Summary
Questo studio dimostra l'utilità e la facilità di misurazione estensione quantitativa della membrana cellulare e la sua correlazione alla capacità adesiva delle cellule. Come un esempio rappresentativo, indichiamo qui quella proteina correlata Dickkopf 3 (DKK3) promuove la formazione aumentata lobopodia e adesività delle cellule nel carcinoma corticosurrenale cellule in vitro.
Abstract
Repertorio di estensione della membrana cellulare modula vari comportamenti maligni delle cellule tumorali, comprese le potenzialità adesive e migratori. La capacità di classificare e quantificare le estensioni delle cellule con precisione che misura l'effetto sulla capacità adesiva di una cella è fondamentale per determinare come cellula-segnalazione eventi impatto cancro cella comportamento e aggressività. Qui, descriviamo in vitro progettazione e l'uso di un cella quantificazione metodo di estensione in combinazione con un'analisi di capacità di adesione a un modello stabilito in vitro per carcinoma corticosurrenale (ACC). In particolare, ci prova gli effetti di DKK3, un oncosoppressore putativo e un fattore di pro-differenziazione, il fenotipo di membrana estensione della linea cellulare ACC, SW-13. Vi proponiamo queste analisi per fornire relativamente semplice, affidabile e facilmente interpretabili metriche di misura queste caratteristiche nelle varie circostanze sperimentali.
Introduction
Dysregulated WNT segnalazione svolge un ruolo critico nella malignità corticosurrenale1. I metodi utilizzati in questo studio studiare se il silenziamento di DKK3, un regolatore negativo di segnalazione WNT, rappresenta un evento di dedifferenziazione nella corteccia surrenale e promuove la formazione del tumore nel contesto dei cambiamenti del repertorio di cella-estensione. DKK3 è un 38 kDa secreto glicoproteina con un peptide segnale N-terminale e gli studi precedenti hanno dimostrato che la sua espressione forzata provocato l'arresto del ciclo cellulare, ha inibito il comportamento maligno aggressivo e invertito epiteliale-mesenchimale passaggio2.
Il comportamento maligno di carcinoma corticosurrenale (ACC) e di altri cancri è, in parte, influenzato dalla capacità delle cellule del tumore per interfacciarsi con le superfici circostanti, tra cui la matrice extracellulare, che a sua volta facilita l'invasione delle cellule del tumore e migrazione3. Il ruolo delle estensioni specifiche della membrana cellulare nella progressione del cancro è essere sempre più dimostrato in vari contesti, soprattutto attraverso la formazione di filopodi. Ad esempio, sovraespressione dei canali del calcio tipo L è stata trovata per indurre la formazione di filopodi e promuovere di invasione delle cellule del tumore4. Allo stesso modo, fascina, un'actina proteina legante minimamente espresso nel tessuto normale, è anche overexpressed in cellule di cancro in associazione con filopodi formazione5. Lobopodia formazione permette di fibroblasti non-maligne a migrare in modo efficace attraverso la matrice extra-cellulare, tuttavia, è stato dimostrato che cellule di fibrosarcoma si basano su attività della proteinasi metallica al posto di lobopodia per facilitare la migrazione delle cellule e invasione di6. Abbiamo dimostrato che il tumore soppressori, tra cui Ras associazione dominio famiglia 1 isoforma un (RASSF1A) e DKK3, può funzionare per modificare elementi del citoscheletro e promuovere la formazione di lamellipodi e stymie proprietà dilaganti7,8.
Come tale, è fondamentale per caratterizzare gli effetti di geni coinvolti nella carcinogenesi e loro relazione con le alterazioni di estensione della membrana cellulare, in particolare valutare filopodi, lobopodia e lamellipodi formazione in condizioni di prova. Attuale stato-of-the-art tecniche includono l'uso di metodi sempre più sofisticati di microscopia, Contrassegno fluorescente e/o algoritmi informatici complessi per acquisizione dati e di interpretazione. Mentre questi metodi forniscono nuovi e potenti strumenti analitici, la loro complessità limita l'uso molto diffuso e l'adattabilità in esperimenti di biologia cellulare. Inoltre, la quantificazione precisa e l'osservazione dei cambiamenti nella morfologia delle cellule estensione non è in genere misurata9,10. Al contrario, vi presentiamo qui una tecnica che quantifica con precisione le alterazioni di estensione di cella utilizzando tecniche microscopiche standard e metodi facilmente adattabile in vitro . Questi metodi inoltre quantificare ogni tipo di estensione delle cellule contemporaneamente per ogni cella analizzato e determinano cambiamenti complessivi del repertorio di estensione della membrana cellulare. Mostriamo anche come questi cambiamenti possono riguardare proprietà di adesione delle cellule.
Ad esempio sperimentale, utilizzeremo una linea cellulare creato in precedenza di SW-13, designato SW-DDK3, che ha stato transfected stabile con vettori del plasmide pCMV6-voce/DKK3 e costitutivamente overexpresses DKK3, un fattore di differenziazione nella ghiandola adrenale. SW-13 non-transfettati e SW-13 celle transfettate stabile con il vettore vuoto (pCMV6-voce), designato SW-Neo, servirà come controlli sperimentali.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cella estensione caratteristiche
- Mantenere SW-13, SW-Neo e cellule SW-DKK3 in un incubatore umidificato standard a 37,0 ° C e 5% CO2 nel Medium di Eagle di Dulbecco per volta completati con 10% siero bovino fetale e 10.000 U/mL di penicillina e streptomicina (designato come 'crescita medio').
- Contare le celle utilizzando un emocitometro e piastra 5.000 cellule per pozzetto per SW-13, SW-Neo e SW-DKK3 linee in separata piastre da 6 pozzetti e crescere durante la notte nel mezzo di crescita sulle lamelle di vetro sterile.
- Dopo la crescita durante la notte, per ogni bene, aspirare il mezzo di crescita, lavare le cellule con 1 mL di soluzione tampone fosfato (PBS) e caldo e quindi fissare le cellule con 1 mL di formaldeide al 3,7% per 10 min.
- Cellule di formaldeide e macchia aspirato in ciascun pozzetto con 1 mL di cristalvioletto 0.05% per 30 min. eccesso di lavaggio tingono distanza utilizzando tre lavaggi di 1 mL di acqua deionizzata.
Nota: A seconda del livello di assorbimento della tintura, alcuni ulteriori lavaggi possono essere necessario rimuovere sfondo macchiatura per promuovere la visualizzazione della cella.- Utilizzando una pinzetta punta, recuperare coprioggetti e metterli a faccia in giù su un vetrino con etichetta con una goccia di reagente di montaggio chiaro.
- Sotto un microscopio chiaro, scegliere casualmente 20 visite delle cellule non sovrapposte da ciascun vetrino coprioggetto per l'analisi di estensione delle cellule.
- Prendere microfotografie a 400 ingrandimenti di ogni campo di vista. Direttamente è possibile contare il numero di ogni tipo di estensione per ciascuna delle 20 celle rappresentative.
Nota: come tale, 20 cellule isolate dovrebbero essere esaminate per ogni condizione verificata garantire risultati affidabili. Filopodi sono stati definiti dalle estensioni per cellulari con una base di 5 micron o meno e un apice singolo. Lobopodia vennero definiti da cellulare estensioni con una base di 5-20 micron di lunghezza contenenti le estensioni con più apici. Lamellipodi sono state definite da estensioni delle cellule che sono superiori ai 20 micron di lunghezza e con o senza apici. A seconda del tipo di cella testata, le dimensioni delle estensioni delle cellule possono differire e possono richiedere la raffinatezza di identificazione dei parametri.
- Prendere microfotografie a 400 ingrandimenti di ogni campo di vista. Direttamente è possibile contare il numero di ogni tipo di estensione per ciascuna delle 20 celle rappresentative.
- Determinare il numero medio di ogni estensione di cella in ogni tipo di cellula (cioè, SW-13, SW-Neo, SW-DDK) attraverso 6 pozzi esaminati.
- Utilizzando un test statistico di analisi unidirezionale della varianza (ANOVA), confrontare le differenze della percentuale media di estensioni della membrana cellulare tra i tipi di cella di test diversi.
2. adesione Assay
- Mantenere SW-13, SW-Neo e cellule SW-DKK3 in un incubatore umidificato standard a 37,0 ° C e 5% di CO2 nel mezzo di crescita.
- Utilizzando un emocitometro, contare e piastra 100.000 cellule SW-13, SW-Neo e SW-DKK3 per pozzetto in piastre separate 6 pozzetti e crescere durante la notte nel mezzo di crescita.
- Piastre da 6 pozzetti seme per ogni tipo di cellula testato, utilizzando una piastra per ciascuno dei 6 punti tempo designato testati sotto.
Nota: I punti di tempo possono variare per diversi tipi di cellule.
- Dopo incubazione overnight, lavare le cellule con PBS caldo una volta poi aggiungere 0,5 mL di soluzione di dissociazione non enzimatica delle cellule 1x in ciascun pozzetto.
- Agitare la piastra per diffondere la soluzione di dissociazione delle cellule. Aspirare la piastra designata a intervalli di tempo definiti (cioè, 1, 2, 3, 5, 10 e 15 min) e poi lavare con 1 mL di soluzione PBS caldo tre volte.
- Tra i lavaggi, picchiettare delicatamente le piastre per staccare le cellule senza bloccare allegate.
- Aspirare eventuali restanti PBS e fissare le cellule restanti fissate alla piastra con 1 mL di formaldeide al 3,7% per 10 min.
- Macchia le cellule con 1 mL di cristalvioletto 0.05% per 30 minuti poi lavare in eccesso tintura con 1 mL di acqua deionizzata. Titolare di lavaggio per promuovere la visualizzazione della cella.
Nota: A seconda del livello di assorbimento della tintura, alcuni ulteriori lavaggi possono essere necessario promuovere la visualizzazione della cella. - Utilizzando un microscopio a 100 ingrandimenti, contare le cellule restanti allegate a ciascun pozzetto per ogni piatto.
Nota: Uso dei righelli trasparenti o marcatura guide bene penna sul lato inferiore della piastra contribuirà a evitare il conteggio ripetuto delle stesse cellule. - Determinare il numero medio di cellule per pozzetto per ogni piatto.
- Confrontare il tasso di distacco cellulare tra SW-13, SW-Neo e cellule SW-DDK3 tutto il periodo di tempo determinato con un test statistico di ANOVA a due vie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utilizzando le analisi di cui sopra, gli effetti dell'iperespressione di DKK3 sulla morfologia delle cellule estensione e proprietà di adesione delle cellule sono stati testati nella linea cellulare ACC stabilita SW-13, in vitro. Cellule che overexpressing DKK3 sono state generate da trasfezione stabile SW-13 celle con Myc-DDK taggati pCMV6-voce/DKK3 plasmide vettori e designato come SW-DKK3. Allo stesso modo, cellule trasfettate stabilmente con il vettore vuoto pCMV6-voce sono state create come un controllo di transfezione e passaggio e definite come SW-Neo. SW-13 celle sono state usate come controllo padre-cellule supplementari. Sovraespressione di DKK3 in SW-DKK3 è stata confermata mediante PCR quantitativa in tempo reale e Western blot tecniche8.
Brevemente, testate cellule SW-13, SW-Neo e SW-DKK3 sono state coltivate durante la notte a 6 pozzetti su vetrini coprioggetto. Le cellule erano quindi fissate con formaldeide e macchiate con la viola di cristallo. Caratteristiche di estensione delle cellule allora sono state quantificate in microscopia per i parametri descritti sopra. Sull'analisi, SW-DKK3 celle visualizzate un fenotipo differenziato notato da lobopodia aumentata e polarità cellulare multidirezionale (p = 0,01, One-way ANOVA, Figura 1 e Figura 2), indicativi di una mancanza di motilità direzionale. Al contrario, cellule parentali di SW-13 e SW-Neo mantenuto polarità e visualizzato maggiore filopodi disposti in un orientamento planare (p = 0,01, One-way ANOVA, Figura 1 e Figura 2)8.
Per determinare se lobopodia aumentata formazione modificato proprietà allegato delle cellule, abbiamo effettuato un'analisi di adesione delle cellule. In breve, le cellule sono state coltivate durante la notte e distacco cellulare è stato effettuato con soluzione di dissociazione non enzimatica delle cellule in fase di progressiva intervalli fino a 15 min. cellule erano poi fissato con formaldeide, macchiato con la viola di cristallo e contati usando una luce microscopio. SW-DKK3 cellule hanno mostrato un'affinità di attaccamento significativamente maggiore rispetto alle cellule SW-13 e SW-Neo (p < 0.01, 2-way ANOVA, Figura 3). Questi risultati indicano che DKK3 promuove la formazione lobopodia, che a sua volta promuove la cella allegato8.
Figura 1: espressione forzata di DKK3 altera le estensioni della membrana cellulare. SW-13 (A), SW-Neo (B)e SW-DKK3 (C) le cellule sono state coltivate su vetrini coprioggetti, fissate con formaldeide, macchiate con la viola di cristallo e imaged. Microfotografie sono effettuate utilizzando un microscopio ottico a 400 ingrandimenti. Cellule SW-13 e SW-Neo formano principalmente filopodi (frecce rosse) ed estensioni delle cellule di lamellipodi (arco blu). Al contrario, SW-DKK3 cellule formate più lobopodia (piccoli archi verdi), con quasi totale assenza di lamellipodi e pochissimi filopodi. Mentre le cellule di (B) SW-13 (A) e SW-Neo sembrano essere polarizzate (frecce arancioni) con filopodi all'avanguardia e lamellipodi al bordo in ritardo, SW-DKK3 cellule (C) ha mostrato lobopodia multidirezionale uniformemente distribuita. Gli esperimenti sono stati eseguiti in duplicato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: DKK3 promuove la formazione di lobopodia. La relativa rappresentazione di filopodi lobopodia e lamellipodi per cella per ogni tipo di cellula sono state calcolate tabulando estensioni delle cellule su singole celle. Cellule in venti microfotografie di casualmente presa campo microscopico delle viste (400 ingrandimenti) di SW-13, SW-Neo e SW-DKK sono state usate per la quantificazione. Barre di errore indicata la deviazione standard e (*) indica p < 0.01 utilizzando un one-way ANOVA che rappresenta un aumento significativo nel numero di lobopodia in cellule SW-DKK. Un totale di 20 celle sono stati esaminati per ogni tipo di cellula testata e gli esperimenti sono stati eseguiti in duplicato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: DKK promuove l'adesione cellulare. SW-13 centomila, SW-Neo e SW-DKK3 cellule per pozzetto di piastre da 6 pozzetti sono stata autorizzate a crescere durante la notte e siamo state trattate per il distacco di intervalli di tempo designato (asse x). Le cellule restanti allegati erano fissi, macchiate e contati e le percentuali delle cellule restanti allegati sono stati tracciati (asse y). Barre di errore indicano deviazione standard e (*) indica p < 0.01 e (*) indica p < 0,001 utilizzando un 2-way ANOVA che rappresenta un aumento significativo in SW-DKK cella forza allegato. Ogni esperimento iniziato con 100.000 cellule e gli esperimenti sono stati eseguiti in duplicato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Qui descriviamo un metodo quantitativo in vitro per caratterizzare le estensioni delle cellule con facilità, pochi pit-cade e riproducibilità affidabile che può essere applicato per diverse condizioni di test. Inoltre, semplice, quantificabili saggi di adesione e/o motilità possono essere eseguite simultaneamente per correlare il potenziale significato funzionale delle alterazioni osservate nelle estensioni della membrana cellulare.
Tuttavia, questi metodi possono presentare alcune limitazioni potenziali. In primo luogo, i criteri specificati qui di identificare diversi tipi di estensioni delle cellule sono basati sulla morfologia di cellule SW-13 corticosurrenale e quindi probabilmente bisogno di raffinatezza nella classificazione dei parametri quando applicato a altri tipi di cellule e/o condizioni sperimentali. Inoltre, negli esperimenti di corso di tempo prolungati, le influenze potenziali di membrana cellulare alterazioni di estensione sul ciclo cellulare e morte cellulare devono essere considerati.
In secondo luogo, il protocollo può affidarsi a potenziali individualizzato chiamando dall'esaminatore, che poteva limitare la riproducibilità del dosaggio a causa della variabilità inter-osservatore. L'elevato numero di cellule che vengono esaminati per ogni gruppo di test probabile sormonta parte di questa parzialità; in particolare, quando 20 celle vengono esaminate per ogni dosaggio. L'inclusione degli individui multipli per eseguire estensione chiamata in cieco è suggerito per attenuare i potenziali bias soggettivo chiamante.
Infine, si deve prestare attenzione quando associando i cambiamenti nella cella estensione switch di classe con alterazioni nelle proprietà di attaccamento, dove una versione semplificata di proprietà di adesione potrebbe essere il risultato di alterato preferenza per substrato allegato anziché l'alterata affinità per il substrato testato. Lo switch di classe extension cella di accoppiamento con migrazione o invasione nel contesto dei vari componenti della matrice extra-cellulare potrebbe chiarire le proprietà di adesione osservata.
In conclusione, il protocollo descritto qui fornisce un metodo semplice e affidabile per misurare il significato funzionale della membrana cellulare estensione interruttore sotto diverse condizioni di test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ohse Grant della Fondazione finanziato quest'opera.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
- Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management. Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).
- Veeck, J., Dahl, E. Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3. Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Jacquemet, G., et al. L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling. Nat Commun. 7, 13297 (2016).
- Machesky, L. M., Li, A. Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis. Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).
- Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells. J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).
- Korah, R., et al. Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma. Molecular cancer. 12, 87 (2013).
- Cheng, J. Y., et al. A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis. BMC cancer. 17 (1), 164 (2017).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Cliffe, A., et al. Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration. Nat Commun. 8, 14905 (2017).
