Summary
本研究は、ユーティリティおよび定量的細胞膜拡張測定と細胞の接着能の相関性を示します。代表的な例として、Dickkopf 関連蛋白質 3 を紹介して (DKK3) が増加 lobopodia 形成を促進し、副腎皮質癌における細胞接着細胞の in vitro。
Abstract
細胞膜の拡張レパートリーは、がん細胞の接着と渡り鳥の電位を含む様々 な悪性挙動を変調します。正確に分類細胞延長の定量化し、細胞の接着能に及ぼす影響を測定する能力はどのように細胞シグナル伝達イベント衝撃がん細胞挙動と積極性を決定する重要です。ここでは、体外でデザインと、セル拡張メソッドの使用数量と共に設立の in vitroモデルの粘着能力試験と副腎皮質癌 (ACC) について述べる。具体的には、DKK3 の効果推定腫瘍抑制因子とプロの分化抑制因子 SW 13 ACC 細胞株の膜の拡張表現型をテストします。比較的単純な信頼性の高いを提供するためにこれらのアッセイを提案し、簡単に解釈できるメトリック測定様々 な実験条件下でのこれらの特性。
Introduction
調節不全 WNT シグナル伝達は、副腎悪性腫瘍1で重要な役割を果たしています。本研究で使用される方法を調査かどうか DKK3 のサイレンシング、wnt シグナル伝達の負の調節因子副腎皮質における脱分化イベントを表しますセル拡張レパートリー変更のコンテキストで腫瘍形成を促進します。DKK3 は 38 kDa 分泌される糖タンパク質 N 末端のシグナルペプチドとその強制式は積極的な悪性の挙動を抑制、逆に上皮間葉こと、細胞周期の停止で起因した前の調査は示した遷移2。
副腎皮質癌 (ACC) および他の癌の悪性の挙動も含む腫瘍細胞浸潤を円滑に細胞外のマトリックスでは、周囲の表面とのインタ フェースする腫瘍細胞の機能に影響し、移行3。癌の進行の特定細胞膜拡張機能の役割はますます糸状の形成を主に、さまざまなコンテキストで例示されています。たとえば、L 型カルシウム チャネルの過剰発現は、糸状の形成を誘導し、腫瘍細胞浸潤4を促進する発見されています。同様に、ファシン、アクチン結合タンパク質の最小正常組織単位も発現がん細胞突起の形成5に。Lobopodia 形成により細胞外のマトリックスを通って効果的に移行する非悪性線維芽細胞、しかしでは線維肉腫細胞が細胞の移動を容易にする lobopodia の代わりにマトリックスメタロプロテアーゼ活性に頼ることを示されていると侵略6。我々 はその腫瘍を示されている抑制、Ras 協会ドメイン家族 1 アイソ フォーム (RASSF1A) を含む、DKK3、骨格要素を変えるとケラトサイト形成を促進し、侵襲プロパティ7、8を阻むことができます。
など、発がん、細胞膜拡張子変更、特に糸状、lobopodia、およびケラトサイト形成試験条件下での評価との関係に関与する遺伝子の効果を特徴付けるため重要です。現在最新の技術は、データ収集と解釈のますます洗練された顕微鏡検査方法、蛍光標識および複雑なコンピューターのアルゴリズムの使用を含んでいます。これらのメソッドは、新しい強力な分析ツールを提供する、その複雑さは、彼らの広範な使用と細胞生物学実験の適応性を制限します。さらに、正確な定量化とセル拡張形態変化の観察は通常測定9,10ではありません。対照的に、ここで標準的な顕微鏡技術と容易に適応できる体外メソッドを使用してセルの拡張子変更を正確に定量化する手法を紹介します。これらのメソッドはまた同時に分析の各セルの各セル拡張機能の種類を定量化し、細胞膜の拡張レパートリーで全体的な変更を確認します。また、どのようにこれらの変更は、細胞接着特性を関連付けることができます.
実験例として、SW-13 SW-DDK3、pCMV6-エントリ/DKK3 プラスミッドのベクトル安定発現されている、構成 DKK3、副腎における差別化要因を染色を指定の以前に作成された細胞株を使用します。非-南西 13 細胞と SW 13 細胞安定発現する空のベクター (pCMV6 エントリ)、SW-ネオを指定は、実験コントロールとして機能します。
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Protocol
1. セル拡張機能特性
- SW 13、SW-ネオと SW DKK3 標準加湿のインキュベーターでは、37.0 ° C、5% 10% 牛胎児血清と 10,000 U/mL ペニシリンとストレプトマイシン ('成長培地' として指定) 補われる CO2ダルベッコ変更イーグル培地で細胞を維持します。
- 診断、セルをカウントし、別 6 ウェル プレートに SW 13、SW-ネオ、SW DKK3 ラインにウェルあたり 5,000 の細胞をプレート培地に無菌ガラス coverslips に一晩成長します。
- 各井戸のための一晩の成長は、成長培地を吸引後、1 ml の温かいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の細胞を洗浄し、1 ml の 10 分の 3.7% のホルムアルデヒドのセルを修復します。
- 30 分洗って余分な 0.05% クリスタル バイオレットの 1 mL の各ウェルの吸引ホルムアルデヒドと染色細胞を染める 1 mL の脱イオン水の 3 つの洗浄を使用しています。
注: 染料の通風管のレベルに応じて細胞の可視化を促進するために染色の背景を削除するいくつかの追加の洗浄は必要かもしれない。- 微細先端の鉗子を使用して、coverslips を取得し、クリア マウント試薬のドロップでラベル付きガラス スライドに顔ダウン配置します。
- 光学顕微鏡の下で細胞延長の試金のため各 coverslip から非重複の細胞の 20 件がランダムに選択します。
- 各視野の 400 倍の倍率での顕微鏡写真を取る。直接各 20 の代表的な細胞の拡張の各種類の数をカウントします。
注: など、20 の隔離されたセルを信頼性の高い結果を保証するテスト条件ごとに検討すべき。糸状は 5 ミクロン以下のベースと 1 つの頂点の細胞拡張機能によって定義されました。Lobopodia は、複数の頂点を持つ拡張機能を含む長さの 5 に 20 ミクロンのベース携帯電話の拡張機能によって定義されました。ケラトサイトは 20 ミクロンの長さと頂の有無よりも大きいセル拡張によって定義されました。テスト細胞の種類に応じてセル拡張のサイズは異なる場合があります、パラメーターの特定の洗練さがあります。
- 各視野の 400 倍の倍率での顕微鏡写真を取る。直接各 20 の代表的な細胞の拡張の各種類の数をカウントします。
- 検査 6 井戸全体平均 (すなわちSW-13、SW ネオ、SW DDK) にそれぞれの細胞の種類に各セルの拡張数を決定します。
- 一方向の分散分析 (ANOVA) の検定を使用して、別のテスト細胞のタイプ間の細胞膜拡張の割合の平均値の違いを比較します。
2. 接着アッセイ
- SW 13、SW-ネオと SW DKK3 細胞培地に CO2を 37.0 ° C、5% で標準加湿インキュベーターで維持します。
- 診断を使用して、カウントし別 6 ウェル プレートによくあたり SW 13、SW-ネオ、SW DKK3 の 100,000 細胞をプレートし、成長培地で一晩培養します。
- セル タイプごとにシード 6 ウェル プレート テスト、下テスト 6 の指定された時間のポイントごとに 1 つのプレートを使用します。
メモ: 異なる種類の細胞の時間ポイントが異なる場合があります。
- 一晩インキュベートした後一度暖かい PBS のセルを洗浄し、各ウェルに非酵素的細胞解離液 x 1 の 0.5 mL を追加します。
- 細胞解離ソリューションを普及するプレートを旋回します。定義された時点 (つまり1、2、3、5、10、および 15 分) で指定されたプレートを吸引し、3 回 1 mL 温 PBS 溶液で洗浄します。
- 洗浄の間緩く接続されたセルをデタッチするプレートを軽くたたきます。
- 残りのすべての PBS と修正 1 ml 10 分の 3.7% のホルムアルデヒドのプレートに接続されている残りの細胞を吸引します。
- 30 分 0.05% クリスタル バイオレットの 1 ml の細胞を染色し、1 mL の脱イオン水で余分な染料を洗浄します。細胞の可視化を促進するために洗浄を滴定しなさい。
注: 染料の通風管のレベルに応じていくつかの追加の洗浄は細胞の可視化を促進するために必要かもしれない。 - 光学顕微鏡を使用すると、100 倍の倍率で、各プレートの各ウェルに接続されている残りのセルをカウントします。
注: 透明な定規またはマーキング プレートの下側の先の細いペン ガイドの使用は同じ細胞の繰り返しカウントを避けるために役立ちます。 - 各プレートのウェルあたり添付の細胞の平均の数を決定します。
- 双方向分散統計的検定を用いて指定された期間にわたって SW 13、SW-ネオと SW DDK3 細胞の間細胞の剥離率を比較します。
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Representative Results
上記の試金を使用して、細胞の拡張の形態と細胞接着特性に及ぼす DKK3 の過剰発現は、確立された ACC セルライン SW-13、体外でテストされました。DKK3 を過剰発現細胞は安定株 Myc DDK タグ pCMV6-エントリ/DKK3 プラスミッドのベクトルし、SW DKK3 として指定で SW 13 細胞によって生成されました。同様に、空のベクター pCMV6 エントリ安定発現細胞は、トランスフェクションと継コントロールとして作成および SW ネオとして定義しました。SW 13 セルは、追加の親セル制御として使用されました。SW DKK3 で DKK3 の過剰発現が確認された量的なリアルタイム PCR および西部のしみの技術8。
簡単に言えば、テスト セル SW 13、SW-ネオと SW DKK3 は、カバー スリップ上 6 ウェル プレートで一晩栽培しました。セル、ホルムアルデヒドと固定されクリスタル バイオレットで染色します。セル拡張機能特性は、上記のパラメーターにつき顕微鏡下、定量化されました。分析、SW DKK3 セル表示されます増加 lobopodia と多細胞極性によって区別された表現型 (p = 0.01、一方向の分散分析、図 1および図 2)、方向の運動の欠如の示唆に富む。対照的に、親の SW 13 と SW ネオの細胞の極性を維持し、平面方向に配置された大きい糸状を表示 (p = 0.01、一方向の分散分析、図 1および図 2)8。
増加 lobopodia 形成がセルの添付ファイルのプロパティを変更するかどうかを決定する、細胞接着アッセイを行った。簡単に言えば、細胞一晩栽培し、進歩的な時 15 分セルまでの間隔が、ホルムアルデヒドと固定、クリスタル バイオレットで染色、ライトを使用してカウント非酵素的細胞解離液と細胞の剥離を行った顕微鏡。SW DKK3 細胞は SW 13 と SW ネオの細胞と比較して有意に大きい添付ファイルの親和性を示した (p < 0.01、2 ウェイ ANOVA、図 3)。DKK3 が順番にセル添付ファイル8を促進する lobopodia の形成を促進することが示唆されました。
図 1: DKK3 の強制発現細胞膜拡張機能を変更します。SW 13 SW DKK3、SW ネオ(B)、 (A) (C)細胞がガラス coverslips 上に成長した、ホルムアルデヒドと固定、クリスタル バイオレットで染色、イメージします。400 倍の倍率で光学顕微鏡を用いた顕微鏡写真が撮影されます。SW 13 と SW ネオ セルは、主に糸状 (赤矢印) とケラトサイト (青の弧) 細胞の延長を形作った。対照的に、SW DKK3 セルはケラトサイト、および非常に少数の糸状の近くの不在でより多くの lobopodia (小さな緑の弧) を形作った。SW 13 (A)と SW ネオ(B)細胞は、前縁糸状と遅行端ケラトサイト偏光 (オレンジの矢印) のように見える、SW DKK3 細胞(C)均等に分散多方向 lobopodia を示したのです。重複で実験を行った。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: DKK3 lobopodia 形成を促進します。セル タイプごとにセルごとケラトサイト、lobopodia、糸状の相対的な表現個々 のセルに対してセル拡張を集計して算出しています。SW 13、SW-ネオと SW DKK の景色 (400 倍) のランダムに取られた顕微鏡分野の 20 の顕微鏡写真のセルは、定量化のために使用されました。エラーバーは標準偏差を示されている示し (*) p < 0.01 lobopodia SW DKK 細胞数の大幅な増加を表す一方通行 ANOVA を使用します。テスト セル タイプごとに合計 20 細胞を調べたし、重複して実験を行った。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: デンマーク クローネが細胞接着を促進します。10 万 SW 13、SW-ネオ 6 ウェル プレートのウェルあたりの SW DKK3 細胞一晩培養する許可された、指定された時点 (x 軸) で剥離の治療を受けていた。接続されている残りのセルが固定、染色と数え、接続されている残りのセルの割合はプロット (y 軸) であった。エラーバーは標準偏差を示すし、(*) p を示します < 0.01 と (*) を示す p < 0.001 SW DKK の大幅な増加を表す 2 ウェイ ANOVA を使用してセル取付強さ。各実験は 10万個のセルを開始し、複製の実験を行った。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで簡単に、いくつかの落とし穴と各種のテスト条件に適用することができます信頼性の高い再現性とセル拡張機能を特徴付けるための体外定量的手法について述べる。また、細胞膜拡張機能の観察された変化の潜在的な機能的意義を関連付けるためシンプルで定量化可能な接着や運動アッセイを同時に実行できます。
しかし、これらのメソッドは、いくつかの潜在的な制限を提示可能性があります。まず、セル拡張機能の種類を識別するためにここで指定した条件は副腎皮質の SW 13 細胞の形態に基づいている、したがって可能性が高い洗練された雰囲気と他の細胞の種類や実験条件に適用されるパラメーターを分類する必要があります。さらに、拡張の経時実験、細胞周期、細胞死を細胞膜の拡張子変更の潜在的な影響は考慮する必要があります。
第二に、プロトコルは、審査官は、検者間のばらつきによる試験の再現性を制限する可能性が潜在的な個別呼び出しに頼るかもしれない。このバイアスの一部を克服する可能性があります各テスト グループの検証は、細胞の数が多い具体的には、20 セルがそれぞれの試金のため検査されます。潜在的な主観的な呼び出しバイアスを軽減するために盲を呼び出す拡張機能を実行する複数の個人を含めることお勧めします。
添付ファイルの下地のための好みを変更される接着特性の簡易版がの結果をすることができる添付ファイルのプロパティをもつセル拡張クラス スイッチの変更を関連付けるときのケアの撮影最後に、ではなくテスト済みの下地の変更されたアフィニティ。移行や様々 な細胞外マトリックス成分のコンテキストで侵入セル拡張クラス スイッチを結合観測密着性を明らかにすることができます。
結論としては、ここで説明されているプロトコルは、さまざまなテスト条件下で細胞膜拡張スイッチの機能的意義を測定するシンプルで信頼性の高い方法を提供します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
大瀬助成財団の資金この作品。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
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