larverne.
- Pin larver filet, placere 2 ekstra stifter på venstre og højre side af larverne.
- Fjerne tracheas med pincet og indvolde.
- Skære nerver lige udenfor den ventrale nerve ledningen ved hjælp af foråret saks.
3. Elektriske optagelser af EJCs
figur 2. Optagelse setup. Prøven NMJ fastgjort til silicium belagt petriskål (pil) er placeret over den bevægelige fase af den opretstående sammensat mikroskop udstyret med epifluorescensmikroskop kapaciteter, en høj forstørrelse mål og to micromanipulators. Mikroskop er stationeret på et Vibrationsdæmpende tabel. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Optagelse
- sted petriskål med forberedelse på stadiet mikroskop ( figur 2). Indsæt referenceelektrode i badet.
- Fylde optagelse elektrode med HL3 løsning. Under målet om 10 x (Se Tabel af materialer), nedsænke elektroden ind i badet og Placer det over muskler 6 og 7 i de abdominal segmenter 2, 3 eller 4 ved hjælp af micromanipulator () (Se Tabel af materialer) figur 3 A.1 og A.2).
- Skifte målet til 60 x (Se Tabel af materialer). Fokus på området af interesse ved hjælp af enten epi-fluorescens eller DIC optik. Placer spidsen af elektrode på toppen af synaptic bouton ( figur 3 B.1-3).
- Trykke på elektroden meget forsigtigt på musklen. Overdreven pres kan skade NMJ eller fremkalde en stigning i spontane synaptic aktivitet. Kontroller spidsen af elektroden ikke tilstoppet - hvis det er, erstatte den.
- Tænd forstærkeren, A/D board og computeren.
- Vælg tilstanden spænding klemme på forstærkeren.
- Start erhvervelse software og vælge den ' gap-fri ' tilstand.
- Overholde udseendet af mEJCs på computerskærmen.
- At sikre, at amplituden af mEJCs er inden for rækkevidde af 0,2 - 0,7 nA.
Bemærk: Mindre EJCs indikerer at optagelse elektroden har defekter eller at det ikke er placeret korrekt.
figur 3. Visualisering af synaptic boutons. (A) A brightfield billede af en hemi-segment under 10 x forstørrelse (A.1) og det udvidede boxed område viser muskler 6 og 7 (A.2, pil markerer optagelse elektrode). Skalalinjen = 50 µm. (B) Synaptic boutons er visualiseret i Drosophila linje med en genetisk kodet neuronal markør (CD8-NGL) ved hjælp af epi-fluorescens imaging (B.1) eller DIC optik (B.2). Billeder er taget med 60 x mål og filter kuben for normal god landbrugspraksis imaging (Se Tabel af materialer). Synaptic boutons er markeret med pile, og en overlejring af fluorescerende og DIC billeder er vist i B.3. Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- stimulation
- ved hjælp af en micromanipulator, under en visuel kontrol, placere stimulation elektroden i nærheden axon innerverer abdominal segmenter 2-4.
- Anvend undertryk ved at trække stemplet af sprøjten tilsluttet elektrode indehaveren, således at axon er trukket inde i elektrode ( figur 2).
- Tur på stimulatoren. Drej knappen på enhedens isolation (Se Tabel af materialer) til at sætte en nul strøm, og derefter forsigtigt øge det, indtil EJCs vises (eller indtil tærsklen er nået).
- Udføre stimulation i et suprathreshold regime, med stimulation nuværende steget ca to gange, i forhold til tærsklen for observation af EJCs.
Bemærk: Vores erfaring, sådanne stimulation intensitet er optimal til at undgå aktionspotentialet fiaskoer og aktionspotentialet fyring. For eksempel, hvis EJCs vises på stimulation nuværende af 0.2 mA, bruge en strøm af 0,4 mA hele eksperimentet.
- Forsegle modstand
- måle optagelse macropatch elektrode seal modstand ved at dreje parameteren elektrode modstand af forstærker til " forsegle test " position. Observere, at værdien af seal modstand i GΩ vil blive vist i den " nuværende " vindue.
- Sørg for seal modstand er i rækken af 0,5 - 2 M Ω. Angiver værdier uden for dette område at elektroden er ikke korrekt poleret eller ikke ordentligt anbragt.
- Overvåge seal modstand i hele optagelsen, at sikre det forbliver konstant gennem hele eksperimentet.
4. Analyse
- Analyze optagelser beskæftiger tilpasset software til analyse (Se Tabel of Materials).
Bemærk: Vores lab bruger internt software Quantan 31, som er tilpasset til påvisning af EJCs og mEJCs registreres focally ( figur 4). Denne software indeholder en Gaussisk digital filter og giver mulighed for påvisning af quantal toppe i overlappende multi quantal begivenheder ( figur 4A). Andre metoder er beskrevet i 17.
fig. 4. Quantal analyse. Påvisning af mEJCs (A) og EJCs (B) af Quantan software. Event-området er markeret med grønt, og toppe er markeret med rød pilehoveder. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Focal macropatch optagelser aktiverer synaptic overvågningsaktiviteter fra valgte synaptic boutons (figur 5). Når elektroden er placeret på toppen af en synaptic bouton (figur 5A, site 1), de optagne mEJCs (figur 5 c, site 1) har en amplituder væsentligt overstiger stoejniveauet og skarpe stigende faser (på en sub millisekund range). Hvornår optagelse elektrode er flyttet fra synaptic bouton af flere mikron (figur 5A, websted 2), amplituder af optagne mEJCs tilbagegang næsten til støjniveau (figur 5B, websted 2). De optagne EJCs kan knap nok skelnes fra støjen og de har forlænget stigende faser (figur 5 c, site 2 versus websted 1).
Det begrænsede antal frigivelse sites bidrager til optaget EJCs samt mEJCs og hurtig kinetik af synaptic strømninger registreret focally, giver nøjagtig påvisning af frigivelse begivenheder i mutanter med forhøjet synaptic aktivitet. Dette kan klart illustreret ved optagelser af mEJCs fra complexin null mutant (figur 6A). Spontan aktivitet er drastisk forhøjet i denne mutant32, og derfor mEJPs indspillet intracellulært overlapper hinanden og kan ikke være klart adskilt fra hinanden (figur 6B), mens fokale optagelser22 aktiverer nøjagtig påvisning af spontan udgivelse events (figur 4A).
Figur 5. Optagelser af EJCs og mEJCs fra en valgte bouton. (A) placere elektrode over en valgte bouton (side 1) og flytte den væk fra bouton (side 2). Billederne viser CD8-NGL tagged NMJ visualiseret med epi-fluorescens (A.1), optagelse elektrode over muskelfiber (A.2), og overlays (A.3, A.4), med elektrode placeret over webstedet 1 (A.3) eller () site 2 A.4). skalalinjen = 10 µm. (B) mEJCs optaget fra bouton (side 1) er klart adskilt fra optagelse støj og har hurtig stigende faser. Derimod mEJCs optaget fra webstedet 2 pålideligt kan ikke skelnes fra optagelse støj, deres amplituder reduceres several-fold, og de har en langsommere tidsforløb. (C) The amplituder af EJCs indspillet fra bouton (side 1) overstiger af mange-fold amplituder af EJCs indspillet fra webstedet 2, og de har også hurtigere kinetik. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Focal macropatch versus intracellulære optagelser. Fokale optagelser aktiverer nøjagtig påvisning af mEJCs i complexin null mutant (A), mens intracellulære optagelser (B) fra denne mutant udstille frigive begivenheder, der overlapper hinanden og ikke kan spores pålideligt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila repræsenterer en fordelagtig model organisme at studere synaptisk transmission. Flere optagelse konfigurationer er blevet anvendt på de larver NMJ, herunder intracellulære optagelser af synaptiske potentialer, optagelser af synaptic strømme med to elektrode spænding klemme33,34, og focal macropatch optagelser af synaptic strømninger beskrevet her. Sidstnævnte teknikken tillader en præcis kvantificering af synaptisk transmission på visualiseret boutons.
Den beskrevne protokol succes afhænger kritisk evne klart visualisere område af interesse og tilpasse forberedelse af optagelse elektroder. Således er kvalitet DIC optik, en høj forstørrelse vand fordybelse mål med lange arbejde afstand, og tilpassede udstyr til brand polering og bøjning af optagelse elektroder kritisk vigtigt.
Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at det giver mulighed for overvågning af aktiviteten af et par synapser, der er placeret under optagelse elektrode. Det skal bemærkes, dog boutons placeret i nærheden af kanten af elektroden kan også bidrage til registrerede aktivitet. Det er derfor afgørende, at placeringen af elektroden, samt tætning modstand, ikke ændrer i løbet af eksperimentet.
Evnen til at overvåge aktiviteten af en enkelt bouton kan potentielt kombineret med de seneste billeddannelsesteknologier. For eksempel, optisk registrering af aktivitet på enkelte aktive zoner35 kan kombineres med fokale optagelser af EJCs og mEJC, og dette kunne koble den rumlige opløsning for optisk registrering med tidsmæssige opløsning af elektriske optagelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Støttet af NIH grant R01 MH 099557
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sutter P-97 | Sutter instrument | P-97 | Microelectrode puller |
| Narishige MF-830 | Narishige | MF-830 | Microforge |
| WPI MF200 | WPI | MF200 | Microforge |
| Glass capilaries | WPI | B150-86-10 | Glass capilaries |
| Microtorch 1WG61 | Grainer | 1WG61 | Microtorch |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD 184 | Silicone for dissection plates preparation |
| Dissection pins | Amazon | B00J5PMPJA | Pins for larvae positioning |
| Tweezers | WPIINC | 500342 | Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas. |
| Scissors | WPIINC | 501778 | Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves. |
| Olympus BX61WI | Olympus | BX61WI | Upright microscope |
| Olympus Lumplan FL N 60x | Olympus | UPLFLN 60X | Microscope objective 60X |
| Olympus UPlan FL N 10x | Olympus | Uplanfl N 10X | Microscope objective 10X |
| Narishige Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator |
| npi Electronic GmbH ELC-03XS | npi Electronic GmbH | ELC-03XS | Electrophysiological amplifier |
| A.M.P.I Master 8 | A.M.P.I. | Master 8 | Electrical stimulator |
| A.M.P.I Iso-Flex | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus isolator |
| TMC antivibration table | TMC | 63-9090 | Antivibration table |
| TMC Faraday cage | TMC | 81-333-90 | Faraday cage |
| Digidata 1322A | Axon Instruments | Digidata 1322A | Digidata |
| Computer | Dell | Dell Dimension 5150 | Computer with Win XP OS |
| Electrode holder | WPI | MEH3SW | Electrode holder |
| Optical filter | Omega optical | XF 115-2 | Filter cube for Green Fluorescent Protein (GFP) detection |
| pCLAMP 8 | Axon Instruments | 8.0.0.81 | Software for signal recording |
| Quantan | In-house software | - | Software for signal processing |
| Canton-S (Wildtype) | Bloomington Stock Center | 64349 | Control fly line |
| cpx SH1 | Generous Gift of J.T. Littleton | - | Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis |
| CD8-GFP | Bloomington Stock Center | 5137 | Fly line with neuronal fluorescent (GFP) Tag |
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol. 262 (1), 189-214 (1976).
- Katz, B., Miledi, R. The effect of temperature on the synaptic delay at the neuromuscular junction. J Physiol. 181 (3), 656-670 (1965).
- Macleod, G. T., Gan, J., Bennett, M. R. Vesicle-associated proteins and quantal release at single active zones of amphibian (Bufo marinus) motor-nerve terminals. J Neurophysiol. 82 (3), 1133-1146 (1999).
- Macleod, G. T., Farnell, L., Gibson, W. G., Bennett, M. R. Quantal secretion and nerve-terminal cable properties at neuromuscular junctions in an amphibian (Bufo marinus). J Neurophysiol. 81 (3), 1135-1146 (1999).
- Zefirov, A., Benish, T., Fatkullin, N., Cheranov, S., Khazipov, R.
- Macleod, G. T., Lavidis, N. A., Bennett, M. R. Calcium dependence of quantal secretion from visualized sympathetic nerve varicosities on the mouse vas deferens. J Physiol. 480 (Pt 1), 61-70 (1994).
- Samigullin, D., Bill, C. A., Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. Regulation of transmitter release by synapsin II in mouse motor terminals. J Physiol. 561 (Pt 1), 149-158 (2004).
- Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. Rab3a-mediated vesicle recruitment regulates short-term plasticity at the mouse diaphragm synapse. Mol Cell Neurosci. 41 (2), 286-296 (2009).
- Atwood, H. L., Parnas, H., Parnas, I., Wojtowicz, J. M. Quantal currents evoked by graded intracellular depolarization of crayfish motor axon terminals. J Physiol. 383, 587-599 (1987).
- Parnas, H., Dudel, J., Parnas, I. Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish. I. Saturation kinetics of release, and of entry and removal of calcium. Pflugers Arch. 393 (1), 1-14 (1982).
- Wojtowicz, J. M., Marin, L., Atwood, H. L. Activity-induced changes in synaptic release sites at the crayfish neuromuscular junction. J Neurosci. 14 (6), 3688-3703 (1994).
- Zucker, R. S. Crayfish neuromuscular facilitation activated by constant presynaptic action potentials and depolarizing pulses. J Physiol. 241 (1), 69-89 (1974).
- Zucker, R. S. Changes in the statistics of transmitter release during facilitation. J Physiol. 229 (3), 787-810 (1973).
- Worden, M. K., Bykhovskaia, M., Hackett, J. T. Facilitation at the lobster neuromuscular junction: a stimulus-dependent mobilization model. J Neurophysiol. 78 (1), 417-428 (1997).
- Bykhovskaia, M., Hackett, J. T., Worden, M. K. Asynchrony of quantal events in evoked multiquantal responses indicates presynaptic quantal interaction. J Neurophysiol. 81 (5), 2234-2242 (1999).
- Bykhovskaia, M., Polagaeva, E., Hackett, J. T. Mechnisms underlying different facilitation forms at the lobster neuromuscular synapse. Brain Res. 1019 (1-2), 10-21 (2004).
- Cooper, R. L., Stewart, B. A., Wojtowicz, J. M., Wang, S., Atwood, H. L. Quantal measurement and analysis methods compared for crayfish and Drosophila neuromuscular junctions, and rat hippocampus. J Neurosci Methods. 61 (1-2), 67-78 (1995).
- Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).
- Pawlu, C., DiAntonio, A., Heckmann, M. Postfusional control of quantal current shape. Neuron. 42 (4), 607-618 (2004).
- Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. Synapsin maintains the reserve vesicle pool and spatial segregation of the recycling pool in Drosophila presynaptic boutons. Brain Res. 1178, 52-64 (2007).
- Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. Enhancement of the endosomal endocytic pathway increases quantal size. Mol Cell Neurosci. 40 (2), 199-206 (2009).
- Vasin, A., Volfson, D., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Interaction of the Complexin Accessory Helix with Synaptobrevin Regulates Spontaneous Fusion. Biophys J. 111 (9), 1954-1964 (2016).
- Wong, K., Karunanithi, S., Atwood, H. L. Quantal unit populations at the Drosophila larval neuromuscular junction. J Neurophysiol. 82 (3), 1497-1511 (1999).
- Dudel, J. The effect of reduced calcium on quantal unit current and release at the crayfish neuromuscular junction. Pflugers Arch. 391 (1), 35-40 (1981).
- Dudel, J. Contribution of Ca2+ inflow to quantal, phasic transmitter release from nerve terminals of frog muscle. Pflugers Arch. 422 (2), 129-142 (1992).
- Marrero, H. G., Lemos, J. R. Loose-Patch-Clamp method. , 2 ed, Humana Press. (2007).
- Wu, W. H., Cooper, R. L. Physiological recordings of high and low output NMJs on the crayfish leg extensor muscle. J Vis Exp. (45), (2010).
- Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
- Imlach, W., McCabe, B. D. Electrophysiological methods for recording synaptic potentials from the NMJ of Drosophila larvae. J Vis Exp. (24), (2009).
- Bykhovskaia, M. Making quantal analysis more convenient, fast, and accurate: user-friendly software QUANTAN. J Neurosci Methods. 168 (2), 500-513 (2008).
- Huntwork, S., Littleton, J. T. A complexin fusion clamp regulates spontaneous neurotransmitter release and synaptic growth. Nat Neurosci. 10 (10), 1235-1237 (2007).
- Zhong, Y., Wu, C. F. Altered synaptic plasticity in Drosophila memory mutants with a defective cyclic AMP cascade. Science. 251 (4990), 198-201 (1991).
- Delgado, R., Maureira, C., Oliva, C., Kidokoro, Y., Labarca, P. Size of vesicle pools, rates of mobilization, and recycling at neuromuscular synapses of a Drosophila mutant, shibire. Neuron. 28 (3), 941-953 (2000).
- Melom, J. E., Akbergenova, Y., Gavornik, J. P., Littleton, J. T. Spontaneous and evoked release are independently regulated at individual active zones. J Neurosci. 33 (44), 17253-17263 (2013).
