Summary
Denne protokol beskriver hvordan man stimulerer celler med mitokondrie-afledte peptider og vurdere signaling cascade og lokalisering af phospho-proteiner.
Abstract
Mitokondrie-afledte peptider (MDP'er) er en ny klasse af peptider, der er kodet ved små åbne læserammer inden for andre kendte gener af mitokondrie genomet. MDP'er har en bred vifte af biologiske effekter såsom beskytte neuroner mod apoptose, forbedrer metaboliske markører og beskytte celler fra kemoterapi. Humanin var den første MDP at blive opdaget og er den mest studerede peptid blandt familien MDP. Membranreceptorer og downstream signaling veje af humanin er blevet nøje karakteriseret. Yderligere MDP'er MOTS-c og SHLP1-6 har været for nylig opdaget og signalering mekanismer har endnu at blive belyst. Her beskriver vi en celle kultur baseret metode til at bestemme funktionen af disse peptider. Især mulighed celle fraktionering teknikker i kombination med western blotting for kvantitativ bestemmelse af aktivering og omplantning af vigtig signalfunktion molekyle. Mens der er andre metoder til celle fraktionering, er beskrevet her en nem og ligetil metode. Disse metoder kan bruges til yderligere belyse virkningsmekanismen af disse peptider og andre terapeutiske agenter.
Introduction
Nye undersøgelser viser, at mitokondrie-afledte peptider (MDP'er) spille en vigtig rolle i cytoprotection og stofskifte1,2,3. Forståelse signaltransduktion pathway i overværelse af MDP'er giver os indsigt i den mekanisme, hvormed MDP'er modulere forskellige funktioner. Den første identificerede MDP, humanin, har vist sig at øge ekstracellulær signal-reguleret kinase 1/2 (ERK1/2) fosforylering gennem sin receptor bindende4,5. ERK1/2 aktivering downstream effekten er dog stadig underexplored.
ERK1/2 cascade fungerer som en vigtig mægler i en række forskellige cellulære processer herunder spredning, celle migration, cellulære metabolisme, overlevelse og apoptose6,7,8. For at orkestrere alle reguleret disse forskellige cellulære processer, aktivitet og subcellulært lokalisering af ERK1/2 stramt af fosfataser og stillads proteiner9,10. Ud over posttranslationel modifikation regulerer den dynamiske shuttling af ERK1/2 også sin signaling funktion, aktivitet og specificitet11,12. ERK1/2 er primært lokaliseret i cytosol13. Et sæt af forankring og stillads proteiner bidrage til at bevare ERK1/2 i cytoskeletal elementer, på overfladen af organeller, eller diffust i cytoplasma13. Stimulering, ERK1/2 er fosforyleret og bliver adskilt fra sin forankring proteiner, så omplantning af ERK1/2 til andre subcellulært rum, herunder kerne, mitokondrier, Golgi og lysosomer14, 15 , 16.
Selv om humanin er kendt for at aktivere ERK1/2 signalering pathway, er aktivering af ERK1/2 kun observeret i den samlede cellelysater. Som beskrevet tidligere, da ERK1/2 subcellulært lokalisering spiller en afgørende rolle i sin downstream virkning, analyse af både den subcellulært lokalisering og de samlede niveauer af er fosforyleres ERK1/2 nødvendigt at fastsætte en omfattende forståelse humanin-induceret ERK1/2 aktivering og aktivering af downstream mål.
For at forstå målet organeller aktiveret ERK1/2, blev subcellulært fraktionering efterfulgt af western blotting for fosforyleres ERK1/2 udført. Denne metode kan gennemføres let, som det udnytter almindeligt laboratorieudstyr og reagenser. De isolerede subcellulært rum er af høj renhed, så resultaterne skal fortolkes ligefremt. Immunfarvning af ERK1/2 kan give lignende resultater. Visse subcellulært rum er dog relativt svært at visualisere og kræver særlige fiksering og permeabilization metoder. ERK1/2 niveauer variere i subcellulært rum, og denne variation kan forårsage falsk positive og falsk negative signaler, når man ser på hele cellelysater. Derfor giver en immunblot ved hjælp af isolerede subcellulært rum os en bedre forståelse af ERK1/2 lokalisering.
Alsidigheden af metoden gør det muligt for ændringer af protokollen til at undersøge virkningerne af andre stimulanser, herunder andre MDP'er eller omplantning af andre signaling molekyler såsom STAT3. For nylig er opdaget små humanin-lignende peptider (SHLPs) kodet fra 16S rRNA region, hvor humanin er kodet, og de har lignende men forskellige egenskaber i forhold til HN17. For eksempel, aktivere SHLP2 og SHLP3 ERK1/2 efter 8 h selv humanin aktiverer ERK1/2 inden for 5 min. undersøgelse subcellulært lokalisering af ERK1/2 som svar på forskellige peptider vil give os en bedre forståelse af biologi af disse peptider. Nye beviser viste at subcellulært lokaliseringen af signalering molekyler spiller en afgørende rolle i deres downstream effekter. For eksempel, STAT3 traditionelt er kendt for at være hovedsagelig lokaliseret i cytosol i resting celler, og derefter det translocates ind i kernen til at aktivere genekspression i svar til cytokiner18. STAT3 også translocates til mitokondrier og regulerer TCA cyklus og ATP produktion19. Vedrørende autophagy forskrift modulerer forskellige subcellulært lokalisering af STAT3 autophagy i forskellige måder20. For eksempel, nukleare STAT3 transcriptionally regulerer autophagy-relaterede gener og fungerer som en autophagy-modulator. Cytoplasmatisk STAT3 hæmmer constitutively autophagy ved at interagere med autophagy signalerer molekyler. Mitokondrie STAT3 hæmmer og forhindrer mitophagy ved at undertrykke oxidativt stress induceret autophagy. Derfor, denne subcellulært rum isolation metode er afgørende for at forstå rollen, andre signaling molekyler samt ERK1/2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. peptid behandling til celler
- plade to millioner SH-SY5Y eller HEK293 celler (2 x 10 6) i et 10 cm parabol og dyrke dem i 2 dage
- (valgfrit) næste dag, cellerne vaskes med serumfrit Dulbecco ' s ændret Eagle Medium (DMEM) medier én gang, og der inkuberes med serum gratis DMEM natten hvis behandlingen skal gøres i serum frie medier.
- På dag 3, opløses S14G-humanin peptider i 0,2 µm filtreret, destilleret vand, og rekonstruere dem som 1mM stamopløsning.
Bemærk: Peptider bør opløses i passende opløsningsmiddel, som kan bestemmes ved sekvens Karakteristik af peptid (fx, samlede afgift) og kan leveres af fabrikanten, hvis peptider er kommercielt tilgængelige. For eksempel, opløses S14G-humanin, SHLP2, og SHLP6 og MOTS-c i vand. Alikvot peptider i et passende volumen (fx, 50 μl) at undgå at fryse og tø cykler. Når optøet, ikke bruger dem igen. - Delprøve de pre varmede serum-holdige eller serum-frie medier i en 50 mL konisk tube og tilføje stuetemperatur 1 mM stamopløsning for at gøre det til en fungerende koncentration (f.eks., 1 µM, 10 µM).
- Erstatte mediet med 6 mL peptid løsning fra trin 1.4. og inkuberes cellerne for det relevante tidsrum.
Bemærk: Vælg inkubationstiden afhængigt af din tilstand, som aktiverer ERK.
2. Subcellulært fraktionering til Cytosol og Nucleus
- cellerne vaskes to gange med 10 mL iskold PBS, skrabe celler off plade i 5 mL iskold PBS og overføre cellesuspension i en 15 mL konisk tube.
- Centrifugeres celler på 500 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Opsug PBS og genopslæmmes pellet i 200 µL af iskold, fraktionering buffer (10 mM HEPES pH = 7.6, 3 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 5% (v/v) glycerol, 1% nonionisk overfladeaktivt stof (C 13 H 22 O (C 2 H 4 O) n), protease/fosfatase hæmmere).
Bemærk: For at holde proteinerne i deres fosforylering status, fosfatase hæmmer som godt som protease hæmmer tilføjes frisk og prøver skal opbevares på is på alle tidspunkter. Gentagne fryse og tø cykler af prøverne bør undgås. Alikvot prøver i lille mængde (fx 50 μg) før frysning dem på-80 ° C. - Ruger den re suspenderede pellet i isbad i 15 min og derefter centrifugeres ved 250 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Indsamle supernatanten som den cytoplasmatisk brøk og holde pellet for den nukleare fraktion.
- Centrifugeres supernatanten for at fjerne celleaffald og andre forurenende stoffer ved 18.000 x g i 10 min. ved 4 ° C og derefter overføre supernatanten ind i en ny microcentrifuge rør. Dette er cytosol brøkdel.
- Resuspenderes i 200 μl iskold vaskebuffer (10 mM HEPES pH = 7.6, 1,5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) glycerol, 0,2 mM EDTA, protease/fosfatase hæmmere) og centrifugeres ved 250 x g i 5 min. ved 4 ° C
- Fjern supernatanten og resuspenderes i 100 μl iskold, nukleare udvinding buffer (20 mM HEPES pH = 7.6, 1,5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) glycerol, 0,2 mM EDTA, protease/fosfatase hæmmere) og sonikeres 10 gange (5 s på 10 s off 30% amp.) på ice.
- Der centrifugeres ved 18.000 x g i 10 min. ved 4 ° C.
- Overføre supernatanten til et nyt microcentrifuge-rør. Dette er den nukleare fraktion.
- Tal det protein beløb ved hjælp af en BCA assay
3. rå mitokondrie brøkdel
- vaske cellerne i hver 10 cm parabol med 10 mL iskold PBS, tilføje 5 mL iskold PBS og frigør celler ved hjælp af en celle skraber.
Bemærk: Brug tre 10 cm retter af celler til at få et godt udbytte af mitochondrier for Western Blotting. - Overføre cellesuspension til en 15 mL konisk slange, og kombinere alle fra tre 10 cm retter i en 15 ml konisk tube.
- Centrifugeres celler på 600 x g i 10 min. ved 4 ° C.
- Opsug PBS og genopslæmmes pellet i 1 mL iskold mitokondrier isolation buffer (10 mM Tris-MOPS, 1 mM EGTA/Tris, 200 mM saccharose, justeres til pH = 7.4).
- Homogeniseres celler med 25 slag af en 2 mL homogeniseringsapparat med Teflon coated pistil på ice.
Bemærk: Dette trin er afgørende for at opretholde mitokondrie integritet og maksimere udbyttet af de mitokondrielle brøkdel. Antallet af streger skal optimeres for hver celle. Precool homogeniseringsapparat før du begynder proceduren. - Overførsel af homogenatet til et microcentrifuge rør og centrifugeres ved 600 x g i 10 min. ved 4 ° C og fjern kerner og ubrudt celler.
- Indsamle supernatanten, overføre det til en ny microcentrifuge tube og centrifugeres det på 7.000 x g i 10 min. ved 4 ° C.
Bemærk: Pellet er løs, indsamle supernatanten med omhu og forsøge ikke at forstyrre pelleten. - Fjern supernatanten, genopslæmmes pellet med 200 μl af iskold mitokondrier isolation buffer og opløsningen overføres til en ny microcentrifuge tube. Centrifugeres tube på 7.000 x g i 10 min. ved 4 ° C.
- Gentag trin 3.8 at vaske pelleten. Det er ikke nødvendigt at overføre supernatanten til et nyt microcentrifuge i dette trin.
- Fjern supernatanten fra den vasket pellet og genopslæmmes pellet indeholdende mitokondrier med 50 μL af RIPA buffer.
- Incubate suspension i isbad i 10 min.
- Centrifugeres suspension på 16.000 x g i 15 min. ved 4 ° C.
- Overføre supernatanten til et nyt microcentrifuge-rør. Dette er den mitokondrielle brøkdel.
- Kvantificere protein beløb ved hjælp af en BCA assay.
4. Western Blotting for Phospho-specifikke proteiner
- udføre en SDS-polyacrylamid gelelektroforese (8-16% premade gel) og overføre proteinet til en PVDF membran 4.
- Ruger membran med 5% BSA i TBST (0,1% Polysorbat 20) i 30 min. ved stuetemperatur til at blokere baggrund uspecifikke bindingssteder.
Bemærk: Til fosforyleres protein påvisning, blokere membran med BSA ikke mælk. Mælk indeholder kasein, en rigelig phosphoprotein, hvilket resulterer i høje uspecifik signal. - Ruger membran med det primære antistof (anti-phospho-ERK1/2) ved 4 ° C natten.
- Den næste dag, vaske membran med TBST (0,1% Polysorbat 20) tre gange for 5 min ved stuetemperatur.
- Ruger membran med sekundær antistof (anti-kanin HRP) i 1 time ved stuetemperatur.
- Vaske membran med TBST (0,1% Polysorbat 20) tre gange for 5 min ved stuetemperatur.
- Ruger membran med ECL løsning og billed membran i billedet analyzer.
- Strip membran med stripning buffer i 15 min. ved stuetemperatur og vask membran med TBST tre gange i 5 min.
- Gentag trin 4.2 til 4.7 ved hjælp af anti-alt ERK1/2 antistof.
- For at tjekke renheden af hver fraktion, køre SDS-PAGE og udføre immunoblots ved hjælp af antistoffer erkender markører for hvert rum (fx Lamin B1 kerne, GAPDH til cytosol, og TOM20 for mitokondrierne).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af den procedure, der præsenteres her, vi behandlet HEK293 og SH-SY5Y celler med 1 μM og 100 μM S14G-humanin, en potent humanin analog21, henholdsvis i komplet media til de angivne perioder (figur 1A og figur 1 B). vi derefter undersøgt den samlede og fosforyleres form for ERK1/2 på Thr202/Tyr204 fra total protein ekstrakter. S14G-humanin behandling viste stigning i fosforylering af ERK1/2 på dets lovgivningsmæssige Thr202/Tyr204 Site. ERK1/2 subcellulært lokalisering spiller en vigtig rolle i dens signaling funktion, navnlig at få dets specificitet. For at forstå målet om S14G-humanin-medieret ERK1/2 aktivering, vi analyseret subcellulært lokaliseringen af total og fosforyleret ERK1/2 efter S14G-humanin behandling. I HEK293 celler, de fosforyleres ERK steg i begge cytoplasma og kerne, men ikke i mitokondrierne (fig. 2A). Interessant, faldt fosforyleres ERK i cytoplasma, kerne og mitokondrier i SH-SY5Y celler (figur 2B). Disse resultater tyder på, at S14G-humanin-medieret ERK fosforylering kan spille en anden rolle i forskellige celletyper og forskellige betingelser. Derfor, yderligere undersøgelser er nødvendige til at analysere lokalisering af S14G-humanin-medieret fosforylering af ERK1/2 i andre subcellulært rum, som fosforyleres ERK1/2 translocates til kernen, mitokondrier, endosomes/lysosomer, og forskellige membraner.
Figur 1: S14G-humanin øger fosforylering af ERK1/2 HEK293 og SH-SY5Y. Kvantificering og repræsentant western blotting af ERK aktivering i (A) HEK293 og (B) SH-SY5Y celler. Total cellelysater efter (A) 1 µM eller (B) 100 µM S14G-humanin behandling i DMEM suppleret med 10% FBS for den angivne perioder var immunoblotted ved hjælp af anti-phospho - og alt-ERK 1/2 (Thr202/Tyr204). Dette tal er blevet ændret fra Kim et al. 4 venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Fosforyleret ERK1/2 er lokaliseret til cytosol, kernen og andre subcellulært rum ved S14G-humanin behandling i celler, HEK293 og SH-SY5Y. Repræsentative western blotting viser ERK1/2 subcellulært lokalisering (n = 3). (A) HEK293 celler blev behandlet med 1 µM S14G-humanin. Cytosole (15 µg), nukleare (15 µg og 50 µg), og mitokondrie (15 μg) lysates blev immunoblotted ved hjælp af phospho - og alt-ERK antistof. (B) SH - SY5Y celler blev behandlet med 100 µM S14G-humanin. Mitokondrie fraktioner var opnået 30 min efter S14G-humanin behandling. Cytosole, nukleare og mitokondrie (15 µg) lysates blev immunoblotted ved hjælp af phospho - og alt-ERK antistof. Anti-GAPDH, Anti-Eigil B, anti-Tom20 antistof blev brugt som cytosole, nukleare, mitokondrie brøkdel markører, henholdsvis. Dette tal er blevet ændret fra Kim et al. 4. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Buffere til cytosol, nukleare, og mitokondriel brøkdel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her, viste vi at humanin peptid-medieret ERK1/2 Aktivering sker i to forskellige celletyper, og subcellulært lokaliseringen af aktiverede ERK1/2 kan være forskellige afhængig af betingelser (fx, dosis af peptid, tidspunkt og celle type). Det har vist sig at humanin signaler gennem to forskellige receptorer22,23, hvilket kan forklare forskelle i signalering mellem to cellelinier samt kravet om forskellige doser af humanin. De fysiologiske konsekvenser af dette er ikke blevet fuldt undersøgt, men det kan tyde på en mulig mekanisme til væv afhænger af reaktionerne på HN.
Fosforylering af ERK1/2 spiller en afgørende rolle i ERK1/2 signalering og statussen fosforylering af ERK1/2 viser dynamiske ændringer. Det er vigtigt at optimere betingelserne for at finde, når ERK1/2 er fosforyleret under en bestemt betingelse/stimulus. At opnå dette, så prøv forskellige stimulation betingelser (fx, dosis og medium) og gennemføre tid kurser at finde når det højeste niveau af fosforylering er opnået. Et flertal af undersøgelser har kun fokuseret på ERK1/2 fosforylering i samlede cellelysater. Resultaterne kan dog fastsætte begrænsede funktionelle oplysninger som ERK1/2 kan interagere med forskellige mål og modulere forskellige downstream cascades i specifikke subcellulært rum. Derfor giver undersøger subcellulært lokaliseringen af fosforyleres ERK1/2 en bedre forståelse af rollen, som ERK1/2 aktivering.
Subcellulært fraktionering efter ERK1/2 aktivering kan bruges som en kilde til yderligere undersøgelse (fx, co-immunoprecipitation) til at identificere roman downstream mål, fordi den subcellulært fraktionering kan berige for downstream mål af ERK1/2. Denne metode kan anvendes på andre signaling molekyler, der omplantes til forskellige subcellulært rum på stimuli efter optimering af betingelser.
Selv om forskellige metoder til at isolere mitokondrier er blevet foreslået i de forløbne årtier, er der delvis forurening fra andre subcellulært rum. Den rå mitokondrie isolation metode foreslået her indeholder også begrænset mængde cytoplasma forurenende stoffer. Da mængden af forurening er lille, mener vi, at det er stadig en gyldig metode til påvisning af lokalisering af ERK1/2 til mitokondrier ved aktivering. Som peptider ikke er nødvendigvis stabile i løsning, er det undertiden vanskeligt at bevare sammenhængen mellem eksperimenter. Vær sikker på at gøre små prøver af peptid løsning at undgå fryse-tø virkninger og forbedre konsistensen af peptid aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Pinchas Cohen er en aktionær og konsulent for CohBar, Inc. Kelvin Yen har fungeret som konsulent for CohBar, Inc.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en Ellison/AFAR postdoc stipendium i Aging Research Program til SJK, og en Glenn Foundation Award og NIH tilskud til PC (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Alle forfattere synes i filmen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell signaling | 9102 | Dilution 1:1,000 |
| phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204) | Cell signaling | 4370 | Dilution 1:1,000 |
| Lamin B1 | Cell signaling | 12586 | Nuclear Marker, Dilution 1:1,000 |
| GAPDH | Cell signaling | 5174 | Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000 |
| Tom20 | Santa cruz | SC-17764 | Mitochondria marker, Dilution 1:2,000 |
| anti-Rabbit-HRP conjugated | Cell signaling | 7074 | Dilution 1:30,000 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 89900 | |
| 100 mm Culture Dish | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12556002 | |
| HNG peptide | Genescript | ||
| 25mm sylinge filter | ThermoFisher SCIENTIFIC | 09-719A | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP151-100 | |
| EDTA | Sigma | 3609 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Tris-base | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP152-1 | |
| HCL | Sigma | H1758 | |
| PBS | Lonza | 17-512F | |
| Cell Scraper | FALCON | 353085 | |
| Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 78440 | |
| Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles | Thomas Scientific | 3432S90 | |
| Tween-20 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP337-500 | |
| BSA | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP1600-100 | |
| 8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BIO RAD | 4561104 | |
| Mini Trans-Blot Module | BIO RAD | 1658030 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BIO RAD | 1704150 | |
| Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit | BIO RAD | 1704272 | |
| Clarity Western ECL Blotting Substrates | BIO RAD | 1705060 | |
| Restore Western blot stripping buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 21059 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11965-092 | |
| Sonicator, Medel: FB120 | ThermoFisher SCIENTIFIC | 695320-07-12 |
References
- Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance. J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).
- Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action. PloS one. 4 (7), 6334 (2009).
- Lee, C., Yen, K., Cohen, P. Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides. Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).
- Kim, S. J., Guerrero, N., et al. The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus. Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).
- Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
- Zhang, W., Liu, H. T. MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells. Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).
- Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. MAP kinases and cell migration. J. Cell Sci. 117, Pt 20 4619-4628 (2004).
- Cagnol, S., Chambard, J. -C. ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence. FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).
- Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
- Morrison, D. K., Davis, R. J. Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).
- Wainstein, E., Seger, R. The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles. Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).
- Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus. Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).
- Kolch, W. Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).
- Horbinski, C., Chu, C. T. Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death. Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).
- Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization. Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).
- Zhu, J. -H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases. Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).
- Cobb, L. J., Lee, C., et al. Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers. Aging. 8 (4), 796-809 (2016).
- Ihle, J. N. The Stat family in cytokine signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).
- Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism. Sci. Rep. 6 (1), 39517 (2016).
- You, L., Wang, Z., et al. The role of STAT3 in autophagy. Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).
- Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults. The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).
- Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
- Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).
