Summary
Denne studien viser av og kvantitative cellemembranen forlengelsen måling og dets sammenheng med selvklebende kapasitet celler. Som et representativt eksempel viser vi her at Dickkopf-relaterte proteiner 3 (DKK3) fremmer økt lobopodia formasjon og celle feste i adrenocortical karsinom celler i vitro.
Abstract
Cellemembranens forlengelse repertoar modulerer ulike ondartet atferd av kreftceller, inkludert deres klebende og vandrende potensialer. Nøyaktig klassifisere og kvantifisere celle utvidelser og måle effekten på en celle selvklebende kapasitet er avgjørende for å bestemme hvordan celle signalisering hendelser innvirkningsvirkemåte kreft cellen og aggressivitet. Her beskriver vi i vitro design og bruk av en celle forlengelsen kvantifisering metode i forbindelse med vedheft kapasitet analysen en etablert i vitro modell for adrenocortical karsinom (ACC). Spesielt teste vi effekten av DKK3, en antatte tumor suppressor og en Pro differensiering faktor, på membran forlengelsen fenotypen av ACC celle linjen, SW-13. Vi foreslår disse analyser å gi relativt enkel, pålitelig og lett interpretable beregninger for måler disse egenskapene under ulike eksperimentelle forhold.
Introduction
Dysregulated WNT signalering spiller en avgjørende rolle i adrenocortical malignitet1. Metodene som brukes i denne studien undersøker om stanse DKK3, en negativ regulator WNT signalnettverk, representerer en dedifferentiation hendelse i binyrebarken og fremmer tumor dannelse i sammenheng av celle-utvidelse repertoar endringer. DKK3 er en 38 kDa utskilles glykoprotein med en N-terminal signal peptid og tidligere studier har vist at håndheves uttrykket resulterte i celle syklus arrestasjon, hemmet aggressiv malign atferd og reversert epithelial-mesenchymal overgang2.
Ondartet atferden til adrenocortical karsinom (ACC) og andre kreftformer er, delvis, påvirket av evnen av kreftceller grensesnitt med omkringliggende overflater, inkludert ekstracellulær matrix, som igjen muliggjør svulst celle invasjonen og migrasjon3. Rollen av bestemte cellemembranen filtyper i kreft progresjon blir stadig demonstrert i ulike sammenhenger, hovedsakelig via dannelsen av filopodia. For eksempel har overuttrykte L-type kalsium kanaler blitt funnet å skape filopodia og fremme svulst celle invasjonen4. Tilsvarende Fascin, en utgangen bindende protein minimal uttrykt i normalt vev, er også overexpressed i kreftceller i tilknytning til filopodia dannelse5. Lobopodia formasjon gjør ikke-ondartet fibroblaster overføre effektivt gjennom ekstra-mobile matrix, men det har vist at fibrosarcoma celler er avhengige av metalloproteinase aktivitet i stedet for lobopodia å lette celle migrasjon og invasjonen6. Vi har vist at svulsten suppressors, inkludert Ras association domene familie 1 isoformen en (RASSF1A) og DKK3, kan funksjonen å endre cellen cytoskjelett elementer og fremme lamellipodia formasjon og stymie invasiv egenskaper7,8.
Som sådan, er det avgjørende å karakterisere effekten av gener involvert i kreft og deres forhold til cellemembranen utvidelse endringer, spesielt vurdere filopodia, lobopodia og lamellipodia formasjon under testforhold. Gjeldende state-of-the art teknikker inkluderer bruk av stadig mer sofistikerte mikroskopi metoder, fluorescerende merking eller komplekse datamaskinalgoritmer for datainnsamling og tolkning. Disse metodene gir nye analytiske verktøy, begrenser kompleksitet deres utbredt bruk og tilpasningsevne i cellen biologiske forsøk. Videre er presis kvantifisering og observasjon av endringer i celle forlengelsen morfologi ikke vanligvis målt9,10. I kontrast, introduserer vi en teknikk her som nøyaktig kvantifiserer celle forlengelsen endringer ved hjelp av standard mikroskopiske teknikker og lett tilpasses i vitro metoder. Disse metodene også kvantifisere hver celle forlengelsen type samtidig i hver celle analysert og finne generelle endringer i cellemembranen forlengelsen repertoaret. Vi viser også hvordan disse endringene kan forholde seg til celle vedheft egenskaper.
Eksperimentell eksempel vil vi bruke en tidligere opprettet cellen linje av SW-13, utpekt SW-DDK3, som har vært stabilt transfekterte med pCMV6-oppføringen/DKK3 plasmider vektorer og constitutively overexpresses DKK3, en distinktiv faktor i binyrene. Non-transfekterte SW-13 cellene og SW-13 stabilt transfekterte med Tom vektor (pCMV6-inngang), utpekt SW-Neo, vil tjene som eksperimentelle kontroller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celle forlengelsen egenskaper
- Opprettholde SW-13, SW-Neo og SW-DKK3 celler i en standard fuktet inkubator ved 37.0 ° C og 5% CO2 i Dulbeccos endret Eagle Medium supplert med 10% fosterets bovin serum og 10.000 U/mL penicillin og streptomycin (betegnet som 'vekst medium').
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer, og plate 5000 celler per brønn for SW-13, SW-Neo og SW-DKK3 linjer i separate 6-vel plater og vokse over natten i vekst medium på sterilt glass coverslips.
- Etter natten vekst, for hver brønn, Sug opp vekstmediet, vaske celler med 1 mL av varm fosfat-bufret saltvann (PBS), og deretter fastsette cellene med 1 mL av 3,7% formaldehyd i 10 min.
- Leveringstanken formaldehyd og flekken celler i hver brønn med 1 mL av 0,05% crystal violet for 30 min. vask overflødig fargestoff bort med tre vasker 1 mL vaskebuffer vann.
Merk: Avhengig av fargestoff opptak, flere flere vasker kan være nødvendig å fjerne bakgrunnen flekk for å fremme cellen visualisering.- Bruke fine tippet tang, hente coverslips og plassere dem forsiden ned på en merket objektglass med en dråpe klare montering reagens.
- Under en lys mikroskop, tilfeldig 20 visninger av ikke-overlappende cellene fra hver dekkglassvæske for celle forlengelsen analysen.
- Ta photomicrographs på 400 x forstørrelse av hver synsfelt. Direkte telle antall hver typen for hver av de 20 representative cellene.
Merk: slik 20 isolert celler bør undersøkes for hver testet tilstand å sikre pålitelige resultater. Filopodia ble definert av mobilnettet extensions med en base av 5 mikron eller færre og en enkelt apex. Lobopodia ble definert av mobilnettet utvidelser med en base av 5 til 20 mikron lengde som inneholder filtyper med flere avlangt. Lamellipodia ble definert av cellen utvidelser som er større enn 20 mikron i lengde og med eller uten avlangt. Avhengig testet celle, størrelsen på cellen utvidelser kan variere og kan kreve raffinement identifisere parametere.
- Ta photomicrographs på 400 x forstørrelse av hver synsfelt. Direkte telle antall hver typen for hver av de 20 representative cellene.
- Bestemme gjennomsnittlig antall hver celle utvidelse i hver celle type (dvs., SW-13, SW-Neo, SW-DDK) over 6 brønnene undersøkt.
- Bruke en enveis analyse av varians (ANOVA) statistisk test, sammenligne forskjeller i den gjennomsnittlige prosentandelen av cellemembranen utvidelser blant de forskjellige test celletyper.
2. vedheft analysen
- Opprettholde SW-13, SW-Neo og SW-DKK3 celler i en standard fuktet inkubator på 37.0 ° C og 5% CO2 i vekst medium.
- Bruker en hemocytometer, telle og plate 100.000 celler SW-13, SW-Neo og SW-DKK3 per brønn i separate 6-vel plater og vokse over natten i vekst medium.
- Frø 6-vel plater for hver celle testet, med en plate for hver av de 6 utpekte tid poengene testet under.
Merk: Tidspunkt kan variere for forskjellige celletyper.
- Etter natten inkubasjon vaske celler med varm PBS når deretter legge 0,5 mL 1 x ikke-enzymatisk celle dissosiasjon løsning i hver brønn.
- Snurr i å spre celle dissosiasjon løsningen. Sug opp den utpekte platen på definerte tidspunkt (dvs. 1, 2, 3, 5, 10 og 15 min) og deretter vaske med 1 mL varm PBS løsning tre ganger.
- Mellom vasker, forsiktig trykk platene for å løsne løst tilknyttet celler.
- Sug opp eventuelle gjenværende PBS og fastsette cellene gjenværende festet til platen med 1 mL av 3,7% formaldehyd i 10 min.
- Stain celler med 1 mL av 0,05% crystal violet i 30 min deretter vaske overflødig fargestoff med 1 mL av deionisert vann. Sjarmere vask for å fremme cellen visualisering.
Merk: Avhengig av fargestoff opptak, flere flere vasker kan være nødvendig å fremme cellen visualisering. - Bruker lys mikroskop på 100 x forstørrelse, telle gjenværende festet celler i hver brønn for hver plate.
Merk: Bruk av gjennomsiktig herskere eller markere fine penn guider på undersiden av platen vil bidra til å unngå gjentatte telling av de samme cellene. - Bestemme gjennomsnittlig antall tilknyttede celler per brønn for hver plate.
- Sammenligne frekvensen av cellen avdeling mellom SW-13, SW-Neo og SW-DDK3 celler i tid periode ved hjelp av en toveis VARIANSANALYSE statistisk test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruker de ovenfor analyser, ble effekten av DKK3 overuttrykte på cellen forlengelsen morfologi og egenskaper for celle vedheft testet i etablerte ACC cellen linje SW-13, i vitro. Celler overexpressing DKK3 ble generert av stabilt transfecting SW-13 celler med Myc-DDK merket pCMV6-oppføringen/DKK3 plasmider vektorer og utpekt som SW-DKK3. Tilsvarende ble celler stabilt transfekterte med Tom vektor pCMV6-oppføringen opprettet som en transfection og passaging og definert som SW-Neo. SW-13 celler ble brukt som en ekstra overordnet celle kontroll. Overuttrykte DKK3 i SW-DKK3 ble bekreftet av kvantitative sanntid PCR og Western blot teknikker8.
Kort, testet celler SW-13, SW-Neo og SW-DKK3 var vokst over natten i 6 bra plater på dekselet slips. Cellene ble deretter fast med formaldehyd og farget med crystal fiolett. Cellen forlengelsen egenskaper deretter kvantifisert under mikroskopi per parameterne som beskrives over. På analyse, SW-DKK3 celler vises en mer differensiert fenotypen fremgår av økt lobopodia og celle retninger polarity (p = 0,01, enveis ANOVA, figur 1 og figur 2), tankevekkende mangel på retningsbestemt motilitet. Derimot foreldrenes SW-13 og SW-Neo celler vedlikeholdt polaritet og vises større filopodia arrangert i en plan orientering (p = 0,01, enveis ANOVA, figur 1 og figur 2)8.
Å avgjøre om økt lobopodia formasjon endres vedlegg egenskaper, vi utført en celle vedheft analysen. Kort, celler var vokst over natten og celle avdeling ble utført med ikke-enzymatisk celle dissosiasjon løsning på progressive tid intervaller inntil 15 min. celler var så fast med formaldehyd, beiset med crystal fiolett og talt med lys mikroskop. SW-DKK3 celler viste en betydelig større vedlegg forhold til SW-13 og SW-Neo celler (p < 0,01, 2-veis VARIANSANALYSE, Figur 3). Disse resultatene indikerer at DKK3 fremmer lobopodia formasjon, som igjen fremmer celle vedlegg8.
Figur 1: håndheves uttrykk for DKK3 endrer cellemembranen utvidelser. SW-13 (A), SW-Neo (B)og SW-DKK3 (C) celler ble dyrket på glass coverslips, fast med formaldehyd, beiset med crystal fiolett og fotografert. Photomicrographs er tatt med et lett mikroskop på 400 x forstørrelse. SW-13 og SW-Neo celler dannet det meste filopodia (rød pilspisser) og lamellipodia (blå arc) cellen utvidelser. Derimot dannet SW-DKK3 celler flere lobopodia (små grønne buer), med nær fravær av lamellipodia, og svært få filopodia. Mens SW-13 (A) og SW-Neo (B) cellene synes å være polarisert (oransje piler) med filopodia i forkant og lamellipodia henger kant, celler SW-DKK3 (C) viste jevnt fordelte retninger lobopodia. Eksperimenter ble utført i duplikat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: DKK3 fremmer lobopodia formasjon. Relativ representasjon av filopodia, lobopodia og lamellipodia per celle for hver celle ble beregnet av tabulerer celle servertilleggene på enkeltceller. Celler i tjue photomicrographs tilfeldig tatt mikroskopiske feltet visninger (400 x forstørrelse) SW-13, SW-Neo og SW-DKK ble brukt for kvantifisering. Feilfelt angitt standardavvik og (*) angir p < 0,01 bruker en enveis ANOVA representerer en betydelig økning i antall lobopodia i SW-DKK celler. Totalt 20 celler ble undersøkt for hver testet cellen og eksperimenter ble utført i duplikat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: DKK fremmer celleadhesjon. Hundretusen SW-13, SW-Neo og SW-DKK3 celler per brønn av 6-vel platene var lov til å vokse over natten og ble behandlet for avdeling på angitt tidspunkt (x-aksen). Cellene gjenværende festet var fast, beiset og telt og prosenter av celler gjenværende festet var plottet (y-aksen). Feilfelt viser standardavvik og (*) angir p < 0,01 og (*) angir p < 0,001 med en 2-veis VARIANSANALYSE representerer en betydelig økning i SW-DKK celle vedlegg styrke. Hvert eksperiment startet med 100.000 celler og eksperimenter ble utført i duplikat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en i vitro kvantitativ metode betegner celle extensions med letthet, noen pit-falls og pålitelig reproduserbarhet som kan brukes for ulike testforhold. Videre kan enkelt, målbare vedheft og/eller motilitet analyser utføres samtidig for å sammenligne potensielle funksjonelle betydningen av observerte endringer i cellemembranen utvidelser.
Men kan disse metodene presentere noen potensielle begrensninger. Først kriteriene angitt her å identifisere ulike typer celle utvidelser er basert på adrenocortical SW-13 celle morfologi og derfor trolig trenger raffinement i klassifisere parametere når andre celler typer og/eller eksperimentelle forhold. Videre, i lengre tid-retters eksperimenter, potensielle påvirkninger av cellemembranen forlengelsen endringer på i cellen syklus og celledød må vurderes.
Andre kan protokollen stole på potensielle individualisert ringer av sensor, som kan begrense analysens reproduserbarhet på grunn av Inter observatør variasjon. Det høye antallet celler som undersøkes for hver testgruppe sannsynlig overvinner en del av denne skjevhet; spesielt når 20 celler blir undersøkt for hver analysen. Inkludering av flere enkeltpersoner kan utføre forlengelsen ringer i en blendet mote er foreslått for å redusere potensielle subjektive kalle bias.
Til slutt må utvises forsiktighet når knytte endringer i celle forlengelsen klassen bryter med endringer i egenskaper for filvedlegg, der en forenklet versjon av heftegenskaper kunne utfallet av endres preferanse for vedlegg undergrunnen stedet det endrede affinitet for den testet undergrunnen. Kopling bryteren celle forlengelsen klasse migrering eller invasjonen i konteksten av forskjellige ekstra-mobile matrix komponenter kunne avklare de observert heftegenskaper.
Avslutningsvis gir protokollen skissert her en enkel og pålitelig metode for å måle funksjonelle betydningen av cellemembranen forlengelsen bryteren under ulike testforhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Ohse Grant Foundation finansiert dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
- Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management. Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).
- Veeck, J., Dahl, E. Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3. Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Jacquemet, G., et al. L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling. Nat Commun. 7, 13297 (2016).
- Machesky, L. M., Li, A. Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis. Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).
- Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells. J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).
- Korah, R., et al. Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma. Molecular cancer. 12, 87 (2013).
- Cheng, J. Y., et al. A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis. BMC cancer. 17 (1), 164 (2017).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Cliffe, A., et al. Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration. Nat Commun. 8, 14905 (2017).
