Summary
このメソッドにより、選択的染色とゲルの DNA の定量化 SYBR グリーンでゲルを浸す私/ニトロ ブルー テトラゾリウム ソリューションと、日光や青い光源にそれを公開します。これは表示の沈殿物を生成する、フィールドでの使用に最適の機器はほぼ不要します。
Abstract
DNA 染色法、生物医学研究のため非常に重要です。色の沈殿物の形成によって肉眼に目に DNA の可視化を可能にする簡単な方法を考案しました。それは、アクリルアミドを浸漬、または agarose DNA ゲル 1 x (2.0 μ M に相当) の溶液に SYBR グリーン私 (SG 私) と紫色を作り出す 0.20 mM ニトロ ブルー テトラゾリウム塩日光に露出されたときの沈殿または具体的に青色のライト。また、提案手法を用いた染色 agarose のゲルにアンピシリン耐性プラスミドを用いた DNA 回復試験を行った。コロニーの大きい数はより伝統的な手法で得られた SG を使用して染色私は紫外光照射。説明メソッドは高速、特定、および、transilluminator なし「肉眼で見える」生体分子の可視化をできるように DNA 検出のための非毒性を安価でフィールドでの使用に適した。これらの理由から、私たちの新しい DNA 染色法の研究と業界の両方に潜在的な利点があります。
Introduction
生物化学および分子生物学の発展に伴い、DNA を含む研究は DNA を分析する優れたテクニックが必要。DNA 染色する最初の方法は銀染色、非常に敏感であるが、欠けている選択性および回収はできません。その後、DNA を蛍光染色の開発許可サンプル回復の可能性のある DNA の選択的定量です。DNA の定量化に使用される最初の蛍光染料の一つは、変異2エチジウム ブロマイド1、だった。しかし、今は、安全 GelRed、SYBR グリーンなどの機密性の高い蛍光染料類の改善私 (SG 私)3;しかし、すべてこれらの蛍光染料の紫外線 (UV) transilluminator または蛍光を使用する必要があります。
4メチレン ブルーとクリスタル バイオレット5,6,7,8,9, など目に見えて、DNA を染色する方法がありますが、これらのすべてに苦しむに対する感度を下げると選択性。テトラゾリウム塩有機化合物減少に影響を受け、この場合彼らは不溶性を形成し、色塩沈殿10,11。最近では、DNA の正テトラゾリウム リング12のためにバインドするいくつかの二価テトラゾリウム塩を示されています。
最近文書13を汚し、ポリアクリルアミドゲルの DNA の定量化手法を表示する方法を提案、ニトロ ブルー テトラゾリウム (NBT) と GelRed、臭化エチジウムなど蛍光色素と呼ばれる二価テトラゾリウム塩の還元SYBR グリーン私とサイバー金。青色のライトや日光の存在下で勤務し、品質向上と回収を許可この反応と比較して SG の使用に私 UV transilluminator。本稿の目的は、テトラゾリウムを用いた染色技術の詳細なプロトコルを提供する塩です。
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Protocol
1. 準備とゲルの実行
- Sambrook とラッセルの14が、SDS の代わりに水を用いたナトリウム Dodecyl 硫酸塩-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) レシピを使用して 12% のポリアクリルアミドゲルの非変性ゲルを準備します。
- 解決のゲルの 5 mL の準備、TEMED 0.002 mL、10% 過硫酸アンモニウム、0.05 mL の 1.5 M トリス pH 8.8 1.3 mL アクリルアミド/ビス アクリルアミド (30/0.8 %w/v) 2 mL 1.7 mL の蒸留水を使用します。
- 準備スタッキングのゲルの 2 mL は 1.5 mL の水、アクリルアミド/ビス アクリルアミド (30/0.8 %w/v) 0.33 mL、1 M トリス pH 6.8 の 0.25 mL、10% 過硫酸アンモニウム、0.02 mL、TEMED 0.002 mL を使用します。ゲルのサイズは 7.3 cm × 8.2 cm 0.075 × cm (w x d x l)。
注:感度を最高厚さ 0.75 mm の 15 も櫛を使用します。
- 読み込みバッファーと DNA サンプルを 1.5 mL 遠心チューブ (例えば5 μ L の DNA のサンプルを 6 x の読み込みバッファーの使用 1 μ) x 6 の適切な量を追加します。
- 垂直電気泳動室にゲルを配置します。
- 2 ゲルを実行する 1 x TAE バッファーの 750 mL で部屋を満たします。50 の 1 L を準備する x TAE、トリス基地の 442 g、氷酢酸、57.1 mL と 0.5 M EDTA pH 8 の 100 mL を使用します。1 L の最終巻に蒸留水を追加します。
- ゲルのサンプルをロードします。2 h の 100 V でゲルを実行します。
- また、Sambrook14のレシピを使用して 1 x TAE agarose のゲルを準備します。
- 1 の 300 mL を追加し水平電気泳動室に x TAE。100 V で 45 分のためのゲルを実行します。
2. NBT SG (図 1) を汚す私。
-
アクリルアミドゲル染色します。
- ソリューションの準備: 0.1 w/v NBT と 1.2 SG x 私。
注:エチジウム ブロマイド、GelRed、SG ではなくサイバー ゴールドを使用することが可能だけど、SG の最高のパフォーマンスをしていた。 - 1.2 16.75 mL を注ぐ x SYBR 緑のソリューションに適切なサイズの容器。
注:我々 は、コンテナーとしてピペット チップ ボックスの蓋を使用し、これらのボリュームは、このコンテナーを使用してゲルをカバーする計算されます。その寸法は 11.6 cm × 7.6 cm × 2.6 cm (w x d x l)。 - ソリューションをジェルします。3.25 mL 0.1 %w/v NBT 液 0.2 mM NBT を与えるための追加と 1 x (2.0 μ M に相当) SG 私最終濃度。
- プラスチック フィルムで容器を密閉し、完全に任意の周囲の光を遮断するアルミ箔容器をラップします。
注:プラスチック フィルムは、飛散防止のため、染色液にアルミ箔の反応を避けるために使用されます。 - 25 分 60 rpm で軌道シェーカーを振る。
- アルミとプラスチック製のカバーを取り外します。最大 90 分のための日光にさらします。興味のバンドが表示されるまでは、5 分ごとに確認してください。
- 青色光を使用するには、3 光発光ダイオード (LED) と併せて使用を準備し、ゲルの表面 (LED 光源の強度に依存します必要な時間として、継続的に染色チェック) から約 5 mm の Led を配置します。
- ソリューションの準備: 0.1 w/v NBT と 1.2 SG x 私。
-
Agarose のゲル染色します。
- 準備と 1% の agarose を実行するゲルの 1.4 節で説明した後 (サイズが 1 cm × 6.2 cm × 7 cm; l x 幅 x 奥行)、2.1 は、これらの変更と同じ手順に従ってください。
- 1.2 41.9 mL を注ぐ SG x 私ピペット チップ ボックスのふたにソリューションその寸法は 11.6 cm × 7.6 cm × 2.6 cm (w x d x l)。8.1 mL 0.1 %nbt ソリューションを追加します。
- プラスチック フィルムで容器を密閉し、完全に任意の周囲の光を遮断するアルミ箔容器をラップします。
- 1 h 60 rpm で軌道シェーカーを振る。
3. データ分析。
-
NBT SG 私検。
- 1200 dpi でスキャンすることによって、ゲルの画像を取得します。
- 画像解析ソフトウェアをオープン。イメージ エディターを使用してイメージをまっすぐにします。画像密度測定を実行します。
- 曲線の下の領域を計算します。DNA 濃度対最大のグラフを準備します。
4. DNA の回復。
- 1 に 1% の agarose のゲルの準備のレシピを使用して x TAE が見つかりました Sambrook14。
- 1 の 300 mL を追加し水平電気泳動室に x TAE。100 ng/μ L pDJ10015プラスミッドおよび DNA ラダー図 2に与えられる方式を次の 4 μ L をロードします。100 V で 1 時間のためのゲルを実行します。
- マークし、2 つの 2 mL 遠心チューブの重量を量る。
- 真ん中 2 つの同じ部分を持つためにゲルをカットします。それぞれには、はしごと異なる染色法を比較するサンプル プラスミドを含める必要があります。概略図は、図 2にあります。
- ステイン 1 つ NBT SG と半分ステップ 2 のように。
- きれいなメスを使用してプラスミッド バンドをカットします。1 つの管でゲルの部分を保存し、重量を量る。
- SG とゲルの他の部分を染色私 1 の 50 mL の SG x 私ソリューションと暗闇の中で (60 rpm) 1 h のためのゲルをゆっくりと振る。
- ジェルを transilluminator ときれいなメスを使用してプラスミッド バンドを 2 分カットを公開します。
- 他のチューブにゲルの部分を保存し、重量を量る。
注:プロトコルは-20 ° C でチューブを維持しながらここで一時停止できます。
- 商業ゲル抽出キットを使用してプラスミッドの抽出を行います。
5. プラスミド正規化されます。
- 1.5 mL 遠心チューブに抽出されたプラスミドの 10 μ L と 60 μ L の水の種類を追加します。ミックス 60 μ 石英キュベットに譲渡または直接、Nanodrop で 2 μ L を使用します。
- 230 に 320 の吸収スペクトルを測定 nm。次の数式を使用してサンプルのプラスミド濃度を計算します。
Dは適用される希釈率 (この場合は 70/10) x nm の吸収であり、50 は、dsDNA の μ g/mL への換算係数Ax 。 - 9.1 ng/μ L のサンプルを希釈します。
- エシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) 有能なセル (例えばXL10 ゴールド) を変換次の希釈サンプルの 5 μ L を使用して井上変換手順16 。
- ペトリ皿のコロニーの数をカウントして、希釈します。次の数式17:とコロニー形成単位 (CFU) を計算します。
Dは初期の文化から適用される希釈係数です。 - 対になっていない t 検定を実行します。
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Representative Results
紫塩沈殿物 (質量13によって確認される) DNA があるが表示されます。実験では, DNA の梯子は較正曲線 (図 3) に読み込まれました。アクリルアミドと agarose のゲルのプロトコルが動作しますが、低強度があり agarose の長い時間がかかります。しかし、agarose のゲルの使用により、市販のキットを使用してサンプルの回復、それは抽出と干渉しません。青色 Led でこのメソッドを使用して回復したサンプルに SG に比べると質の向上がある私は transilluminator (図 4) を使用しています。
図 1。回路図の NBT SG I DNA 染色と定量解析します。手順: A. 追加 SG 私とゲルに NBT ソリューション。B. は、太陽光や青い光にゲルを公開します。C. は、1200 dpi でゲルをスキャンします。D. 分析ゲル画像を画像処理バンド強度を取得するソフトウェアです。E. 印刷濃度印刷対強度のデータ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.DNA の回復と整合性の比較試金のスケマティック。A. DNA 電気泳動。B. 切削ゲル 2 個に。C. 2 つの異なる染色法で染色 (SG 私と NBT SG 私)。D. は、プラスミド DNA バンドを切断します。大腸菌 DNA 抽出キットを用いたゲル抽出手法。F. 吸光光度法測定による DNA の定量化。G. DNA 濃度の正常化 2 つの方法を比較します。H. I. コロニー カウントとデータ分析の正規化後サンプル細菌変換。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.NBT SG i: を使用して 1500 bp の DNA の較正曲線12.5% ポリアクリルアミドゲルを DNA の梯子の異なる濃度のロードします。ゲルは 1 2 時間 100 V で実行された x TAE。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.私と transilluminator と NBT SG i: sg の DNA 変換効率比較が可視化pDJ100 プラスミドが 1% アガロースゲルでロードされ、100 V 1 で 1 h の実行 x TAE。その後、ゲルは、2 つの半分に切られました。1 私は、NBT SG とゲルの他の半分に SG で染まっていた私。プラスミド バンド ゲル抽出キットを使用してゲルから抽出し。最後に、抽出されたプラスミドは正規化され、エシェリヒア属大腸菌の有能なセルを変換するために使用されました。変換を行った n = 3。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
感受性と小説 DNA 染色法は NBT が減少し、私はこの記事で紹介した SG の使用に基づいています。このプロトコルの重要なステップは、NBT SG でゲルのインキュベーション時間私ソリューションおよび NBT の濃度。Agarose のゲルのより大きい厚さのために agarose のゲルの染色時間はアクリルアミドゲルよりも長くなります。このメソッド、NBT が接触して析出物も SDS 存在下で働きません。ゲルは、紫色の背景を取得した場合別のゲルを準備することをお勧めし、露光時間を短縮します。Agarose のゲルを染色、十分な感度がない場合は、露光時間を長くことをお勧めします。感受性の欠如があり、乳白色の沈殿はゲル中に存在する場合、これは SDS 汚染の結果かもしれない。その場合は、新しいゲルを準備し、染色試薬を追加する前にそれをすすいでください。
青色 LED や太陽の下で当然のことながら青い光現在の光によって提供されるかどうか、青い光による沈殿物が発生します。このため、手法の限界は、光源です。ある光源、青の光源を使用する必要はありません、光源が均一ではない場合は、比較を行うことは不可能し、同じ理由で、それは定量化を行うことが可能ではないです。ただし、得られる結果は使用する光源によって多少異なりますなります。光源に整合性がない場合制服 (例えば日中または非均質な青色光源の光強度の変化により)、直接比較を行うことが難しくなりますまたは別で異なるサンプルの定量化回。
このメソッドでは、フィールドでの使用に最適、DNA を可視化する特殊な計測を必要はありません。量的な結果の 1 つは高解像度カメラや本研究で示したとおりオフィス スキャナーを使用できます。
おそらく 2 種類の染色技術を使用して他の生体染色を組み合わせることにより、将来的にこの技術を展開したい (例えばNBT SG Coomassie の) 同じゲルで。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、フォンド ナシオナル デ開発 Científico y Tecnológico (Fondecyt)、チリ、(CW) にプロジェクト 11130263、プロジェクト チリ + NERC エイトによって支えられた (CW) に Colaboración インターナショナル PCI PII20150073 と U-inicia Vicerrectoría デから危惧デチリ (CW) します。
芸術 Químicas y 博士ホルヘ バーブルと参考については、原稿やリオイバニェス デ extensión デ ラ Facultad デ改正ロバート ・ レッシュ サンディエゴ キロガ ロジャー、このプロジェクトの初期の段階で助けタチアナ ナランホ パルマ行きのおかげでください。チリ大学から Farmacéuticas。ビデオを編集するためのマルセロ ・ ペレスとニール · スティーブンスのナレーションを提供するテキストとエロール ・ ワトソンを修正するためにあまりにも感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions\ |
| distilled water | - | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | - | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
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